עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר רפואי שוודית (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; יסודות Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, מרתה Lundqvist ו סיגורד och אלזה Goljes Minne; חברה שוודית לרפואה SLS-95151. פרופ &#39;ג&#39;ין ד בלוק, UCLA, היא הודתה בהכרת תודה על הערות מועילות על כתב היד. אנו מודים ד&quot;ר מיכאל Andäng וד&quot;ר הלנה Johard עבור חוסם את הערוץ HCN, פרופ &#39;עבד אל Manira לאספקת מיקרוסקופ וידאו. שיקולים אתיים: כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי קרולינסקה Institutet ו &quot;Norra של שטוקהולם Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. כל הניסויים בבעלי חיים מבוצעות מתוך כוונה למזער את כל הלחץ האפשרי או חוסר נוחות לבעל החיים.

<ol>
	<li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suprachiasmatic+nucleus:+cell+autonomy+and+network+properties.">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li><li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice.">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li><li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice.">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li><li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro.">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li><li>Moore, R. Y., Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system.">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , 13-15 (1991).</li><li>Pol, A. N. V. a. n. d. e. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat:+intrinsic+anatomy.">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats.">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li><li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. a. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+circadian+rhythms+in+c-fos+gene+expression+from+suprachiasmatic+nucleus+cultures.">Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures.</a> Curr Biol. 7, 758-766 (1997).</li><li>Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li><li>Yamazaki, S., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+luminescence+reporting+of+circadian+gene+expression+in+mammals.">Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals.</a> Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).</li><li>Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preparation+time+on+phase+of+cultured+tissues+reveal+complexity+of+circadian+organization.">Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization.</a> J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (1997).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).</li><li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker.">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li><li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+altered+period1+expression+in+the+suprachiasmatic+nuclei+of+Vipr2-/-+mice.">Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice.</a> J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+Period1+clock+gene+expression+in+NOS+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina.</a> Brain Res. 1050, 101-109 (2005).</li><li>Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+clock+nucleus:+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light.">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li><li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization.">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li><li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus.">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li><li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats.">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li><li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro.">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li><li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons.">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li><li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation.">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins.">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li><li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro.">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li><li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo.">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יתרונות וחסרונות עם טכנולוגיית הכתב בלוציפראז בניגוד לשיטות לשעבר vivo, כגון RT-PCR, ב הכלאה באתרו כתם המערב שדורשים דגימה רקמה על רבים בנקודות זמן שונות (מתן החלטה זמן נמוכה בדרך כלל 2-4 שעות, תלוי תדר הדגימה) כדי ללמוד יומי וריאציות ביטויי גנים וחלבונים, הטכנולוגיה מאפשרת כתב בלוציפראז ברזולוציה גבוהה (10-10 דקות) מחקרים של תנודות היממה במשך ימים רבים בהכנת אותו. מחקרים לכן, את מספר בעלי החיים המשמשים ממוזער ומפורט של השפעות על שלב