우리는 프로젝트에 대한 의견과 조언을 제공을위한 비주얼 분석 (VIVA)의 밴쿠버 연구소의 구성원을 감사드립니다. 특히, 우리는 존 딜, 브라이언 피셔, 데이비드 다빌 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 그들의 지원과 도움이 토론에 대한 Kollmann 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 국립 알레르기 연구소 전염성 질환, 건강 그랜트 N01 AI50023 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원되었다; 알레르기 항원의 제정신의 보조금 07 - A1A 및 07 - B2B 및 건강 연구에 대한 마이클 스미스 재단. TRK는 식 - 어린이 재단, 어린이 가정 연구소와 협력 캐나다 어린이 보건 임상 과학 프로그램의 보건 연구 교육 그랜트를 위해 캐나다의 연구소에 의해 버로우즈 웰컴 펀드 광고에서 의생명 과학의 경력 수상 (에 의해 일부 지원 브리티시 컬럼비아), 여성과 어린이 건강 연구소 (앨버타) 및 아동 보건 연구소 마니토바.

1. 테이블오을 탐험 기반 분석 <ol><li> 당신은 데이터 세트를 당신은 데이터 내의 열 사이의 다양한 관계를 탐험 싶어요. <ol><li> (그림 1) &#39;데이터에 연결&#39;을 클릭하여 DataSet을 가져옵니다. 데이터 원본 유형을 선택하고 데이터 집합을 가져올 지침을 따르십시오. </li><li> (그림 1) 측정 선반은 DataSet에서 숫자 컬럼을 포함하는 동안 크기의 선반이 범주에 속하는 열이 포함되어 있는지 확인합니다. 가 numerated있다면 가끔은 그런 주제 식별자로 차원 칼럼은 조치로 나타날 수 있습니다. 그것에 마우스 오른쪽 클릭하여 크기로 변경하고 &#39;차원 변환&#39;을 선택합니다. 그림 1에서와 같은 자극 농도 수준과 주제 식별자로 DataSet에서 무조건적인 열이 제대로 차원의 선반에 배치하고 있으며, 크린 시토킨의 관찰된 농도가 제대로 측정 선반에 배치됩니다. </li><li> (그림 2) 분석 과정, 계산 필드가 필요한 경우, 단순히 오른쪽 크기 또는 측정 선반 중 하나를 클릭하고 &#39;계산 필드 만들기&#39;를 선택합니다. 기능이나 수학 연산과 결합 필드의 수식 상자에서 계산 입력. 그림 2는 PFD2, PFD3 및 PFD4 가치를 통합하여&gt; 2 PFD라는 새로운 분야를 만드는 방법을 보여줍니다. </li><li> (그림 3) 차원과 관심의 척도로 일반적으로 테이블오에서 2 - D 음모를 생성합니다. 인터페이스가 간단한 드래그 앤 드롭 상호 작용을 제공하므로, 치수 및 측정의 선택을 쉽게 변경할 수 있습니다. 크기는 일반적으로 행 선반의 열 선반, 그리고 대책에 배치됩니다. 그림 3에서 치수 선반 자극 농도 수준을 포함​​하고 측정 선반 크린 시토킨의 관찰 농도 수준을 포함​​하고 있습니다. </li><li> (그림 3) 특정 차원, 장소에 의해 시각화를 차별하는 차원의 특성에 따라 텍스트, 색상 또는 크기 선반의 치수 라벨. 텍스트 선반은 선택된 차원에서 제공하는 텍스트 정보를 라벨로 시각화 데이터를 차별화하려고 시도합니다. 색상과 크기 선반이 자동으로 각 선반의 하단에있는 스크롤 막대로 조절할 수있는 색상과 크기에 따라 데이터를 구분합니다. 그림 3에, 컬러 선반의 유전자형을 배치하는 것은 서로 다른 색상의 세 genotypes의 분리에 이르게한다. </li><li> (그림 3)은 다른 차원에서 특정 열 변수를 사용하여 시각화를 필터링합니다. 이것은 필터를 선반에 치수 라벨을 드래그하여 수행할 수 있습니다. 창이 선택할 수있는 값 목록과 함께 나타납니다. 선택한 값을 시각화에 남아있는 유일한 값이됩니다. </li><li> (그림 4) 다른 차원과 시각화를 결합하거나 시각화의 행렬을 생성하는 측정 수 있습니다. 이것은 열 선반에 여러 차원을 포기하고, 행 선반에 여러 조치를 할 수 있습니다. 그림 4는 열 선반에 두 개의 서로 다른 차원을 배치하여 두 열 시각화 매트릭스의 예제가 포함되어 있습니다. </li><li> 비슷한 시각화를 생성하려면, 오른쪽 하단 왼쪽 모서리에있는 현재 시트를 클릭하고, &#39;중복 시트&#39;를 선택. </li><li> 당신이 데이터에 대해 새로운 가설을 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다 흥미 동향 또는 outliers을 확인하기 위해 분석 과정을 반복합니다. </li></ol></li><li> 당신은 동일한 소스에서 생성된 여러 개의 데이터 세트를 가지고 있고, 이러한 데이터 세트 사이 가능한 연결을 탐험 싶어요. <ol><li> 테이블오가 동일한 연결을 통해이 데이터 집합에 연결할 수 있도록, 같은 통합 문서에 같은 소스, 즉 두 개 스프레드 시트에 여러 개의 데이터 세트를 배치합니다. </li><li> (그림 5) 다중 데이터 세트에 대해 동일한 크기가 선택되었는지 확인하고, 핵심 가치를 논리적으로 가입을 통해 데이터 세트를 연결합니다. 그림 5에서 가입을위한 5 가지 주요 가치가 없습니다 : 셀 유형, 자극 농도 수준, 단계 또는 그룹, 자극, 그리고 주제 식별자입니다. </li><li> 섹션 1.1와 유사한 분석을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 프레 젠 테이션 기반 요구 <ol><li> 당신은 데이터 간의 관계를 알아,하지만 당신은 신속하게 프레 젠 테이션에 사용하기 위해 시각화의 목록을 생성할 수있게되고 싶어요. <ol><li> 섹션 1.1에 명시된 프로토콜을 따라하고, 그에 따라 시각화를 주석. </li><li> 시각화의 이미지를 생산하는 테이블오의 수출 기능을 사용하십시오. </li></ol></li><li> 당신은 테이블오 통합 문서에서 강력한 시각화의 집합을 생성하고 통합 문서를 공유하고자합니다. <ol><li> 테이블오 포장 통합 문서로 통합 문서를 저장하고이 파일을 공유할 수 있습니다. </li><li> 테이블오 데스크탑없이 동료 패키지 통합 문서를 엽니다 테이블오 리더를 다운로드하실 수 있습니다. 테이블오 리더는 동료가 만든 시각화와 상호 작용 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 스크린샷엑셀 파일 demo.xls에서 NFKBIA라는 스프레드 시트를 가져온 후 테이블오니다. 치수 및 측정 선반 제대로 각각 여지없이 및 수치 데이터로 채워집했다. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 계산 필드 창이 테이블오에서 사용할 수있는 특별한 계산 필드를 만들 호출됩니다. 하단의 왼쪽 상자에있는 목록은 식별 가능한 필드를하는 데 도움이, 그리고 오른쪽에있는 목록이 수식에서 사용할 수있는 함수의 약어를 포함하고 있습니다. 이 예제에서, 우리는 PFD&gt; 2로 참조하는 최종 가치를 얻기 위해 PFD4, PFD3 및 PFD2에 대한 값을 추가하려고 <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 자극 농도 수준 비교 관찰 시토킨 농도의 시각화. 시각화는 시토킨 TNF - α의 농도 관찰에 대한 자극 3M - 002의 서로 다른 농도 수준의 음모를 보여줍니다. 라인의 색상은 우리의 타고난 면역 연구에 개인의 NFKBIA 유전자의 단일 염기 다형성에 대한 다른 genotypes를 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 두 열 시각화 모체의 스크린샷. 우리는 두 자극, 3M - 003 및 LPS에 반응 나란히 비교를 용이하게하기 위해 두 개의 열 매트릭스를 생성. X - 축 두 자극의 다른 농도 수준 및 Y 축 플롯 계산 필드 (Calculated Field)의 값을, PFD&gt; 2입니다. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 이러한 테이블오 대화 창이 다른 스프레드 시트에 기록된 데이터를 연결하는 방법을 보여줍니다. 다른 스프레드 시트에서 연결 데이터는 키 값을 사용하여 이러한 논리 가입 조항을 결합하여 수행할 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="10"> 시각화 및 분석 도구 </td></tr><tr><td> 기능 </td><td> 테이블오 </td><td> VIS - 스탬프 </td><td> xmdvtool </td><td> GGobi </td><td> 별빛 </td><td> Gapminder </td><td> Visulab </td><td> InfoVis 툴킷 </td><td> Geotime </td><td> 영감 </td></tr><tr><td> 병렬 음모를 조정 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> 스캐터 플롯 매트릭스 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> 차원 감소 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> 시간적 차원 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> 지리 크기 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> 텍스트 마이닝 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 데이터를 직접 조작 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> 필터링 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 다른 플랫폼으로 확장 (예를 들어, R) </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> CSV 테이블 형식 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> XML 데이터 형식 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> 1 대처할 수0000 + 행 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 문서 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td><td> 예 </td></tr><tr><td> 상용 제품 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 아니 </td><td> 예 </td><td> 예 </td></tr></tbody></table> 시각적 분석 도구와 기능 중 일부 표 1. 목록.

<ol>
	<li>Thomas, J., Cook, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Path:+The+Research+and+Development+Agenda+for+Visual+Analytics.">Illuminating the Path: The Research and Development Agenda for Visual Analytics.</a> , (2005).</li><li>Steed, C., Swan, J., Jankun-Kelly, T., Fitzpatrick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+Analysis+of+Hurricane+Trends+Using+Statistical+Processes+Integrated+with+Interactive+Parallel+Coordinates.">Guided Analysis of Hurricane Trends Using Statistical Processes Integrated with Interactive Parallel Coordinates.</a> IEEE Symposium on Visual Analytics Science and Technology. , 19-26 (2009).</li><li>Saraiya, P., North, C., Lam, V., Duca, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Insight-Based+Longitudinal+Study+of+Visual+Analytics.">An Insight-Based Longitudinal Study of Visual Analytics.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 12, 1511-1522 (2006).</li><li>Kollmann, T. R., Crabtree, J., Rein-Weston, A., Blimkie, D., Thommai, F., Wang, X. Y., Lavoie, P. M., Furlong, J., Fortuno, E. S., Hajjar, A. M., Hawkins, N. R., Self, S. G., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+innate+TLR-mediated+responses+are+distinct+from+those+of+adults.">Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults.</a> J. Immunol. 183, 7150-7160 (2009).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

현대 생물 의학 연구에 높은 처리량 기술의 출현은 분석보다 효율적인 방법을 필요로 연구 데이터의 폭발되었다. 영상 분석 (VA)는 인터랙티브 비주얼 인터페이스 (1)에 의해 촉진 분석 추론의 과학이다. VA 방식은 컴퓨터에 의해 패턴을 감지하는 전통적인 접근에 반하는 인간 분석의 손에있는 분석 능력을 복원합니다. 영상 분석은 이러한 국방 연구 (1) 허리케인 동향 (2) 등 다양한 분야의 연구에 ?...

