המחברים מודים השימוש במעבדה ניתוח השטח באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס, במימון כחלק חומרים מדע והנדסה מרכז מחקר באמצעות הקרן הלאומית למדע. LED הוא המתאמן IGERT ו עמית קרן המדע הלאומית בוגר. מחקר זה מומן חלקית על ידי מענק NIH U54CA143868.

1. Photolithography תקן ייצור הבולים micropatterned <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את פרוסות סיליקון חדש עם אתנול יבש עם זרם של אוויר. השתמש מלקחיים לטפל רקיק למנוע מומים פני השטח במהלך התהליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקיק ספין coater ומכסים פני רקיק עם photoresist SU 2025 שלילי. כיסוי לפחות 80% של פרוסות סיליקון עם photoresist. ספין מעיל למשך 10 שניות בכל 600rpm, ואחריו 30 שניות על 3000rpm. בשל רגישות של photoresist, לכבות את האורות בחדר מרגע זה והלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת photoresist פרוסות סיליקון מצופה לצלחת חמה &quot;רך לאפות&quot; ב 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הסר מהצלחת חם ולאפשר 1 דקות להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מסכה מראש מפוברק עם דפוס הרצוי על גבי פרוסות סיליקון photoresist המכוסה סיליקון לחשוף אולטרה סגול (UV), קרינה (350-450 ננומטר) למשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פרוסות סיליקון לצלחת חמה &quot;קשה לאפות&quot; ב 110 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות ולהסיר רקיק מהצלחת חם. דפוסים ברורים צריכים להיות גלויים בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בזהירות פרוסות סיליקון עם מפתח 8-SU photoresist. לאחר 3 שטיפות עם פתרון מפתח, לשטוף עם אתנול. אם שאריות לבן קיים, לחזור לשטוף עם פתרון מפתח photoresist, או פשוט להטביע את פרוסות בפתרון הפיתוח במשך 2 דקות ולהמשיך שוב עם אתנול לשטוף. לשטוף עם מים ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) פתרון אלסטומר סוכן ריפוי ביחס 10:01 משקל. צנטריפוגה ב 900rpm במשך 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בדוגמת רקיק בצלחת פטרי ויוצקים PDMS על פרוסות סיליקון. אם יש בועות בהווה, מקום desicator ואקום של כמה דקות עד בועות להיעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure הלילה בטמפרטורת החדר (RT) כדי ליצור חותמת אלסטומרי משלימים. אם PDMS לא נרפא לגמרי בתנור לאחר 12 שעות, במקום ב 60 ° C במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות מן PDMS פרוסות סיליקון. השתמש קצה סכין גילוח לחתוך בול לגודל הרצוי. Sonicate באתנול במשך 15 דקות. ופלים יכול להיות מנוצל מספר פעמים כדי ליצור אלסטומרי בולים חדשים. </li></ol> 2. HA Micropatterning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית פלזמה נקי שקופיות במשך 5 דקות. מקם את כל השקופיות לתוך תא ואקום במשך 5 דקות. ואז לאפשר זרימה נמוכה של חמצן להיכנס לתא. הפעל מנקה פלזמה על במשך 5 דקות. הסר מנקה פלזמה מקום בצלחת פטרי באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניקוי פלזמה, sonicate בולים PDMS באתנול במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי 3% v / v פתרון של 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) באתנול 95% v / v בצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל. אפשר להגיב במשך 5 דקות על RT כדי ליצור silanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דפוס חותמת PDMS-up על ספין coater צ&#39;אק כיסוי בדוגמת משטח עם פתרון APTMS. Spincoat ב 3500rpm למשך 30 שניות. אל תיגע במשטח בול, רק את הצדדים של החותמת PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת APTMS פתרון הפלזמה לנקות משטחי זכוכית: חותמת להגדיר פונה כלפי מטה בקצה אחד של הצד בדוגמת בעדינות להחליק לחיצה PDMS אז זה לגמרי במגע עם משטח זכוכית דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PDMS חותמת בעדינות, ולאפשר שקופיות זכוכית בדוגמת כדי לדגור ב RT במשך 30 דקות. יש לשטוף את המשטחים עם הדפס של אתנול באוויר יבש. Sonicate PDMS חותמת במשך 15 דקות כדי להסיר APTMS עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים משטחים בתנור או על פלטה חמה למשך שעה 1 ב 