אנו מכירים אוסטין Cyphersmith ו Mayandi Sivaguru (קרל ר Woese המכון לביולוגיה הגנום, אוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין) לקבלת סיוע עם מיקרוסקופיה עבור אדיב מסך בנדיבות לכידת וידאו בליבה מיקרוסקופיה.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בניסויים שלנו, מצאנו כי הכשלים הנפוצים ביותר קשורים לאיכות מערכים מפוברקים גרוע מאופיין תגובה במערכת הביולוגית של עניין. אנו מפנים את קורא טבלת 1 עבור מצבי כישלון משותפים בניסויי microarray תא שלבי פתרון קשורים. לגבי איכות מערכים בפרט, אנו ממליצים על הבאה. אשר את האיכות הטכנית וביציבות של עֲרִיכָה תוכניות, פרמטרים או מאגר באמצעות מולקולות שכותרתו fluorescently כגון dextran rhodamine מצומדות. לנקות ביסודיות סיכות לפני או אחרי עֲרִיכָה לפי הוראות היצרן ובהמשך לבדוק חזותי שערוצי הסיכה ברורים של פסולת באמצעות מיקרוסקופ אור. אשר שמירת biomolecule ערוכה באמצעות כתמי חלבון כלליים או immunolabeling. שים לב ביומולקולות עם משקל מולקולרי מתחת ל -70 kDa אינן נשמרות לעתים קרובות הידרוג&#39;ל 23, </<html> sup&gt; 31. אמת תא-פונקציונלי biomolecule ערוך באמצעות סוגי תאים מרובים. שים לב, רק תאים חסידים תואמי מערכים; בנוסף, הדבקה למערכים תלויים הוא תכונות התא ספציפי (למשל, פרופיל ביטוי integrin) ואת חלבוני ECM שנבחרו. עקב מספר המקומות המוגבל, לא סיפקנו טיפול רחב בעיצוב המערך, פריסה, ייצור פה מפנים את הקורא הקודם עובד 23, 25. אנו משתמשים בדרך כלל 100 subarrays ספוט (150 מיקרומטר קוטר נקודה, 450 מיקרומטר מרכז אל מרכז מרחק) מורכבים 10-20 תנאי biomolecule ייחודיים (כלומר, 5-10 כתמים / מצב). מספר subarrays במערך אחד משתנה בהתאם למספר תנאים biomolecule של עניין, אשר וניתן לשנותם בנוחות עד 1,280 בשקופית מיקרוסקופ אחד 25 × 75 מ&quot;מ (~ 6,400 נקודות ב -64 subarrays)Xref &quot;&gt; 25, 31 הפרמטרים לעיל ישתנו נוספים בהתאם לדפוס הגודל של עניין;. סיכות מסוגלות לייצר דפוסי 75 - 450 מיקרומטר זמינים. ניסויי מערך משלימים הטובים ביותר על ידי מתן תוקף תנאים ערוכים שקבלו דירוג הגבוה של עניין באמצעות פורמטי תרבות אחרים, readouts assay, ומערכות מודל ביולוגיות. באופן ספציפי, אנו ממליצים נוספים אימות השפעות של תנאים ערוכים בוחרים בתרביות בתפזורת בשילוב עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות (למשל, qRT-PCR, immunoblotting) או תקן TFM. מניפולציה גנטית (למשל, מציאה או ביטוי יתר) של הגורם של עניין מערכת מודל ביולוגית מתאימה יכול לשמש גם כדי לאשר השפעות שנצפו במערכים. בשנת vivo במודלים של בעלי חיים לייצג פירושו אחר של אימות ושימשו לאחרונה, למשל, כדי לאשר את תפקידה המרכזי של galectin-3 ו galectin-8סרטן ריאות נישה גרורתי, כמו בתחילה זיהה באמצעות תא microarray 31, 49. מספר שיטות אחרות שמשו לחקור תקנת microenvironmental של תפקודים תאיים, כוללים מגוון רחב של דו ממדי מערכות microfabricated 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ו מערכות ביולוגיות מהונדסות תלת ממדי 56, 57, 58 59,, 60, 61. בהשוואה לשיטות אחרות, היתרונות המסוימים של פלטפורמת microarray תא המתואר כאן כוללים: (1) תפוקה עדמאה או אלף שילובים שונים של גורמים, המאפשרים ניתוח של השפעות אינטראקציה; (2) נגישה, הדמיה אוטומטית וניתוח; (3) שילוב של שניהם readouts ביוכימיות biophysical עם המצגת מבוקרת של גורמים ערוכים; (4) יכולת להשתנות תכונות חומר מצע; ו (5) ניתוח של גורל ותפקוד תא תא בודד גבוה תוכן. לסיכום, שילוב של microarrays תא עם TFM על מצעים של קשיחות המצע מתכונן מאפשרת אפיון מעמיק של שני רמזים ביוכימיים biophysical. כפי שהוצג כאן, פלטפורמה זו היא להכליל וניתן ליישום בקלות למגוון של סוגי תאים חסידים והקשרי רקמות לקראת הבנה טובה יותר של רגולצית microenvironmental קומבינטורית של התמיינות תאי mechanotransduction.

אינטראקציות בין תאים וגורמים microenvironmental שמסביב לתווך מגוון גדול של תהליכים ביולוגיים במהלך ההתפתחות, הומאוסטזיס, ומחלות בפתוגנזה 1, 2, 3, 4. אינטראקציות microenvironmental אלה כוללים משלוח של גורמים מסיסים לתאים, תא-מטריצה ​​מחייבת, ואינטראקציות תאי תאים באמצעות קולטן ליגנד המחייב. בנוסף לשיקולים ביוכימיים לעיל, פרמטרים biophysical, כגון תכונות מכניות המצע (למשל, מודולוס של יאנג, נקבוביות) ואת צורת התא, ואת mechanotransduction במורד הזרם הקשורים ויותר זכו להכרה כמתווכים המפתח של התמיינות תאים 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. אותות כתוצאה מאינטראקציות microenvironmental הללו משרתים כתשומות לרשתות גני מסלולי איתות. יתר על כן, מרכיבי תא-מהותי אלה גם ולספק משוב על המיקרו-הסביבה באמצעות גורמי מופרשים ואנזימים משפילים-מטריקס, השלימו לולאת שיתוף רגולטוריות מורכבת בין תכנות גנטי מהותי תאים וגורמים microenvironmental חיצוני תאי 5, 11, 12. השימוש במערכות מהונדסות עבור המצגת המבוקרת של גורמי microenvironmental הוכיח שימושי במגוון של קשרים שונים 13, 14, 15. מערכות microfabricated בפרט הקלו דפוסים מרחביים מדויקים של חלבונים בתאים וכן ניתוח parallelized ביותר באמצעות מזעור 13, <supclass = &quot;Xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays תא לייצג מערכת microfabricated אחד כזה שבו שילובים של מולקולות ביולוגיות הם מודפס קשר על מצע הידרוג&#39;ל polyacrylamide אלסטי 23, 24, 25. הכללת רכיבים דבק תאים (כלומר חלבונים מטריקס) מאפשרת הידבקות התא מתמשכת והתרבות על microarrays, אשר מלווה לעתים קרובות על ידי ניתוח במורד הזרם באמצעות immunocytochemistry וכתבים ניאון. Microarrays התא הופנה פרודוקטיבית להשגת הבנה משופרת של פנוטיפ כבד תא 23, 26, בידול עצבי מבשר 27, mammarהחלטות גורל אב y 28, / תחזוקת תאי גזע עוברי בידול 23, 29, 30, גרורות סרטן ריאות 31, ותגובה טיפולית מלנומה 32. אנחנו הוכחנו את השימוש לאחרונה של microarrays תא להגדרת התפקיד של תאי מטריקס (ECM) רכב חלבון במפרט endoderm 33, בידול ובתאים בכבד 34, 35, ותגובת תרופת תא ריאת גידול 36. בעבודות אלה, התמקדנו הרחבת היכולות קומבינטורית של פלטפורמת מערך לחקור את הצמתים של איתות תאי-מהותי עם הרכב תאי מטריקס ו ביומכניקה. בנוסף, יישמנו readouts biophysical במצע מערך זה כדי לספק את היכולת charac כמותיתterize את התפקיד של התכווצות תא בידול מעבד 35. לשם כך, אנו משולבים מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) עם microarrays התא לאפשר הערכת תפוקה גבוהה של מתיחת תא שנוצר. TFM היא שיטה שימוש נרחב למדוד כוחות המתיחה שנוצר התא סיפקה תובנות משמעותיות ביחס לתיאום פונקציה חד תאים ורקמות ברמה להרכב ביומכניקה של microenvironment המקומית 37, 38, 39, 40. לפיכך, שילוב TFM עם microarrays התא מספק מערכת תפוקה גבוהה למדידת מפתח, פרמטרי biophysical רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. פלטפורמת microarray התא המתואר כאן מורכבת מארבעה חלקים: המצאה של מצעי polyacrylamide, ייצור של מערכים, תרבית תאי הודעת assay, וניתוח של נתונים. לִרְאוֹתאיור 1 עבור סיכום סכמטי של השלושה הסעיפים הניסיוניים הראשונים; ראה איור 2 עבור סיכום סכמטי של הקטע האחרון עם דגש על ניתוח נתוני immunofluorescence. על מנת להתאים את פלטפורמת microarray תא המחקרים של אינטראקציות תא-מצע ביומכנית, השתמשנו מצעי polyacrylamide של מודולוס של יאנג מתכונן אבל נקבובי דומה, לכל אל וון et. 41. כדי לאפשר מדידות TFM של כוחות המופעלים על ידי התאים על המצע שלהם, יישמנו בפורמט צלחת זכוכית התחתונה פטרי בנוסף מיקרוסקופ זכוכית עבה שקופיות מנוצל לעתים קרובות על ידי קבוצות אחרות. לפיכך, פלטפורמת microarray התא הזה מסוגלת מדידות מקבילות של התמיינות תאים באמצעות immunofluorescence בשקופיות מיקרוסקופ וכוחות שנוצרו תא באמצעות TFM על מנות זכוכית תחתונה נפרדות. גם יש לנו ליישם מספר שיפורים על הגישה האנליטית נפוצה עם microarrays תא. specifically, במקום Z-ניקוד פרמטרית של עוצמת אי ברמה כללית אנו מודדים את עוצמת תא בודד ולהחיל נורמליזציה בחמישון כדי לתת דין וחשבון על הפצות הלא נורמליות יותר לתאר במדויק התנהגות הסלולר. אנו מאמינים שיפורים אלה מספקים כלי מסוים כלפי חקירות של תהליכים ביולוגיים שבהם שני רמזים ביוכימיים biophysical לשחק משמעותיים, תפקידים מצטלבים. יתר על כן, שיפורים האנליטית שלנו לאפשר יישום של microarrays תא ללימודים של מגוון רחב של תפקודים תאיים עבורו תא בודד והתנהגות ברמת האוכלוסייה לסטות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

microarrays הסלולר microfabricated, הכוללות שילובים מודפס קשר של ביומולקולות על משטח הידרוג&#39;ל אלסטי, לספק נתונים לפיקוח הדוק, מערכת מהונדסים תפוקה גבוהה למדידת ההשפעה של אותות ביוכימיים ערוכים על התמיינות תאים. מאמצים אחרונים באמצעות מערכי תא הוכיחו השירות שלהם ללימודי קומבינטורית שבה גורמים רבים microenvironmental מוצגים במקביל. עם זאת, מאמצים אלה התמקדו בעיקר שבדקו את ההשפעה של רמזי ביוכימיים על תגובות תא. כאן, אנו מציגים פלטפורמת microarray תא עם תכונות חומר מתכוננות להערכה היא התמיינות התאים על ידי immunofluorescence ואינטראקציות תא-מצע ביומכנית ידי מיקרוסקופ כוח המתיחה. לשם כך, פיתחנו שני פורמטים שונים ניצול הידרוג polyacrylamide משתנה מודול יאנג מפוברק משני שקופיות מיקרוסקופ או צלחות פטרי זכוכית התחתונה. אנו מספקים BESשיטות t ופתרון בעיות עבור ייצור של microarrays על מצעים הידרוג&#39;ל אלה, תרבית תאים עוקבות על microarrays, ורכישת נתונים. פלטפורמה זו היא מתאימה היטב לשימוש בחקירות של תהליכים ביולוגיים עבורו הוא ביוכימיים (למשל, רכב תאי מטריקס) ו biophysical (למשל, קשיחות מצע) רמזים עשויים לשחק משמעותיים, מצטלבים תפקידים.

באמצעות פלטפורמה זו, חקרנו את תפקיד שני הרמזים ביוכימיים biophysical במפרט גורל האבות כבדים 34, 35. חלבון / הליגנדים Notch G מצומדות הראה שימור אשכולות משופר הידרוג&#39;ל polyacrylamide (איור 3 א) והיו יתר מצליח להבריח והתמיינות של אבות הכבד לקראת גורל התא צינור המרה (איור 3B). שימוש בניתוח תא בודד, אנו לכמת התגובה הליגנדים Notch עבור חלבוני ECM לי קולגן, קולגן III, IV קולגן, פיברונקטין, ו laminin (איור 3 ג), מציאת שהתגובה של אבות כבדים ליגנד תלוי גם על בהקשר ECM. לאחרונה, השתמשנו מציאת shRNA ליצור אבות כבדים ללא הליגנדים Dll1 ו Jag1. התגובה ליגנד Notch הערוך השתנתה בהתאם presence של או ליגנד, המאשר כי היענות ליגנד תאים חיצוניים היא גם פונקציה של הביטוי ליגנד-מהותי התא (איור 3D). יתר על כן, צפינו subpopulation מובהק של פעמים חיוביות (ALB + / OPN +) תאי מציאת Dll1 (האיור 3D). יחד, תוצאות הנציגים הללו מראים: (1) את היכולות קומבינטורית של פורמט המערך, כפי שהודגם על ידי הזיווג של חלבוני ECM ו- הליגנדים Notch ערוכים מרובים עם המציאה של הליגנדים פרט; (2) את הפונקציונליות של לא רק ערוכי חלבוני ECM אך ערוכה גם ליגנד תאי תאים באמצעות חלבון A / G בתיווך נטייה; ו (3) היישום של ניתוח התא הבודד שלנו ועל יכולתה להבחין בתת אוכלוסיות ייחודיות. אנו הבחנו גם כי הבידול של אבות כבדים תלוי הוא על קשיחות המצע ואת רכב ECM (איור 4 א </str<html> אונג&gt;), במיוחד במציאה כי קולגן IV תומכת בידול משני מצעים רכים ונוקשים ואילו פיברונקטין תומך רק בידול על מצעים נוקשים (האיור 4B). מפות חום נציג של מדידות TFM הציעו מתח מתיחה מתמשך לקראת קשיחות מצע נמוכה על קולגן IV קדם בידול לתאי צינור מרה (איור 4C), ממצא אושר על ידי ערכי שורש ממוצעים מרובע ממוצע (איור 4D). יחד, תוצאות הנציגים הללו מראים: (1) שילוב המוצלח של TFM עם microarrays תא על מצעים עם קשיחות מתכוננת להעריך הוא את פנוטיפ תא ואת לחץ המתיחה; (2) התיאום של גורל התא כבד ובתאים בשני רכב מטריקס קשיחות המצע; ו (3) היישום של ניתוח TFM שלנו ופרופילי מתח מתיחה טיפוסיים microarrays תא. <html> e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55,362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: הסקירה הכללית סכמטי המציג שלושת הסעיפים הניסיוניים הראשונים. בסעיף 1, מצעי זכוכית מנקים silanized כדי להקל על ייצור של הידרוג polyacrylamide. בסעיף 2, שילובי biomolecule של עניין ערוכים בתוך microplate מקור 384 גם. Arrayer רובוטית נטען אז עם סיכות נקי, microplate המקור, ואת הידרוג polyacrylamide ו אותחל, בודה מערכים על הידרוג&#39;ל. בסעיף 3, תאים הם זורעים על התחומים הערוכים ואפשרו לדבוק, שלאחריו פרוטוקול התרבות של ריבית מבוצע. בנקודת הקצה, תאים מקובעים או עבור immunocytochemistry / immunofluorescence או נותחו באמצעות TFM. ברי סולם הם 75 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> בתוך-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> איור 2: עיבוד וניתוח של נתונים Immunofluorescence מ מערכים. (א) שיש, 32 סיבי מרוכבי תמונות RGB הם זרקו לפח ראשון ולאחר מכן התפצלו לערוצי 8 סיביים בודדים. באמצעות שילוב של סמני ניאון ערוכים ואיי תא, שלוש פינות של המערך מזוהות על מנת לאפשר התמצאות אוטומטית gridding של המערכים. (ב) נתוני תא יחיד מופקים עבור כל ערוץ של מערכי הקלט. על מנת לתת דין וחשבון על להיסחף ניסיוני, הנורמליזציה בחמישון מוחלת על ידי לשכפל ביולוגי, הפקת הפצה משותפת אחת בכל המשכפל. הנתונים מנורמלים Quantile מכן הוא זמם ולפרש באמצעות חישוב מדידות הרכב (למשל, תאים / אי, אומרים עצמה, תאי אחוז חיוביים עבור תווית) או ניתוח ישיר של הפצות תא בודד.מ &#39;/ קבצים / ftp_upload / 55,362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> איור 3: בידול ובתאים כבד מתווכת מצגת Notch ליגנד. (א) Notch Fc-רקומביננטי הליגנדים Jagged-1 (JAG1) ודלתא דמוי 1 (DLL1) הציג השמירה משופרת אשכולות כאשר ערוכים עם חלבון / G. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. (ב) אבות כבדים מובחנים לתוך תאי צינור המרה בהצגה עם ליגנד Notch. 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) הוא תווית גרעינית, אלבומין (ALB) היא סמן תא בכבד ואי osteopontin (OPN) הוא סמן תא צינור מרה. בר סולם הוא 150 מיקרומטר. (C) כימות אחוז התאים החיוביים עבור OPN עבור הליגנדים Notch JAG1, DLL1, ודלתא דמוי 4 (DLL4) על חלבונים ECM קולגן אני, גollagen III, קולגן IV, פיברונקטין, ו laminin. -tests T של הסטודנט בוצע נגד IgG המלא לכל ליגנד Notch ערוך בתוך כל חלבון ECM עם ערכי P מותווה P &lt;0.05 (*). (ד) הדמיה cytometry של ALB ו OPN עבור תאים על קולגן III בפניך את הליגנדים Notch JAG1, DLL1, ו DLL4. אבות כבדים ללא Notch הליגנדים Dll1 ו Jag1 (כלומר, shDll1 ו shJag1) שהופקו באמצעות מציאת shRNA. הנתונים (C) כפי שהוצגו ממוצע ± SEM נתון זה יש הבדל בין Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> איור 4: רכב מטריקס ואת המצע הנוקש Coordinate בידול ובתאים כבד. (א) בידול ובתאים כבדים למרר תאי צינור תלוי הוא בהרכב ECM וקשיחות מצע. DAPI הוא תווית גרעינית, ALB הוא סמן תא בכבד ואי OPN הוא סמן תא צינור מרה. (ב) כימות של אחוז התאים החיוביים עבור OPN על מצעים של מודולוס של יאנג 30 kPa, 13 kPa, ו -4 kPa עבור קולגן אני (C1), קולגן IV (C4), פיברונקטין (FN), וכל דו כיוונית שילובים של אלה חלבוני ECM. (C) תא מתיחת לחץ תלוי הוא קשיחות מצע ורכב ECM. (ד) כימות של ערכים שורש ממוצע מרובע של מתח המתיחה על מצעים של מודולוס של יאנג 30 kPa ו -4 kPa עבור קולגן אני (C1), קולגן IV (C4), פיברונקטין (FN), וכל שילובים דו כיוונית של אלה חלבוני ECM. ב (ב) ו- (ד), הוצגו הנתונים כממוצע ± -tests t של SEM and Studentבוצעו נגד 30 kPa לכל צירוף ECM עם ערכי P מותווה P &lt;0.05 (*), P &lt;0.01 (**), ו- P &lt;0.001 (***). ברי סולם הם 50 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> סָעִיף </td><td fo:width="1.5in"> בְּעָיָה </td><td fo:width="1.5in"> סיבות אפשריות </td><td> פִּתָרוֹן </td></tr><tr><td rowspan="3"> ייצור 1. polyacrylamide המצע. </td><td> Coverglass לא ניתן להסיר הידרוג&#39;ל. </td><td> Overpolymerization. </td><td> מנמיכים פילמור זמן &lt;10 דקות (4 W / m 2). בדוק UV crossliפלט nker נמצא בטווח צפוי. </td></tr><tr><td> פילמור הידרוג&#39;ל polyacrylamide מסכן. </td><td> Underpolymerization. </td><td> הגדל זמן פילמור כדי&gt; 10 דקות (4 W / m 2). בדוק כי פלט UV crosslinker נמצא בטווח צפוי. </td></tr><tr><td> הידרוג polyacrylamide פגומים לאחר הסרת coverglass. </td><td> הידרוג polyacrylamide הרך הם קל לפגוע. </td><td> אנו צופים ירידת תשואת ייצור הידרוג&#39;ל (~ 50%) עבור הרך (כלומר, 4 kPa) הידרוג בפרט. טפל הידרוג בעדינות ולהגדיל מספר המתחיל להשיג תשואה רצויה. </td></tr><tr><td rowspan="2"> ייצור 2. של מערכים. </td><td rowspan="2"> מורפולוגיה נקודה מסכנה או לא עקבית. </td><td> פונקצית אדים עקבית. </td><td> בדקו אדים ו rheometer פונקציונלי לאורך כל מהדורה ולשמור 65% לחות יחסית. </td></tr><tr><td> סיכות תקועות ראש הדפסה או סותםGED. </td><td> נקה את ראש ההדפסה כדי לאפשר תנועה פינית בחינם. סיכות נקיות ביסודיות לפני או אחרי כל סיבוב הדפסה כדי להסיר אגרגטים מערוצים פיניים. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. תרבית תאים וביצוע Assay. </td><td rowspan="2"> ניתוק או מוות של תאים על מערכים לאחר מצורף ראשוני. </td><td> Overseeding ושגשוגם מוגזם. </td><td> הפחת צפיפות וזמן זריעה ראשונית. השתמש &quot;תחזוקה&quot; או &quot;בידול&quot; תקשורת במהלך התרבות מערך להפחית התפשטות תאים. </td></tr><tr><td> שחרור מונומר acrylamide הרעיל מן הידרוג&#39;ל. </td><td> משרים הידרוג ב DH 2 O לפחות 3 ד כדי לאפשר דיפוזיה / שחרור מונומר acrylamide ולהפחית רעילות לתא. </td></tr><tr><td rowspan="4"> תאים לא לצרף מערכים. </td><td> Underseeding. </td><td> גדל צפיפות וזמן זריעה ראשונית. השתמש בסוג התא חסיד ביתר שאת. </td></tr><tr><td> בתצהיר ירוד שלמטריקס או מצב biomolecule. </td><td> סיכות נקיות של חלקיקים אגרגטים, לאשר פרמטרים להדפסה, ולהעריך תצפית של סמני ניאון, למשל, dextran מצומדות rhodamine. </td></tr><tr><td> ספציפי של אינטראקציות התא-מטריקס. </td><td> סוגי תאים שונים לדבוק דווקא חלק אך לא חלבונים אחרים ECM. מבחן חלבוני ECM שונים מרובים עם התאים שלך. </td></tr><tr><td> אחסון מערך הכי מוצלח לאחר ייצור. </td><td> אנו ממליצים שישמרו מערכים מפוברקים לילה בשעת 65% לחות יחסית וטמפרטורה בחדר, בין שאר כדי למנוע שינויי שלב במהלך הקפאה. הידבקות תא רגישה הוא לחות, טמפרטורה, זמן אחסון; לוודא פרמטרים אלה עולים בקנה אחד / אופטימיזציה עבור הניסויים שלך. </td></tr><tr><td rowspan="2"> ניתוק של הידרוג&#39;ל מן מצע זכוכית במהלך תרבית תאים. </td><td> ניקיון silanization שקופיות מסכנים. </td><td> חלף פתרונות עובדים לניקוי שקופיותsilanization. </td></tr><tr><td> הידרוג&#39;ל Overdehydrated. </td><td> אל תשאירו הידרוג dehydrating על פלטה חשמלית למשך זמן ארוך יותר מאשר 15-30 דקות. </td></tr><tr><td> 4. ניתוח של נתונים. </td><td> שונות גבוהה בין כתמים ומגלשות לשכפל. </td><td> משתנה הוא ייצור מערך. </td><td> בדוק סיכות ראש ההדפסה הם נקיים. אשר פונקצית אדים. דמיינו ולכמת איכות ספוט מערך באמצעות סמנים ניאון. מערכי חנות כמומלצים לעיל. </td></tr></tbody></table> טבלה 1: פתרון בעיות.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces at JoVE.com

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  University of Illinois at Urbana–Champaign.  התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental....

Video: A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

שיטה חדשה ללוקליזציה חרוזי ניאון כתב סמוך לפני שטח תרבית תאים לגרירה מיקרוסקופית כוח

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...