ברצוננו להודות Quentina ביטי, אוניברסיטת לינץ, אוסטריה, על עזרתה האדיבה, קתרינה Strub, אוניברסיטת ג&#39;נבה, שוויץ, עבור הקמת hCD71-GFP, ודניאל Legler, אוניברסיטת קונסטנץ, שוויץ, עבור ה-GPI-GFP DAF-לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF; פרויקט Y250-B03) ואת פרויקט GEN-AU משרד האוסטרי למדע ומחקר.

Microcontact הדפסה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור שדה micropattern של הבול PDMS באמצעות אזמל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השדה המכיל את micropattern על ידי שטיפה זה עם אתנול (100%) ומים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש חותמת PDMS עם חנקן או גז ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl-BSA Cy5 פתרון עבודה (0.67 מ&quot;ג / מ&quot;ל) על הבול PDMS כך שהשדה כולו micropattern מכוסה פתרון. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השדה micropattern על ידי שטיפה עם בופר פוספט (PBS) ומים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש PDMS עם חנקן או גז ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החותמת PDMS תחת כובד משקלו על גבי באמצע coverslip אפוקסי מצופה אחד דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל את המיקום של החותמת PDMS על הישבן של coverslip לבין הרצועה החותמת משקופית עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stick Secure חותם הכלאה קאמרית מעל שדה microcontact מודפס על coverslip. התווית עוזר למקם את מרכז השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 60 streptavidin μl עבודה פתרון (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתוך תא התגובה דגירה המדגם עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם 1 מ&quot;ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר ואת הסרתו בו זמנית בנמל השני עם משאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 60 עובדים μl biotinylated פתרון נוגדן (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​PBS בתוספת 0.1% Tween 20: &quot;PBST&quot;) לתוך תא התגובה דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המדגם עם 1 מ&quot;ל PBST ולאחר מכן 1 מ&quot;ל PBS על ידי הוספת מאגר ליציאת אחד של החדר והסרת אותו שוב בנמל השני עם משאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות משטחי micropatterned ב PBS בחושך בטמפרטורת החדר עד תאים מוכנים זריעה. </li></ol> דגירה של תאים על פני השטח micropatterned: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים חסיד אל מפגש 50% צלחת 3 רקמות ס&quot;מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק התאים לבטא הפיתיון טרף חלבונים עניין עם פתרון Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) חומצה צנטריפוגות 5 דקות ב 1000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול פי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו לפזר את התא גלולה במדיום הגידול המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבורסה PBS מהאולם תגובה על ידי coverslip micropatterned μl 60 השעיה של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת תא humidified על ידי השריית משטח סטרילי במים מזוקקים ומכניסים אותו לתוך צלחת פטרי כדי למנוע מדגם ריצה יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים על פני הלילה בשעה 37 ° C באווירה 5% CO 2 על משטחים micropatterned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח תאים במיקרוסקופ, חילופי בינוני שנאגרו על ידי פתרון של האנק מלח כולל Ca 2 + ו - Mg 2 +. </li></ol> מיקרוסקופית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip ממוקם על הר מתאימים את המורפולוגיה התא נבדק תחת אור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האיכות של ה-BSA Cy5 דפוסי נבדק על ידי עירור ב 647 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropatterns של חלבון פלואורסצנטי טרף (GFP או YFP) נרשמות 488 או 514 ננומטר תחת סך עירור פנימית השתקפות (TIR). </li></ol> נציג התוצאות: אם יש אינטראקציה בין חלבונים בתאים היעד גדל על משטח micropatterned, הטרף יעברו חלוקה מחדש הפיתיון. Micropattern וכתוצאה מכך ניתן דמיינו לפי תווית של חלבון פלואורסצנטי את הטרף. חשוב לציין את הניגוד המתקבל מספק מדידה ישירה של כוח האינטראקציה (ראה איור 1). לכן הערכה פשוטה של ​​אינטראקציה של שני חלבונים הופך אפשרי - ללא צורך להמשיך ולעבד את הנתונים העיקריים שנמדדו. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סידור מחדש של הפיתיון בתוך קרום התא פלזמה לחיות בעוצמות אינטראקציה שונה. תמונות TIR של תאים T24 transfected עם (א) CD71-GFP על נוגדן CD71, (ב) ו - CD4 YFP cytosolic על נוגדנים CD4 ו - (ג) GPI-GFP-DAF-CD59 על נוגדן microbiochips מוצגים. נתונים אופייניים עבור חזקה (א), לא (ב) או אינטראקציה חלשה (ג). (א) מובא מן (Weghuber et al., In press), (ב) מ - (Schwarzenbacher et al. 2008).

<ol>
	<li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to+"Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments.">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li><li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8.">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li><li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+screening:+a+technology+in+transition.">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li><li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li><li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning.">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , .</li></ol>

הסרטון מכיל תמונות סופקו על ידי אולימפוס, שנלקחו הבית של מעבדת המחקר של ויזואליזציה, אוניברסיטת בראון או לשכפל מ (Kim et al., 2003).