ותקופת קצב הם ריאלי, אשר בדרך כלל אינו אפשרי תוך שימוש בטכניקות דגימה קונבנציונלי עם רזולוציה נמוכה זמן. עם זאת, אף על פי מדידות האמפליטודה היחסית של קצב אפשריים, יש להדגיש כי הטכנולוגיה הכתב אינו כמותי ולכן יכול לא להשתמש כדי למדוד כמויות של גנים או חלבונים עיבד המתורגם. ההקלטות רקמה ניתן להתחיל לנתח מיד לאחר culturing, יתרון גדול עבור ישירות לומד המולקולרי של תופעות של מתח vivo, in vivo אור-Induced משמרות שלב וכו &#39;תרבות SCN organotypic מאפשר לטווח ארוך (שבועות) מניפולציה תרופתי של המוח המבוגר רקמה המכילה מערך שלם הסינפטי בוגרת הטכנולוגיה כתב בלוציפראז מאפשר הקלטות יציבה במשך שבועות רבים. לפיכך, הרקמה לא צריך להיות לאחר הלידה בילוד או מוקדם כדי להשיג תרבויות בריא, בניגוד לטיפולים תרופתיים כרונית חריפה פרוסה יכול להתבצע. בניגוד לכתב פלסמיד-transfections בתרביות תאים, אשר אין לעשות להוביל שילוב של ה-DNA לתוך הגנום, מהונדס בלוציפראז דגמים בעלי חיים (כמו גם lenti וירוס transfections) הם נוחים אם שינויים epigenetic הם להיחקר. ראוי בהקשר זה גם לציין כי הדמיה הארה היא כיום אפשרי עם רגישות גבוהה מצלמות CCD 11, המאפשר הקלטות גם נוירונים SCN יחיד (~ 60-10 מיקרומטר) ואת סוגי תאים אחרים, מנוצל על ידי מעבדות מרכזי לימוד מקצבים היממה. לבסוף, החוקרים היממה כמה נפוץ השימוש ניטור הביטוי מולקולריים באמצעות כתבים אחרים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, כדי ללמוד בגן השעון / תנודות חלבון 16-19. היבטים של עובי פרוסת עוביים המליצה פה של הפרוסה SCN (200-300 מיקרומטר) יכול להיות מופחת או מוגבר אם תרצה בכך. עם זאת, למרות רקמת משתטחת על קרום אחרי כמה ימים בתרבות, לא מומלץ לעלות על 500 מיקרומטר עובי של הפרוסה לחתוך תחילה כדי לשמר יכולת הקיום של הרקמה 7. פרוסה דק יותר הוא 100 מיקרומטר סיבות מכניות ומעשי קשה להתמודד. מכיוון רקמת SCN הטרוגנית עובי של הפרוסה עשויים להשפיע על השלב של אות פלט בלוציפראז, שכן אזורים שונים בתוך SCN (למשל את &quot;הליבה&quot; מול &quot;קליפה&quot;, ואזורים הגב לעומת הגחון) להתנדנד עם שלבים שונים 20 ו דיפרנציאלי מחדש לסנכרן לאחר שלב משמרות 21. עובי של הפרוסה משפיע גם על בסיס של פוטון לספור מאז רקמות פולט יותר מספר גדול יותר של פוטונים. המשרעת של תנודות מולקולריות יכול בדרך זו בעקיפין להיות מושפע גודל explant. מסיבות אלה, מלאה תרבויות התייחסו תמיד צריך להיות באותו עובי של גודל, המכילים את אותו אזור של SCN מנת להתנדנד בשלב אותו עם אמפליטודה זהה. שני גרעינים חד צדדית, מצד שני, להתנדנד בשלב אחד עם השני ועם אמפליטודות דומה עוד לחתוך vibratome הוא אופקי ולא זוויתי (אשר בתורו תלוי כי ההפרדה בין המוח הקטן לחתוך את שתי ההמיספרות הוא בניצב על פני השטח טבלה). החוקר אשר מבצע culturing SCN יכול לחוות תרבויות SCN לא להתנדנד בשלב אחד עם השני. תרגול סטנדרטיזציה של הטכניקה חיתוך, כלומר את הפרוסות נחתכות תמיד ברמה rostro-הזנב אותו SCN, תשפר את התוצאה. צעדים קריטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אספקת החמצן הוא קריטי. מכיוון שהמוח דורש הרבה חמצן 22, ההליך חיתוך צריך להיות מהיר (ככל 3.1-3.10 הוא ~ 5-6 דקות זה יותר טוב כדי לשמור על הרקמה הבריאה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCN הוא רגיש לשינויי טמפרטורה וחילופי בינוני. SCN הוא רגיש לשינויי טמפרטורה הטמפרטורה גדול יכול להסיט את שלב קוצב לב ולגרום ממצאים ניסיוניים 23. אם בינוני או פתרונות מוחלפים או הוסיף במהלך ניסוי מתמשך, למשל כאשר החלים תרופה אחרי כמה ימים בתרבות, הבינוני או solution צריך להיות מחומם מראש ל 36-37 ° C (הטמפרטורה זהה בתא) לפני כן. בניסויים פרמקולוגיים הכוללים חילופי בינוני, חשוב תמיד לעבוד עם מדיום מראש מותנה תרבית תאים. תוספת / לשטוף החוצה עם טרי, בינוני מותנית עלולה שלב משמרת את הקצב SCN מולקולריים 24, כמו גם סוג תא אחר תרבויות 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני הרכב. חשוב בתרבות רקמות pH osmolality הנכונים. בינוני אוויר חציצה מכיל כמות גדולה של HEPES, אשר בעל קיבולת חיץ אופטימלי בטווח של 6.8-8.2 pH ו מתאים גם חציצה השינויים pH שעלולות להתרחש כתוצאה הנשימה בתא. HEPES, מצד שני, הוא רגיש יותר לשינויי טמפרטורה לעומת סודיום ביקרבונט, הכלולה בכמויות קטנות ובינוניות התרבות. סודיום ביקרבונט בעל קיבולת חציצה גדולה יותר ב-pH נמוך יותר (5.1-7.1) טווח 26, המתאימה ובכך באווירה CO 2. עם זאת, כמויות גדולות יותר של סודיום ביקרבונט במדיום אוויר חציצה (DMEM 2902) מגדילה את osmolality משמעותית ולא ניתן להוסיף בו זמנית ללא דילול בינוני, שבתורה גוררת בהרכב נכונה של חומצות אמינו, ויטמינים יונים. עצות להכנת בינוני: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הייה מדויק וזהיר כאשר ערבוב הבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פתרונות מניות טרי או מופשר רק עתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של osmolality גבוהה מאוד זה לא שווה דילול. יותר מ 5-6%, בדילול בינוני סביר להניח שלא לעבוד. שימוש D-גלוקוז להגדיל osmolality אם היא נמוכה מדי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב משמרות עקב זמן ההכנה זמן הכנה פרוסה היא קריטית. השפעה מינימלית על אפס או שלב מתקבל אם ההליך פרוסה מתבצע בין ZT דצמבר 06-12. והניתוחים כל פרוסה צריכה להתבצע בשלב זהה של מחזור יומי או היממה כדי למזער שגיאות עקב וריאציה