نود أن نشكر أعضاء معهد فانكوفر التحليلات البصرية (فيفا) لتقديم التعليقات والمشورة للمشروع. على وجه الخصوص ، نود أن نشكر جون الشبت ، برايان فيشر ، وDarvill ديفيد. نود أيضا أن نشكر أعضاء المختبر Kollmann لما قدموه من دعم ومناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل في جزء من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية ، المعهد الوطني للصحة منح N01 AI50023 ؛ المنح NCE حساسية A1A 07 - 07 وB2B ؛ ومايكل سميث مؤسسة للبحوث الصحية. ويدعم TRK جزئيا على جائزة شهادة في العلوم الطبية الحيوية من إعلان صندوق بوروز ويلكوم من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة الكندية منح تدريبية في برنامج الصحة عالم الطفل الطبيب ، في شراكة مع أطفال المرضى ، مؤسسة الطفل والأسرة معهد بحوث ( كولومبيا البريطانية) ، والمرأة والطفل الصحة معهد بحوث (البرتا) ، ومانيتوبا معهد صحة الطفل.

1. استكشاف يستند التحليل على تابلوه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لديك مجموعة البيانات وترغب في استكشاف العلاقات المختلفة بين الأعمدة داخل البيانات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الشكل 1) استيراد ورقة العمل من خلال النقر على &quot;اتصال بيانات&quot;. اختيار نوع مصدر البيانات واتباع التعليمات لاستيراد مجموعة البيانات الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الشكل 1) تأكد من أن يحتوي على أعمدة الجرف أبعاد القاطع في حين جرف التدابير يحتوي على أعمدة من مجموعة البيانات الرقمية الخاصة بك. أحيانا قد يتم سرد عمود البعد مثل معرف الموضوع ، كما في حالة قياس محصاة عليه. تغييره إلى أبعاد بالنقر بزر الفأرة الأيمن عليه واختر &quot;تحويل إلى البعد&quot;. في الشكل 1 ، يتم وضعها بشكل صحيح أعمدة القاطع من ورقة العمل مثل مستوى تركيز التحفيز ومعرفات الموضوع في الجرف الأبعاد ، ويتم وضعها بشكل صحيح لوحظ تركيز من السيتوكينات في الجرف التدابير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الشكل 2) إذا كان أثناء عملية التحليل ، لا بد من حقل محسوب ، ببساطة انقر على الحق في أي أبعاد أو الجرف التدابير ، وحدد &quot;إنشاء حقل محتسب. مدخلات العملية الحسابية في خانة الصيغة مع الحقول جنبا إلى جنب مع المهام أو العمليات الحسابية. الشكل 2 يوضح كيفية إنشاء حقل جديد يسمى PFD&gt; 2 بتجميع PFD2 ، PFD3 والقيم PFD4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الشكل 3) انتج مؤامرة 2 - D في تابلوه ، وعادة مع البعد وعلى قدر من الفائدة. منذ واجهة بسيطة تقدم السحب والإفلات التفاعل ، يمكن اختيار وقياس البعد تغييرها بسهولة. عادة ما يتم وضعها في الرف أبعاد الأعمدة ، والتدابير في الجرف الصفوف. في الشكل 3 ، ويحتوي على الرف أبعاد التحفيز مستوى التركيز ، والجرف يحتوي على تدابير لاحظ مستوى تركيز السيتوكينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الشكل 3) إلى التفريق بين التصور من خلال البعد محددة ، والمكان الذي تسمية البعد في الجرف النص أو اللون أو الحجم ، اعتمادا على طبيعة البعد. الجرف النص محاولات التفريق البيانات في التصور وذلك عبر تسمية لهم المعلومات النصية التي قدمتها البعد المحدد. وسوف اللون والحجم الجرف تفرق البيانات تلقائيا حسب اللون والحجم ، والتي يمكن تعديلها مع شريط التمرير الموجود في أسفل كل رف. في الشكل 3 ، واضعا في الجرف اللون الوراثي يؤدي إلى فصل من ثلاثة المورثات بواسطة ألوان متميزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الشكل 3) تصفية التصور من متغيرات معينة في العمود البعد الآخر. يمكن القيام بذلك عن طريق سحب التسمية البعد في الجرف التصفية. سوف تظهر نافذة مع قائمة من القيم للاختيار من بينها. وسوف يتم تحديد قيمة القيم الوحيدة المتبقية في التصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الشكل 4) يجوز لك الجمع بين التصور مع البعد الآخر أو تدبير لإنتاج مصفوفة من التصور. ويمكن القيام بذلك عن طريق اسقاط أبعاد متعددة في الجرف الأعمدة ، واتخاذ تدابير متعددة في الجرف الصفوف. ويتضمن الشكل 4 مثالا على عمودين من خلال وضع تصور مصفوفة بعدين مختلفين في الجرف الأعمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنتاج لوضع تصور مماثل ، انقر على الحق في الورقة الحالية من ناحية الزاوية السفلى اليسرى ، واختيار &quot;ورقة مكررة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية تحليل لتحديد اتجاهات مثيرة للاهتمام أو القيم المتطرفة التي قد تساعدك على توليد فرضية جديدة حول البيانات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لديك مجموعة بيانات متعددة ولدت من نفس المصدر ، وترغب في استكشاف احتمال وجود صلة بين هذه المجموعات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قواعد البيانات متعددة في نفس المصدر ، أي مكان اثنين جداول البيانات في نفس المصنف ، للسماح للاتصال تابلوه هذه مجموعة البيانات من خلال الاتصال نفسه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشكل (5) الاتصال من خلال انضمام مجموعات البيانات المنطقية من القيم الأساسية ، والتأكد من أن يتم تحديد الأبعاد التي