הסרטון מלווה מדגים שיטה לאיתור חלבונים אינטראקציות קרום הפלזמה של תאים חיים (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in press). בעיקרון, כל פלטפורמה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF יכול לשמש כמערכת readout. רק כאשר רגישות גבוהה הוא הרצוי (למשל לצורך זיהוי של מולקולות בודדות), מיקרוסקופים מתקדמים יידרש. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בנקודות קריטיות הבאה במהלך תהליך ההכנה דורש תשומת לב מיוחדת: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cy5 מניות חנות פתרון בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore ולהכין את BSA-Cy5 פתרון לעבוד טרי לפני הדפסת microcontact. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא לשרוט את micropattern על PDMS עם קצה פיפטה ו דגירה המדגם בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את coverslip על משטח סטרילי כדי למנוע הידבקות של שקופיות הזכוכית כדי בצלחת פטרי. לאחר חותמת PDMS דבק כדי להחליק את הזכוכית, לא להזיז אותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע בועות אוויר בתא התגובה דגירה המדגם בתנאים כהה, כדי למנוע הלבנת של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תתנו המדגם יבש במשך יותר מ 2 דקות, כדי למנוע היווצרות של גבישי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ניתוק של התאים לא משתמשים טריפסין כפי לדבוק הרצון תחום תאי של חלבונים בממברנה ביטוי עד כה. הימנעות טריפסין יהיה מועיל חלבונים עם תחלופה נמוכה כדי ליצור micropatterns מיד לאחר ההתקשרות של תאים על פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיקוח על מספר התאים מודגרות במיקרוסקופ ולוודא כי התאים אינם מגיעים יותר מ 30-50 מפגש%. ודא כי תאים מופרזת יוסרו לאלתר בשל המצורף מהירה של תאים על פני השטח נוגדן מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות רק עם איכות גבוהה-BSA Cy5 דפוסי ניתן להשתמש לצורך ניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביטוי יציבה של חלבון פלואורסצנטי טרף עדיפה בשל מספר גדול יותר של תאים ניתן לנתח לכל סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמה נאותה TIRF היא הכרחית כדי להמחיש דפוסי בשל הרקע cytosolic. </li></ol> הטכניקה מיקרו דפוסים מציע מספר אפשרויות לניתוח אינטראקציות בין חלבונים. ראשית, יחד עם כימות של המקומיים, חלבונים אינטראקציות החליט מרחבית גם זיהוי של אינטראקציות חלשות או עקיף אפשרי בלי החיסרון של מתן מספר גבוה של תוצאות חיוביות או שליליות שגויות. שנית, היא מאפשרת לנתח חוקר חלבונים אינטראקציות קרום הפלזמה של תאים חיים, אשר קשה להשיג באמצעות גישות ביוכימיות כמו מסך 2-היברידית. שלישית הגישה מאפשרת זיהוי של הפיתיון טרף אינטראקציות כי הם מווסתת על ידי שינויים סביבתיים כמו טמפרטורה, נוכחות של חלבונים שונים או מולקולות אחרות או שלאחר translational שינויים. לפיכך assay מאפשר מאפננים ההקרנה של זוג אינטראקציה נתון בהקשר של תאים חיים. יתר על כן, על ידי הקטנת צפיפות השטח של ליגנד ללכוד או שימוש ligands חד ערכי, ניתוח של מצב המנוחה הופך אפשרי. לבסוף, אם פלטפורמות סריקה נאותה משמשים, את מספר התאים ניתח גבוה מספיק כדי להתאים לדרישות תפוקה גבוהה של חברות התרופות להקרנה סמים (Ramm, 2005).

in-vivo detection of protein-protein interactions on micro-patterned surfaces

להתיר את רשת אינטראקציה של מולקולות<em&gt; ב-vivo</em&gt; היא המפתח להבנת המנגנונים המווסתים את תפקוד התא וחילוף חומרים. שפע של אפשרויות מתודולוגי לטיפול אינטראקציות מולקולריות בתאים פותחו, אבל רוב השיטות האלה סובלים להיות עקיפה ולא כמותית ולכן בקושי. להיפך, כמה-high-end גישות כמותיות הוכנסו, אשר עם זאת קשה להאריך תפוקה גבוהה. כדי לשלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי, אנו לאחרונה פיתחו תפיסה חדשה לזיהוי חלבונים אינטראקציות (Schwarzenbacher<em&gt; ואח&#39;</em&gt;. 2008). כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתכנון ובנייה של מערכת זו אשר מאפשרת לניתוח אינטראקציות בין חלבון-fluorophore שכותרתו (&quot;טרף&quot;) לבין חלבון קרום (&quot;פיתיון&quot;)<em&gt; ב-vivo</em&gt;. תאים הם מצופה על משטחים micropatterned פונקציונליות עם נוגדנים כנגד תחום exoplasmic את הפיתיון. Bait-טרף אינטראקציות הם assayed באמצעות חלוקה מחדש של הטרף ניאון. השיטה מתאפיינת ברגישות גבוהה עד לרמה של מולקולות בודדות, את היכולת לזהות אינטראקציות חלשות, יכולת תפוקה גבוהה, מה שהופך אותו רלוונטי ככלי מיון.

Watch this Scientific Journal Video about In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces at JoVE.com

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

in-vivo-detection-protein-protein-interactions-on-micro-patterned

Research

JoVE Journal

Biology

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

10.7K Views.  Johannes Kepler Universitat Linz. וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

Video: In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Biochemistry

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.

A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.

לשון אלקטרונית יצירת דפוסי הכרה רציפה לניתוח חלבון

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of ...

Bioengineering

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Neuroscience

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

כימות מבוסס הדמיה של תאים חיים על מולקולות בודדות של אינטראקציות חלבונים

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

מחבר זרקור: הערכה של דינמיקה של עיבוי חלבונים בתאים אנושיים חיים

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

לשון אלקטרונית יצירת דפוסי הכרה רציפה לניתוח חלבון

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים