ברצוננו להודות לחברי ונקובר המכון חזותית Analytics (VIVA) להנפקה הערות ועצות עבור הפרויקט. בפרט, אנו רוצים להודות ג&#39;ון דיל, בריאן פישר, דוד Darvill. אנו רוצים גם להודות לחברי המעבדה קולמן על תמיכתם דיונים מועילים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכון הלאומי לבריאות גרנט N01 AI50023: NCE אלרגן מענקים 07-A1a ו 07-B2B, ואת מייקל סמית הקרן לחקר בריאות. TRK הוא נתמך בחלקו על ידי פרס קריירה בתחום המדע ביו מן המודעה קרן Wellcome בורוז על ידי מכוני קנדי ​​למענק מחקר בריאות הדרכה בתוכנית הקנדי לבריאות הילד המדען המטפל, בשיתוף עם ילדים חולים, קרן הילד והמשפחה מכון המחקר ( קולומביה הבריטית), נשים בריאות ילדים מחקר של המכון (אלברטה), ו מניטובה המכון לבריאות הילד.

1. חקירה מבוסס על ניתוח בתמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לך בסיס הנתונים ואתה רוצה לחקור את הקשרים השונים בין העמודות בתוך הנתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איור 1) ייבא את בסיס הנתונים על ידי לחיצה על &quot;התחבר נתונים&quot;. בחר את סוג נתוני המקור ובצע ההוראות כדי לייבא את בסיס הנתונים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איור 1) ודא מדף הממדים מכיל עמודות קטגורי בעוד מדף אמצעי מכיל עמודות המספרי של בסיס הנתונים שלך. לפעמים עמודה מימד כגון מזהה הנושא עשוי להיות רשום למדוד אם זה ממוספר. שינוי זה לממדים ידי לחיצה ימנית על אותו ובחר &quot;המרת מידות&quot;. באיור 1, עמודות הקטגורי של בסיס הנתונים, כגון רמת הגירוי ריכוז מזהים נושא ממוקמות כראוי מדף ממדים, הריכוז הנצפה של ציטוקינים ממוקמות כראוי מדף אמצעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איור 2) אם במהלך תהליך הניתוח, שדה מחושב יש צורך, פשוט לחץ לחיצה ימנית בשני ממדים או מדף אמצעי, ובחר &#39;צור שדה מחושב&#39;. קלט את החישוב בתיבה נוסחה עם שדות בשילוב עם פונקציות או פעולות מתמטיות. איור 2 מראה כיצד ליצור שדה חדש בשם PFD&gt; 2 על ידי צבירה PFD2, PFD3 ו PFD4 ערכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איור 3) ליצור עלילה 2-D ב בתמונה, בדרך כלל עם ממד לבין מידה של עניין. מאז ממשק מציעה אינטראקציה פשוטה של ​​גרירה ושחרור, הבחירה של הממד ולמדוד ניתן לשנות בקלות. מידות ממוקמות בדרך כלל על המדף שורות מדף עמודות, ואמצעים. באיור 3, את המדף הממדים מכיל ריכוז רמת הגירוי, ועל מדף אמצעי מכיל רמת הריכוז הנצפה של ציטוקינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איור 3) כדי לבדל את להדמיה של הממד מקום ספציפי, כי מימד תווית למדף, צבע טקסט או גודל, בהתאם לאופי של ממד. טקסט מדף מנסה לבדל נתונים להדמיה באמצעות תיוג אותם עם מידע טקסטואלי מסופק על ידי מימד שנבחר. מדף צבע וגודל באופן אוטומטי להבדיל נתונים לפי צבע וגודל, אשר יכול להיות מותאם עם פס הגלילה ממוקם בתחתית כל מדף. באיור 3, הצבת גנוטיפ על המדף צבע מוביל הפרדה של שלושה גנוטיפים על ידי צבעים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איור 3) סינון ראיה על ידי המשתנים עמודה ספציפית במימד אחר. ניתן לעשות זאת על ידי גרירת תווית מימד לתוך המדף הסינון. יופיע חלון עם רשימת ערכים לבחירה. הערך הנבחר יהיה ערכים בלבד שנותרו להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איור 4) ניתן לשלב להדמיה עם מימד אחר או למדוד לייצר מטריצה ​​של ויזואליזציה. ניתן לעשות זאת על ידי הטלת ממדים מרובים מדף עמודות, ואמצעים מרובים מדף שורות. איור 4 מכיל דוגמה של שתי עמודות מטריצה ​​להדמיה ידי הצבת שני ממדים שונים מדף העמודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר הדמיית דומה, קליק ימני על הגיליון הנוכחי על הפינה השמאלית התחתונה, נבחרת &quot;סדין כפול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזר את תהליך ניתוח כדי לזהות מגמות מעניינות או חריגים שעשויים לסייע לך ליצור השערה חדשה על הנתונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לך מרובים במערך שנוצר מאותו מקור, והוא רוצה לחקור את הקשר האפשרי בין מערכי נתונים אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מערכי נתונים מרובים ממקור זהה, כלומר מקום two גליונות לחוברת זאת, כדי לאפשר בתמונה להתחבר מערך נתונים אלה באמצעות אותו חיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איור 5) חבר את מערכי נתונים דרך להצטרף הלוגי של ערכי המפתח, לוודא את הממדים זהים עבור מערכי נתונים מרובים נבחרו. באיור 5, ישנם חמישה ערכי המפתח להצטרפות: מזהה סוג התא, ריכוז רמת הגירוי, שלב או קבוצה, גירוי, ובכפוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח דומה סעיף 1.1. </li></ol></li></ol> 2. מצגת המבוססת על צרכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה יודע את יחסי הגומלין בין הנתונים, אבל אתה רוצה להיות מסוגל ליצור במהירות רשימה של פריטים חזותיים לשימוש במצגת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקבו פרוטוקול המפורטים בסעיף 1.1, ו - ביאורים חזותיים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקציה היצוא בתמונה כדי להפיק תמונות של חזותיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתה יצרו סט של חזותיים חזקים בחוברת בתמונה ורוצים לחלוק את חוברת העבודה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את חוברת העבודה כחוברת עבודה בתמונה ארוז לשתף קובץ זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמיתים ללא לשולחן בתמונה יכול להוריד Reader בתמונה כדי לפתוח את חוברת העבודה ארוזים. Reader בתמונה מאפשר עמיתיך אינטראקציה עם חזותיים שיצרת. </li></ol></li></ol> 3. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מסךשל המחזה לאחר ייבוא ​​גיליון אלקטרוני בשם NFKBIA מן demo.xls קובץ Excel. מידות ומדפים האמצעים היו מאוכלסים כיאות עם הנתונים קטגורי ו המספרי, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. החלון שדה מחושב מופעלת כדי ליצור שדה מחושב מיוחד להשתמש בתמונה. הרשימה על התיבה השמאלית התחתונה מסייעת לזהות תחומים אפשריים, ואת הרשימה בצד הימני מכיל קיצור של פונקציות כי ניתן להשתמש בנוסחה. בדוגמה זו, רצינו להוסיף את הערכים עבור PFD4, PFD3 ו PFD2 כדי לקבל את הערך הסופי שאנו מכנים PFD&gt; 2 <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. ויזואליזציה של רמת הגירוי ריכוז לעומת ריכוז ציטוקינים ציין. הדמיית מראה העלילה של רמות ריכוז שונים של הגירוי 3M-002 נגד הריכוז הנצפה של ציטוקינים TNF-α. הצבעים של הקווים עיין גנוטיפים שונים של פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד בגן NFKBIA של המשתתפים במחקר החיסון המולדת שלנו. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. צילום מסך של מטריקס שתי עמודות להדמיה. אנחנו שנוצר מטריצה ​​שתי עמודות כדי לאפשר השוואה Side-by-הצד של תגובות לשני גירויים, 3M-003 ו LPS. X-צירים הן רמות ריכוז שונה של שני גירויים, ואת ציר y מגרשים את ערכי השדה מחושב, PFD&gt; 2. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. אלה דיאלוג חלונות בתמונה להמחיש כיצד לחבר את הנתונים שנרשמו אלקטרוניים שונים. חיבור נתונים מגליונות אלקטרוניים שונים ניתן להשיג על ידי שילוב של אלה באמצעות הגיוני להצטרף סעיפים של ערכי המפתח. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="10"> ויזואליזציה ו כלי ניתוח </td></tr><tr><td> פונקציה </td><td> תמונה חיה </td><td> VIS חותמת </td><td> xmdvtool </td><td> GGobi </td><td> Starlight </td><td> Gapminder </td><td> Visulab </td><td> InfoVis Toolkit </td><td> Geotime </td><td> לעורר </td></tr><tr><td> במקביל לתאם מגרשים </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td></tr><tr><td> העלילה פיזור מטריצות </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td></tr><tr><td> צמצום מימדי </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td></tr><tr><td> Temporal ממדים </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td></tr><tr><td> Geospatial ממדים </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> לא </td></tr><tr><td> כריית טקסט </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td></tr><tr><td> מניפולציה ישירה של נתונים </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> לא </td></tr><tr><td> סינון </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td></tr><tr><td> הרחבה על פלטפורמות אחרות (למשל, R) </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td></tr><tr><td> CSV תבניות טבלה </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td></tr><tr><td> נתוני XML פורמטים </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> לא </td></tr><tr><td> יכול להתמודד עם 10,000 שורות + </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td></tr><tr><td> תיעוד </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td><td> כן </td></tr><tr><td> מוצר מסחרי </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> לא </td><td> לא </td><td> לא </td><td> כן </td><td> כן </td></tr></tbody></table> 1. טבלת רשימת חזותיים כלים אנליטיקה חלק מהתכונות שלהן.

<ol>
	<li>Thomas, J., Cook, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Path:+The+Research+and+Development+Agenda+for+Visual+Analytics.">Illuminating the Path: The Research and Development Agenda for Visual Analytics.</a> , (2005).</li><li>Steed, C., Swan, J., Jankun-Kelly, T., Fitzpatrick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+Analysis+of+Hurricane+Trends+Using+Statistical+Processes+Integrated+with+Interactive+Parallel+Coordinates.">Guided Analysis of Hurricane Trends Using Statistical Processes Integrated with Interactive Parallel Coordinates.</a> IEEE Symposium on Visual Analytics Science and Technology. , 19-26 (2009).</li><li>Saraiya, P., North, C., Lam, V., Duca, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Insight-Based+Longitudinal+Study+of+Visual+Analytics.">An Insight-Based Longitudinal Study of Visual Analytics.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 12, 1511-1522 (2006).</li><li>Kollmann, T. R., Crabtree, J., Rein-Weston, A., Blimkie, D., Thommai, F., Wang, X. Y., Lavoie, P. M., Furlong, J., Fortuno, E. S., Hajjar, A. M., Hawkins, N. R., Self, S. G., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+innate+TLR-mediated+responses+are+distinct+from+those+of+adults.">Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults.</a> J. Immunol. 183, 7150-7160 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הופעת הטכנולוגיה תפוקה גבוהה במחקר ביו המודרנית הובילה לפיצוץ של נתוני מחקר הדורש דרך יעילה יותר של ניתוח. ניתוח חזותי (VA) היא מדע חשיבה אנליטית בהנחייתם של ממשקים ויזואליים אינטראקטיביים (1). הגישה VA משחזר את כוח אנליטי בידי האנליסט אדם, בניגוד לגישה המסורתית כדי לזה?...