هي نفسها بالنسبة للمجموعات البيانات متعددة. في الشكل (5) ، وهناك خمسة القيم الأساسية للانضمام : نوع من الخلايا ، التحفيز مستوى التركيز ، ومرحلة أو مجموعة ، التحفيز ، وتخضع المعرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تحليل مماثل للقسم 1.1. </li></ol></li></ol> 2. العرض القائم على الاحتياجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كنت تعرف العلاقات بين البيانات ، ولكن أردت أن تكون قادرة على توليد بسرعة لائحة تصورات لاستخدامها في العرض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متابعة بروتوكول المبينة في القسم 1.1 ، وتعليم والمرئيات وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام وظيفة التصدير في تابلوه لإنتاج صور من تصورات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كنت قد ولدت مجموعة من المرئيات القوية في المصنف تابلوه وتريد حصة هذا المصنف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ المصنف ك مصنف حزم تابلوه وحصة هذا الملف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن لزملاء العمل دون سطح اللوحة تنزيل قارئ تابلوه لفتح المصنف تعبئتها. قارئ اللوحة يسمح زملائك على التفاعل مع تصورات التي قمت بإنشائها. </li></ol></li></ol> 3. الممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. لقطةلوحة بعد استيراد جدول اسمه NFKBIA من demo.xls ملف Excel. وكانت مأهولة بالسكان بشكل صحيح أبعاد والرفوف التدابير مع البيانات الفئوية والعددية ، على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تم استدعاء إطار حقل محتسب لإنشاء حقل محسوب خاصة لاستخدامها في اللوحة. القائمة على المربع الأيسر السفلي يساعد على تحديد المجالات الممكنة ، والقائمة على الجانب الأيمن يحتوي على الاختصار من الوظائف التي يمكن استخدامها في الصيغة. في هذا المثال ، أردنا إضافة قيم PFD3 ، وPFD4 PFD2 للحصول على القيمة النهائية التي نشير إليها ك 2&gt; PFD <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. التصور من مستوى تركيز الحوافز مقابل وحظ تركيز خلوى. التصور يبين مؤامرة من مستويات تركيز مختلفة من التحفيز 3M - 002 ضد لوحظ من تركيز خلوى TNF - α. ألوان خطوط الرجوع إلى المورثات مختلفة لتعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد في الجين NFKBIA من الأفراد في دراستنا المناعة الفطرية. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. لقطة لمصفوفة التصور عمودين. ولدت لدينا مصفوفة عمودين لتسهيل المقارنة جنبا إلى جنب من الاستجابات لاثنين من المحفزات ، 3M - 003 وLPS. في العاشر من محاور هي مستويات تركيز مختلفة من المحفزات اثنين ، والمؤامرات محور y قيم الحقل المحسوب ، PFD&gt; 2. <img src="/files/ftp_upload/2397/2397fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. هذه النوافذ الحوار وحة توضح كيفية توصيل البيانات المسجلة في جداول مختلفة. ويمكن تحقيق ربط البيانات من جداول مختلفة عن طريق الجمع بين هذه البنود باستخدام المنطقي الانضمام للقيم الأساسية. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="10"> التصور والتحليل أداة </td></tr><tr><td> وظيفة </td><td> اللوح </td><td> VIS - STAMP </td><td> xmdvtool </td><td> GGobi </td><td> مضاء بالنجوم </td><td> Gapminder </td><td> Visulab </td><td> أدوات InfoVis </td><td> Geotime </td><td> إلهام </td></tr><tr><td> تنسيق موازية المؤامرات </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td></tr><tr><td> مصفوفات مؤامرة مبعثر </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td></tr><tr><td> تخفيض الأبعاد </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td></tr><tr><td> الأبعاد الزمانية </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td></tr><tr><td> الأبعاد الجغرافية المكانية </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> لا </td></tr><tr><td> النص التعدين </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td></tr><tr><td> المباشرة ومعالجة البيانات </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> لا </td></tr><tr><td> تصفية </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td></tr><tr><td> التمدد إلى منصات أخرى (على سبيل المثال ، R) </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td></tr><tr><td> تنسيقات CSV الجدول </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td></tr><tr><td> XML نماذج البيانات </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> لا </td></tr><tr><td> تستطيع أن تتعامل مع 10000 + الصفوف </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td></tr><tr><td> توثيق </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td><td> نعم </td></tr><tr><td> المنتجات التجارية </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> لا </td><td> لا </td><td> لا </td><td> نعم </td><td> نعم </td></tr></tbody></table> الجدول 1. قائمة من الأدوات التحليلية والبصرية وبعض خصائصها.

<ol>
	<li>Thomas, J., Cook, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Path:+The+Research+and+Development+Agenda+for+Visual+Analytics.">Illuminating the Path: The Research and Development Agenda for Visual Analytics.</a> , (2005).</li><li>Steed, C., Swan, J., Jankun-Kelly, T., Fitzpatrick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+Analysis+of+Hurricane+Trends+Using+Statistical+Processes+Integrated+with+Interactive+Parallel+Coordinates.">Guided Analysis of Hurricane Trends Using Statistical Processes Integrated with Interactive Parallel Coordinates.</a> IEEE Symposium on Visual Analytics Science and Technology. , 19-26 (2009).</li><li>Saraiya, P., North, C., Lam, V., Duca, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Insight-Based+Longitudinal+Study+of+Visual+Analytics.">An Insight-Based Longitudinal Study of Visual Analytics.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 12, 1511-1522 (2006).</li><li>Kollmann, T. R., Crabtree, J., Rein-Weston, A., Blimkie, D., Thommai, F., Wang, X. Y., Lavoie, P. M., Furlong, J., Fortuno, E. S., Hajjar, A. M., Hawkins, N. R., Self, S. G., Wilson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+innate+TLR-mediated+responses+are+distinct+from+those+of+adults.">Neonatal innate TLR-mediated responses are distinct from those of adults.</a> J. Immunol. 183, 7150-7160 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

أدى ظهور الإنتاجية العالية التكنولوجيا في البحوث الطبية الحيوية الحديثة في انفجار بيانات البحوث التي تتطلب طريقة أكثر فعالية من التحليل. تحليلات بصرية (VA) هو علم المنطق التحليلي ييسرها واجهات البصرية التفاعلية (1). نهج VA يستعيد السلطة التحليلية في يد المحلل الإنسان ،...