facilitating the analysis of immunological data with visual analytic techniques

영상 분석 (VA)는 인터랙티브 영상 디스플레이를 통해 대형 데이터 세트를 분석하는 새로운 방법으로 떠오르고있다. 우리는 유틸리티 및 생물 학적 데이터 세트의 분석에 VA 방식의 유연성을 보여주었다. 면역학에서 이러한 데이터 세트의 예는 유동세포계측법, Luminex 데이터, genotyping (예 : 단일 염기 다형성) 데이터를 포함합니다. 전통적인 정보 시각화 방식과는 반대로, VA는 분석이 실시간 데이터 탐사 과정에 참여할 수 있도록함으로써 애널리스트의 손에 분석 능력을 복원합니다. 우리는 몇 가지 VA 도구를 평가 후 테이블오라는 VA 소프트웨어를 선택했습니다. 분석 작업 집합 내의 사이 분석의 두 가지 유형의 접근 이점 분석라는 사용하여 비디오 프레 젠 테이션에서 시연했다. 로 VA에 정의된 결합하여 분석, VA 도구 전문가는 분석 도중에 도메인 전문가와 함께 나란히 작동하는 분석 방법입니다. 도메인 전문가는 데이터의 중요성을 이해하고, 수집된 데이터가 주소에있는 것 같은 그런 질문을 한 것입니다. 도구 전문가 그런 다음 질문에 대답 수있는 데이터의 패턴을 찾을 수 있도록 시각화를 생성합니다. 가설 생성 및 데이터의 빠른 영상 표시 사이의 짧은 지연 시간은 VA 방식의 큰 장점입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques at JoVE.com

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

영상 분석 (VA)는 대화식으로 데이터를 분석하는 새로운 접근 방식입니다. 이 비디오에서는, 우리는 높은 처리량 생물학 실험에 의해 가져온 데이터 과부하 문제를 논의하고, 그러한 문제에 대한 솔루션으로 VA를 만나볼 수 있습니다. 비디오 이내에 테이블오라는 VA 도구를 사용하여 면역 데이터 세트 사이의 분석을 보여줍니다.

비주얼 분석 기법과 면역 데이터 분석을 촉진

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

facilitating-analysis-immunological-data-with-visual-analytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K 조회수.  University of British Columbia. 영상 분석 (VA)는 대화식으로 데이터를 분석하는 새로운 접근 방식입니다. 이 비디오에서는, 우리는 높은 처리량 생물학 실험에 의해 가져온 데이터 과부하 문제를 논의하고, 그러한 문제에 대한 솔루션으로 VA를 만나볼 수 있습니다. 비디오 이내에 테이블오라는 VA 도구를 사용하여 면역 데이터 세트 사이의 분석을 보여줍니다.

비디오: Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

촉진 약물 디스커버리 : Zebrafish의 자동화된 하이 컨텐츠 염증 분석

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

이중 색깔 시간 게이트 자극 방출 고갈 (STED) Nanoscopy에 의한 면역 시냅스의 시각화

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

이미징 면역 시냅스 역학에 대한 내피 평면 셀 모델

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically explore characteristics of their cellular samples. However, these technological advancements yield high-dimensional data sets that have become increasingly difficult to analyze objectively within traditional manual-based gating programs. In order to better analyze and present data, scientists partner with bioinformaticians with expertise in analyzing high-dimensional data to parse their flow cytometry data. While these methods have been shown to be highly valuable in studying flow cytometry, they have yet to be incorporated in a straightforward and easy-to-use package for scientists who lack computational or programming expertise. To address this need, we have developed ExCYT, a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that streamlines the analysis of high-dimensional flow cytometry data by implementing commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction by t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots. Additionally, ExCYT provides traditional gating options of select populations of interest for further t-SNE and clustering analysis as well as the ability to apply gates directly on t-SNE plots. The software provides the additional advantage of working with either compensated or uncompensated FCS files. In the event that post-acquisition compensation is required, the user can choose to provide the program a directory of single stains and an unstained sample. The program detects positive events in all channels and uses this select data to more objectively calculate the compensation matrix. In summary, ExCYT provides a comprehensive analysis pipeline to take flow cytometry data in the form of FCS files and allow any individual, regardless of computational training, to use the latest algorithmic approaches in understanding their data.

ExCYT is a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that allows users to analyze their flow cytometry data via commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction via t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots.

ExCYT: 높은 차원 Cytometry 데이터의 분석을 합리화 하기 위한 그래픽 사용자 인터페이스

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

마우스 종아리에 일관된 마사지와 같은 섭동을 적용하고 근육 내 압력 변화를 모니터링

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

인간 면역학적 시냅스 이미징

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Methods Article

비주얼 분석 기법과 면역 데이터 분석을 촉진