בין שלב ההכנות. </li></ol> שינויים אפשריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור electrophysiology SCN חריפה, החיתוך צריך להתבצע עם Ringer (מלאכותית נוזל השדרה Cerebro; ACSF) חוצץ, רווי חמצן (95% O 2, 5% CO 2) לפני תחילת חיתוך. יתר על כן, חמצן צריך להוסיף ברציפות למאגר במהלך ההליך כולו חיתוך, כמו הפעילות החשמלית הסינפטי תלויה ישירות על אספקת חמצן 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות אופקי sagittal יכול גם להיות מוכנים בהצלחה תרבותי של SCN. המחברים יש ניסיון עם הקלטות בלוציפראז ב פרוסות אופקיות, אשר על פי הניסיון שלנו לתת תנודות היממה עם משרעת נמוכה יותר בהשוואה לחתוך את העטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCN הוא כ 1 מ&quot;מ ארוך rostro-caudally ואת טכניקת חיתוך המתואר כאן הוא ממוקד כלפי רכישת סעיף SCN באזור המרכז. עם זאת, אחד או יותר סעיף SCN ניתן להשיג עכבר מוח החולדה, המאפשר חקירה של ביטוי גנים / חלבונים היממה ברמות מקורי יותר מול הזנב של הגרעין SCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות Slice מבעלי חיים הצעיר, הגורים לאחר הלידה, או אפילו עוברים, יכול גם להיות מוכנים. שים לב המוח לגולגולת גורים צעירים מאוד רכים מאוד רגיש. בנוסף, עצב הראייה הוא דק ולא מפותחת. קח זהירות בעת לנתח את המוח של הגורים כל כך את האזור SCN אינו פגום. למשל, מיקרו כלים rongeur לא ניתן להשתמש כדי לפתוח את הגולגולת של גורים העכבר כי הם גדולים מדי. מספריים פיין הם מספיק כדי לחתוך את הרקמות הרכות של גורים צעירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזכוכית המכסה טכניקה המבוססת תרבות המתואר כאן יכול לשמש גם כדי הארה תמונה באמצעות מצלמה CCD / EM-CCD, גם בנוירונים SCN יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית ורקמות איברים מן הפריפריה מהונדס PER2:: בעלי חיים לוק יכול בקלות לקבל, תרבותי ניתח במונחים של תנודות מולקולריות, כמו PER2: הביטוי לוק ממשיך להתנדנד במשך ימים רבים גם במספר רקמות אחרות תא 10 סוגים. רוב אלה ברקמות הפריפריה, על הכבד, למשל, אינם דורשים קרום להישרדות אך במקום מתורבת טובל ישירות 11 בינוני. שים לב כי בשלב הסטה עקב חתך, culturing וחילופי בינוני לא יכול לעקוב אחר אותם עקרונות כמו SCN. </li></ol> משמעות בשנת עכבר מהונדס ועל זני חולדה (mPER2: לוק; mPer1 לוק 8, 10, 27) פעילות האנזים בלוציפראז משקף חלבון או ביטוי גנים מקצבים ניתן להעריך על ידי הקלטה פליטת אור. פליטת אור בלוציפראז שנוצר נותן אות חלש אבל הארה הרקע הוא קרוב לאפס, מה שהופך שיטה זו יתרון. יתר על כן, כי המולקולה אינה יציבה בלוציפראז ו מושפל במהירות יש ph לאototoxicity, אשר יכול להופיע במהלך תאורה לטווח ארוך מעורר 28. יחדיו, תכונות אלו מאפשרות לטווח ארוך ביצוע ניסויים בטכנולוגיה כתב בלוציפראז יתרון מאוד במחקר היממה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>B27 supplement 50x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
<td>40#1</td>
<td>&#8776; 40 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture membranes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICMORG50</td>
<td>0.4 &mu;m</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM low glucose w/o phenol red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D2902</td>
<td>Powder for 1L</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1003 055</td>
<td>&#8776; 55 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filtration set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431097</td>
<td>Pore size 0.22 &mu;m
Polyethersulfone</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>0203-7-PS</td>
<td>Dumant #7</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15630-056</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS 10x</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco </td>
<td>14065-049</td>
<td>500 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>NaOCH3 7.5%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>25080-060</td>
<td>50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Luciferin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1602</td>
<td>Beetle luciferin, potassium salt</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro rongeur tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Allgaier Instrumente</td>
<td>332-097-140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U/ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>100 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430165</td>
<td>&#8776; 35 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>PMT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>H9319-11MOD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable scalpels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Paragon</td>
<td>P503</td>
<td>Size 11</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher </td>
<td>09-761-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vacuum grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>50 g</td>
</tr>
<tr>
<td>Vibratome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus

השעון הביולוגי המרכזי (~ 24 שעות) תיאום מקצבים יומיים פיסיולוגיה והתנהגות מתגורר גרעין suprachiasmatic (SCN) הממוקם בהיפותלמוס הקדמי. השעון מסונכרן ישירות על ידי אור דרך הרשתית ועצב הראייה. תנודות היממה מופקים על ידי אינטראקציה לולאות משוב שלילי של מספר &quot;גנים של השעון&quot; מה שנקרא מוצרי החלבון שלהם, כולל התקופה (פר) גנים. השעון הליבה תלוי גם שלילת קוטביות הממברנה, סידן cAMP 1. SCN מראה תנודות יומי בביטוי שעון הגן, פעילות מטבולית לבין פעילות חשמלית ספונטנית. למרבה הפלא, זו פעילות מחזורית אנדוגני נמשכת פרוסות הרקמה הבוגרת SCN 2-4. בדרך זו, השעון הביולוגי יכול בקלות להיות למד במבחנה, המאפשר חקירות מולקולרית, אלקטרו ומטבוליים של פונקציית קוצב לב. SCN הוא קטן, מוגדר היטב מבנה דו ממוקם ממש מעל התצלובת האופטית 5. בשנת החולדה היא מכילה ~ 8.000 נוירונים בגרעין כל יש ממדים של כ 947 מיקרומטר (אורך ציר rostrocaudal) x 424 מיקרומטר (רוחב) x 390 מיקרומטר (גובה) 6. כדי לנתח את SCN יש צורך לחתוך פרוסת המוח ברמה מסוימת של המוח שבו ניתן לזהות SCN. כאן, אנו מתארים את הליך הניתוח, חיתוך של SCN, אשר דומה העכבר מוחות העכברים. יתר על כן, אנו מראים כיצד תרבות רקמות גזור organotypically על קרום 7, טכניקה שפותחה על ידי התרבות רקמת SCN ימזאקי et al. 8. לבסוף, אנו מדגימים כיצד רקמה מהונדס יכול לשמש למדידת ביטוי של גנים של השעון / חלבונים באמצעות כתב דינמי טכנולוגיה בלוציפראז, שיטה במקור שימש למדידות היממה על ידי Geusz et al. 9. אנחנו כאן להשתמש ברקמות SCN מן מהונדס עקום ב PERIOD2: עכברים בלוציפראז המיוצר על ידי יו ואח&#39; 10.. העכברים מכילים חלבון היתוך תקופה (PER) 2 ו בלוציפראז אנזים הגחלילית. כאשר PER2 מתורגם בנוכחות המצע עבור בלוציפראז, כלומר luciferin, הביטוי PER2 ניתן לנטר כמו פליטת אור כאשר בלוציפראז מזרז חמצון של luciferin. מספר הפוטונים הנפלטים חיובי בקורלציה לכמות חלבון המיוצר PER2, לבין מקצבים פליטת אור להתאים את קצב חלבון PER2 in vivo 10. בדרך זו וריאציה מחזורית בביטוי PER2 ניתן לפקח באופן רציף בזמן אמת במהלך ימים רבים. הפרוטוקול אנו עוקבים עבור culturing רקמות בזמן אמת, הקלטה פליטת אור תוארה באופן יסודי על ידי ימזאקי ו טקהאשי 11.