115 ° C. לשטוף עם אתנול יבש עם האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פוליאתילן גליקול טרי (PEG), silane פתרון של 20% v / v 2 - [methoxy (polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane ב טולואן. זה ישמש כאזור ללא דבק סביב דפוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות בדוגמת זכוכית לצלחת זכוכית פטרי דגירה בפתרון PEG-silane במשך 45 דקות ב 75 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית. לשטוף עם טולואן, מים, אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר שעה 1 באמצעות קרינה UV קוטל חידקים בארון בטיחות ביולוגית. המשך בארון בטיחות ביולוגית מנקודה זו קדימה כדי לשמור על סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HA מימית פתרון סטרילי. 10mm של 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 5mm של N-hydroxysuccinimide 50μg / mL והעמסת שכותרתו HA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פתרון HA על מצעים בדוגמת זכוכית בתנאים סטריליים ומוגן מפני אור. Patterned מצעים צריך להיות באין מפריע במשך 16-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון HA, לשטוף עם פוספט בופר סליין (PBS), וכן לכסות את פני השטח עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS שעה 1. פני השטח מוכן כעת תרבית תאים. </li></ol> 3. Cell התרבות על HA micropatterned משטחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב מד&quot;א-MB-231 סרטן שד אנושיים לתאים תאים סרטן המעי הגס LS174T, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא זרע בודד השעיות של תאים סרטניים עם צפיפות בין 0.4 ו 1x10 <sup&gt; 6 תאים סרטניים בכל אזור 18.75 2 ס&quot;מ על משטח זכוכית HA משותקת משטחים. דגירה באינקובטור humidified (37 ° C) באטמוספירה נשמר עם 5% CO 2. הידבקות התא אמור להתרחש בתוך 24 שעות ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות משטחים Cell יכול להישמר עד 5 ימים בתנאים סטנדרטיים חממה. שינוי התקשורת בכל יום אחר. מורפולוגיה של תאים והתפתחות ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה. מבחני הסלולר נוסף ניתן ליישם לנתח תגובות על פני השטח HA. </li></ol> 4. נציג תוצאות: הכימיה carbodiimide משמש קוולנטית לשתק HA לשקופיות APTMS בדוגמת זכוכית מוצג באיור 1 א. EDC הוא סוכן באורך אפס crosslinking כי מגיב עם קבוצות carboxyl HA כדי ליצור אמין-reactive ביניים. כפי ביניים זה רגישים הידרוליזה, NHS נוסף כדי להגביר את יעילות התגובה carbodiimide. כפתרון HA אינטראקציה עם APTMS micropatterns, קשר יציב בין HA אמיד צורות ביניים אמין העיקרי של ATPMS. דוגמה השטח בדוגמת HA דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתוח הקרינה ImageJ להדגים את עוצמת immobilization בדוגמת של HA מוצגים (איור 1 ב-C). Micropatterned משטחים HA לאפשר את לימוד אינטראקציות תאים סרטניים עם HA expgenous. שניהם מד&quot;א-MB-231 שד אנושי LS174t האדם סרטן המעי הגס שורות תאים מעדיפים לדבוק האזורים HA micropatterned (איור 2). הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ניתן להשתמש כדי לנתח את האינטראקציות של תאים בתרבית עם משטחים HA משותקת (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 HA micropatterned משטחים (א) סכמטי המתאר את התפתחות משטחים HA פונקציונלי, (ב) תמונה של הקרינה והעמסת (ירוק), שכותרתו משטח HA micropatterned. (ג) הפצה 3D המפה פיקסל באמצעות תוכנת ImageJ הוכחת דפוסי HA בדידים. בר סולם = 100μm. השתנה מ - 9 באישור Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור סרטן תא הדבקה על משטחים HA micropatterned. שניהם המעי הגס (א) ו השד (ב) דבק קרצינומה מועדף על תיקוני HA עם 24 שעות של תרבות. השתנה מ - 9 באישור Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="איור 3" /> 3. איור סרטן תאים אינטראקציה עם HA. (א) סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של תאים סרטניים במעי הגס (א) בתרבית על משטחים HA שמוצג בהגדלה נמוכה (משמאל) הגדלה גבוהה (מימין; של ריבועים על שמאל) של תאים סרטניים בשד (ב) בתרבית על משטחים HA הראו ב בהגדלה נמוכה (משמאל) הגדלה גבוהה (מימין; הריבועים בצד שמאל).