facilitating the analysis of immunological data with visual analytic techniques

ניתוח חזותי (VA) התפתחה בדרך חדשה לניתוח במערך גדול באמצעות תצוגה ויזואלית אינטראקטיבית. אנחנו הדגימו את התועלת ואת הגמישות של גישה VA בניתוח מערכי נתונים ביולוגיים. דוגמאות של מערכי נתונים אלה כוללים באימונולוגיה cytometry זרימה, נתונים Luminex ו genotyping (למשל, פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד) הנתונים. בניגוד לגישה המסורתית מידע חזותי, VA משחזר את כוח ניתוח בידי האנליסט בכך שהוא מאפשר למטפל לעסוק בתהליך נתונים בזמן אמת חקירה. בחרנו את התוכנה VA נקרא המחזה לאחר הערכת הכלים VA ​​מספר. שני סוגים של משימות ניתוח ניתוח בתוך ובין מערכי נתונים היו הפגינו במצגת וידאו באמצעות גישה המכונה ניתוח לזווג. ניתוח מותאמים, כהגדרתו VA, היא גישה לניתוח שבו מומחה כלי VA עובד Side-by-הצד עם מומחה תחום במהלך הניתוח. מומחה תחום הוא זה שמבין את המשמעות של הנתונים, ושואלת את השאלות הנתונים שנאספו אולי הכתובת. מומחה כלי מכן יוצר חזותיים כדי לעזור למצוא דפוסים בנתונים שעשויים לענות על השאלות האלה. זמן קצר בפיגור בין הדור השערה ואת התצוגה החזותית מהירה של נתונים היא היתרון העיקרי של גישה VA.

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques at JoVE.com

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

ניתוח חזותי (VA) היא גישה חדשה לניתוח נתונים באופן אינטראקטיבי. בסרטון הזה, אנו דנים את הבעיה עומס הנתונים שהובאו על ידי תפוקה גבוהה ניסויים ביולוגיים, ולהציע VA כפתרון לבעיה כזו. הסרטון מדגים ניתוח בתוך ובין מערכי נתונים החיסונית באמצעות כלי VA נקרא המחזה.

להקל על ניתוח נתונים החיסוני עם טכניקות Analytic חזותית

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

facilitating-analysis-immunological-data-with-visual-analytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Views.  University of British Columbia. ניתוח חזותי (VA) היא גישה חדשה לניתוח נתונים באופן אינטראקטיבי. בסרטון הזה, אנו דנים את הבעיה עומס הנתונים שהובאו על ידי תפוקה גבוהה ניסויים ביולוגיים, ולהציע VA כפתרון לבעיה כזו. הסרטון מדגים ניתוח בתוך ובין מערכי נתונים החיסונית באמצעות כלי VA נקרא המחזה.

Video: Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically explore characteristics of their cellular samples. However, these technological advancements yield high-dimensional data sets that have become increasingly difficult to analyze objectively within traditional manual-based gating programs. In order to better analyze and present data, scientists partner with bioinformaticians with expertise in analyzing high-dimensional data to parse their flow cytometry data. While these methods have been shown to be highly valuable in studying flow cytometry, they have yet to be incorporated in a straightforward and easy-to-use package for scientists who lack computational or programming expertise. To address this need, we have developed ExCYT, a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that streamlines the analysis of high-dimensional flow cytometry data by implementing commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction by t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots. Additionally, ExCYT provides traditional gating options of select populations of interest for further t-SNE and clustering analysis as well as the ability to apply gates directly on t-SNE plots. The software provides the additional advantage of working with either compensated or uncompensated FCS files. In the event that post-acquisition compensation is required, the user can choose to provide the program a directory of single stains and an unstained sample. The program detects positive events in all channels and uses this select data to more objectively calculate the compensation matrix. In summary, ExCYT provides a comprehensive analysis pipeline to take flow cytometry data in the form of FCS files and allow any individual, regardless of computational training, to use the latest algorithmic approaches in understanding their data.

ExCYT is a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that allows users to analyze their flow cytometry data via commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction via t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots.

ExCYT: ממשק משתמש גרפי עבור התייעלות ניתוח של נתוני Cytometry גבוהה-ממדי

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic הריגה הנועד להעריך תגובות אימונולוגי נגד פתוגנים חיידקיים

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...