Watch this Scientific Journal Video about Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus at JoVE.com

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

הליך של הכנת פרוסות המכיל את עכבר מבוגר ההיפותלמוס גרעין suprachiasmatic (SCN), ודרך מהירה לתרבות רקמת SCN במצב תרבות organotypic, הם דיווחו. יתר על כן, במדידה של הגן oscillatory ביטוי חלבון שעון דינאמי באמצעות כתב הטכנולוגיה בלוציפראז מתואר.

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.0K Views.  Karolinska Institutet. הליך של הכנת פרוסות המכיל את עכבר מבוגר ההיפותלמוס גרעין suprachiasmatic (SCN), ודרך מהירה לתרבות רקמת SCN במצב תרבות organotypic, הם דיווחו. יתר על כן, במדידה של הגן oscillatory ביטוי חלבון שעון דינאמי באמצעות כתב הטכנולוגיה בלוציפראז מתואר.

Video: Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

הקלטה וניתוח של מקצבי יממה בריצת גלגל פעילות במכרסמים

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the stimulation parameters (e.g., orientation, field strength, and stimulation duration) need to be examined in mice brain slice preparations. Testing and arranging the orientation of the electrode relative to the position of the mice brain slice are feasible. The present method preserves the thalamocingulate pathway to evaluate the effect of DCS on anterior cingulate cortex seizure-like activities. The results of the multichannel array recordings indicated that cathodal DCS significantly decreased the amplitude of the stimulation-evoked responses and duration of 4-aminopyridine and bicuculline-induced seizure-like activity. This study also found that cathodal DCS applications at 15 min caused long-term depression in the thalamocingulate pathway. The present study investigates the effects of DCS on thalamocingulate synaptic plasticity and acute seizure-like activities. The current procedure can test the optimal stimulation parameters including orientation, field strength, and stimulation duration in an in vitro mouse model. Also, the method can evaluate the effects of DCS on cortical seizure-like activities at both the cellular and network levels.

Studies have shown that cathodal transcranial direct-current stimulation can produce suppressive effects on drug-resistant seizures. In this study, an in vitro experimental setup was devised in which the direct-current stimulation and multielectrode array recording of seizure-like activity were evaluated in mice brain slice preparation. The direct-current stimulation parameters were evaluated.