facilitating the analysis of immunological data with visual analytic techniques

وقد ظهرت تحليلات بصرية (VA) بوصفه وسيلة جديدة لتحليل بيانات كبيرة من خلال العرض المرئي التفاعلي. أثبتنا فائدة ومرونة نهج VA في تحليل قواعد البيانات البيولوجية. أمثلة من هذه المجموعات في علم المناعة وتشمل التدفق الخلوي ، والبيانات Luminex ، والتنميط الجيني (على سبيل المثال ، تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد) البيانات. خلافا لنهج المعلومات التصور التقليدي ، VA استعادة السلطة في أيدي تحليل المحلل المحلل بالسماح للانخراط في الوقت الحقيقي عملية التنقيب عن البيانات. اخترنا البرنامج VA دعا تابلوه بعد تقييم VA أدوات عدة. وقد برهنت على نوعين من التحليل تحليل المهام داخل وبين قواعد البيانات في عرض الفيديو باستخدام هذا النهج دعا تحليل المقترنة. تحليل مقترن ، على النحو المحدد في فرجينيا ، هو نهج التحليل الذي خبير VA أداة تعمل جنبا إلى جنب مع خبراء المجال أثناء التحليل. الخبير المجال هو ذاك الذي يدرك أهمية البيانات ، ويطلب من الأسئلة التي قد تعالج البيانات التي تم جمعها. الخبير أداة ثم يخلق تصورات للمساعدة على إيجاد أنماط في البيانات التي قد تجيب على هذه الأسئلة. على المدى القصير الفجوة الزمنية بين الجيل فرضية وعرض سريع للبيانات البصرية هي الميزة الرئيسية للنهج فرجينيا.

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques at JoVE.com

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

تحليلات بصرية (VA) هو نهج جديد من تحليل البيانات بشكل تفاعلي. في هذا الفيديو ، نناقش مشكلة الزائد البيانات الناتجة عن الإنتاجية العالية التجارب البيولوجية ، واقتراح VA كحل لمشكلة من هذا القبيل. شريط الفيديو يظهر تحليل داخل وبين مجموعات البيانات المناعية باستخدام أداة تسمى VA تابلوه.

تيسير تحليل البيانات مناعية مع التقنيات التحليلية البصرية

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

facilitating-analysis-immunological-data-with-visual-analytic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Views.  University of British Columbia. تحليلات بصرية (VA) هو نهج جديد من تحليل البيانات بشكل تفاعلي. في هذا الفيديو ، نناقش مشكلة الزائد البيانات الناتجة عن الإنتاجية العالية التجارب البيولوجية ، واقتراح VA كحل لمشكلة من هذا القبيل. شريط الفيديو يظهر تحليل داخل وبين مجموعات البيانات المناعية باستخدام ?...

Video: Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

تسهيل اكتشاف المخدرات: مؤتمتة فحص التهاب عالية المحتوى في الزرد

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

فائقة الدقة التصوير من الخلايا القاتلة الطبيعية المناعية المشبك على دعم الزجاج مستو الدهن طبقة ثنائية

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically explore characteristics of their cellular samples. However, these technological advancements yield high-dimensional data sets that have become increasingly difficult to analyze objectively within traditional manual-based gating programs. In order to better analyze and present data, scientists partner with bioinformaticians with expertise in analyzing high-dimensional data to parse their flow cytometry data. While these methods have been shown to be highly valuable in studying flow cytometry, they have yet to be incorporated in a straightforward and easy-to-use package for scientists who lack computational or programming expertise. To address this need, we have developed ExCYT, a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that streamlines the analysis of high-dimensional flow cytometry data by implementing commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction by t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots. Additionally, ExCYT provides traditional gating options of select populations of interest for further t-SNE and clustering analysis as well as the ability to apply gates directly on t-SNE plots. The software provides the additional advantage of working with either compensated or uncompensated FCS files. In the event that post-acquisition compensation is required, the user can choose to provide the program a directory of single stains and an unstained sample. The program detects positive events in all channels and uses this select data to more objectively calculate the compensation matrix. In summary, ExCYT provides a comprehensive analysis pipeline to take flow cytometry data in the form of FCS files and allow any individual, regardless of computational training, to use the latest algorithmic approaches in understanding their data.

ExCYT is a MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) that allows users to analyze their flow cytometry data via commonly employed analytical techniques for high-dimensional data including dimensionality reduction via t-SNE, a variety of automated and manual clustering methods, heatmaps, and novel high-dimensional flow plots.

اكسسيت: واجهة مستخدم رسومية لتبسيط تحليل البيانات الخلوي عالية ثلاثي الأبعاد

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

وظيفية من القوة الذرية مجهر Cantilevers مع خلايا واحدة تي أو الجسيمات واحدة لالمناعية أحادية الخلية قوة مطيافية

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...