<ol>
	<li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease.">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li><li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+(CD168)+Form+Complexes+with+ERK1,2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells.">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li><li>G&#246;tte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparanase,+Hyaluronan,+and+CD44+in+Cancers:+A+Breast+Carcinoma+Perspective.">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li><li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response.">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li><li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule.">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li><li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces.">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li><li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures.">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li><li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+(HA)+on+endothelial+cells.">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li><li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid.">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li><li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis.">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li><li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease:+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways.">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li></ol>

דמות סכמטית וידאו לשכפל באישור; זכויות יוצרים Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co KGaA. דיקינסון LE, Kusuma S, Gerecht ס שחזור נישה התמיינות של תאים עובריים באמצעות biomaterials. Macromol. Biosci. 2010: אוקטובר 21. [Epub לפני ההדפסה].

השיטה מאפשרת micropatterning HA הציג את המחקר של אינטראקציות עם התא HA אקסוגניים. HA ידוע לשחק תפקיד מפתח בהתפתחות סרטן 1 אך היו מחקרים מוגבל לחקור את האינטראקציה של תאים סרטניים על שני משטחים HA ממדי בדוגמת. מחקר לשליטה על micropatterns אקסוגניים HA מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SU-2025 photoresist</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem Corp.</td>
<td>Y111069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SU-8 developer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem Corp.</td>
<td>Y020100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>281778</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest Inc</td>
<td>SIM6492.7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>24500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrick</td>
<td>F1177</td>
<td>Reconstitute with 10ml of DI water </td>
</tr>
<tr>
<td>MDA-MB-231 breast carcinoma cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>HTB-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LS174t colon carcinoma cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>Cl-188</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

micropatterned surfaces to study hyaluronic acid interactions with cancer cells

הפלישה סרטן התקדמות כרוכה פנוטיפ התא ניעתי, אשר לפי תקנה מורכבים על ידי גורמי גדילה / ציטוקינים תאי המטריצה ​​(ECM) רכיבים בתוך microenvironment את הגידול. חומצה היאלורונית (HA) הוא אחד סטרומה מרכיב ECM כי ידוע כדי להקל על התקדמות הגידול בעקבות הפלישה צמיחה ושיפור, ו אנגיוגנזה 1. אינטראקציה של HA עם שטח פני התא שלה CD44 לקולטן גורם איתות אירועים לקדם גדילת תאים והישרדות הגידול, והגירה, ובכך להגדיל את התפשטות גרורתית 2-3. HA הוא glycosaminoglycan anionic, nonsulfated מורכב יחידות חוזרות של חומצת D-glucuronic ו DN-acetylglucosamine. בשל נוכחותם של קבוצות הידרוקסיל על carboxyl ו disaccharide יחידות חוזרות, יליד HA הוא הידרופילי, במידה רבה, מקובל כי שינויים כימיים להציג קבוצות סולפט עבור immobilization photoreative 4-5. מחקרים קודמים הנוגעים immobilizations של HA על גבי משטחים לנצל את התנהגות bioresistant של HA ו - נגזרת sulfated שלה לשלוט הידבקות התא על גבי משטחים 6-7. בשנת הידבקות מחקרים אלה תא מעדיפים מתרחשת על אי - HA אזורים בדוגמת. כדי לנתח אינטראקציות הסלולר עם HA אקסוגניים, פיתחנו משטחים פונקציונליות בדוגמת המאפשרים מחקר לשליטה ברזולוציה גבוהה ויזואליזציה של תאים סרטניים אינטראקציות עם HA. ניצלנו הדפסה microcontact (UCP) כדי להגדיר אזורים בדוגמת דיסקרטית של HA על משטחי זכוכית. &quot;קשירה&quot; הגישה כי חל כימיה carbodiimide קישור לשתק HA היה בשימוש 8. משטחי זכוכית היו microcontact מודפס עם aminosilane והגיב עם פתרון HA של יחסי אופטימיזציה של EDC ו NHS לאפשר immobilization HA במערכים בדוגמת. שילוב כימיה carbodiimide עם MCP אפשרה immobilization של HA לאזורים מוגדרים, יצירת משטחים מתאים ביישומים במבחנה. גם סרטן המעי הגס תאים תאים סרטן השד תיקשר במשתמע עם משטחים micropatterned HA. תא הידבקות בסרטן התרחש בתוך 24 שעות עם ריבוי על ידי 48 שעות. שימוש HA משטחים micropatterned, הראינו כי התא הידבקות בסרטן מתרחשת דרך הקולטן CD44 HA. יתר על כן, HA משטחים בדוגמת היו תואם מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) ואיפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים סרטניים בליטות דבק והפצת על דפוסי HA לנתח תאים סרטניים על תנועתיות HA אקסוגניים.

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells at JoVE.com

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

שיטה חדשנית המאפשרת ברזולוציה גבוהה ניתוח של אינטראקציות תאים סרטניים עם חומצה היאלורונית אקסוגניים (HA) מתואר. משטחים בדוגמת מיוצרים על ידי שילוב של כימיה carbodiimide והדפסה microcontact.

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K Views.  Johns Hopkins University. שיטה חדשנית המאפשרת ברזולוציה גבוהה ניתוח של אינטראקציות תאים סרטניים עם חומצה היאלורונית אקסוגניים (HA) מתואר. משטחים בדוגמת מיוצרים על ידי שילוב של כימיה carbodiimide והדפסה microcontact.

Video: Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Transfection גן לתאי ספרואיד על צלחות micropatterned תרבות להשתלת תאים גנטיות-שונה

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

הכנת Thermoresponsive Nanostructured משטחי הנדסת רקמות

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

האתר מכוון הנייח של עצם Morphogenetic חלבון 2 משטחים מוצקים על ידי לחץ על כימיה

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

חומצה היאלורונית מבוסס Hydrogels לתרבות תלת-ממדי של החולה-Derived גליובלסטומה תאים

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...