1. כלי ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל spectrofluorometer ולאפשר להתחמם במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ב-Excel ליצור קובץ עם תקנים נתונים לדוגמה, כפי שמוצג באיור 1 ולשמור אותו סי.אס. &quot;csv&quot; פורמט. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. לתקנים נתוני דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת fluorometer כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="סמל 1" /> כפתור זה ייפתח חלון שיטת ניתוח, באיור 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שיטת ניתוח חלון, הכרטיסייה כללי. בצע את הבחירות הבאות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;מדידה&quot;, בחר photometry מ למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;מפעיל&quot;, להזין את שם המפעיל המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין צורך להזין מידע בשדה &quot;כלי&quot;. זו נבחרת באופן אוטומטי על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השדה &quot;דגימה&quot; אינו פעיל בעת שימוש בקורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן הערות אשר ייתכן שתרצה לכלול בדוח בשדה &quot;הערות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;אביזרים&quot;, להזין מידע הקשור האביזרים המשמשים לבדיקה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה הכפתורים בצד ימין של החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפתור &quot;טען&quot; מאפשר טעינה שיטות ניתוח שנשמרו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;שמור&quot; כפתור המאפשר עדכון סדרה של פרמטרים מבחן או שיטת ניתוח הציל בעבר נטען, תוך שימוש באותו שם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;שמור בשם&quot; כפתור מאפשר חיסכון קבוצה חדשה של פרמטרים מבחן או שיטת ניתוח בשם הרצוי. </li></ul> כעת לחץ על הלשונית &quot;quantitation&quot;, ראה איור 3 ולעשות את הבחירות הבאות. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. שיטת ניתוח חלון, לשונית quantitation. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;סוג quantitation&quot;, בחר אורך גל. זה מצביע על קריאה הקרינה ייעשה באמצעות הגל הנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;סוג כיול&quot;, בחר 1 כדי st. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;מספר אורכי גל&quot;, בחר 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;יחידת ריכוז&quot;, הזן ng / mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את תיבות נבחר עבור &quot;כיול ידני&quot; ו &quot;עקומת כוח דרך אפס&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;ספרות אחרי הנקודה העשרונית&quot; שדה, בחר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;הגבלהתחתונה ריכוז&quot; שדה, הזן 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;ריכוז גבול עליון, הזן 10000. </li></ul> כעת לחץ על הלשונית &quot;כלי&quot; ולעשות את הבחירות הבאות. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. שיטת ניתוח חלון, בכרטיסיה כלי <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;מצב נתונים:&quot; את השדה, בחר פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;מהירות קיצוץ&quot; השדה אינו פעיל בשלב זה, הוא משמש רק עבור מדידות זרחני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה מצב &quot;אורך גל&quot;, בחר גם קבוע WL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;EX / WL1&quot; להיכנס 480nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;EM / WL1&quot; שדה להיכנס 520nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל השדות האחרים תחת EX ו EM אינם פעילים בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;EX סדק&quot; לבחור 5.0nm מ למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;א.מ. סדק&quot; לבחור 5.0nm מ למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו נבחר בתיבת מול &quot;מתח PMT 1-1000V&quot; את השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;PMT מתח&quot;, בחר 700V מ למשוך למטה בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;calc סטטיסטי אוטומטי. מספר&quot; בשדה לבחור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;משכפל&quot; לבחור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;זמן אינטגרציה&quot;, בחר 0.1s. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;עיכוב&quot; הזן או בחר 0s. </li></ul> לחץ על לשונית &quot;צג&quot;. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. שיטת ניתוח חלון, הכרטיסיה צג. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;ציר Y&quot;, &quot;מקס:&quot; שדה, בחר 10000 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב &quot;ציר Y&quot;, &quot;מינימום:&quot; שדה, בחר 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בתיבה משמאל את &quot;פתח עיבוד נתונים לאחר רכישת נתונים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו נבחר את תיבת משמאל &quot;הדו&quot;ח הדפסת לאחר רכישת נתונים&quot;, אלא אם כן אתה רוצה לדווח תודפס באופן אוטומטי לאחר קריאות הושלמו. </li></ul> לחץ על הכרטיסייה &quot;הדוח&quot;, ראה איור 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6. שיטת ניתוח חלון, Tab דוח. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשדה &quot;פלט&quot;, בחר דוח הדפסה מתוך למשוך למטה בתפריט. אתה יכול גם לבחור &quot;השתמש ב-Microsoft Excel&quot; אם אתה רוצה לייצא את הנתונים ל-Excel, או &quot;הדפסה השתמש מחולל גיליון&quot; אם באמצעות להוסיף אופציונלית על מחולל דוחות תוכנית אשר תאפשר הפקת דוחות בהתאמה אישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תיבות עבור הפריטים שברצונך לכלול בדוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור את כל הפרמטרים שנבחרו בכרטיסיות שונות של החלון &quot;שיטת ניתוח&quot;, לחץ שוב על הכרטיסייה &quot;כללי&quot; ולשמור אותם תחת שם הקובץ במיקום שבו אתה יכול למצוא אותם לשימוש עתידי, ולחץ על &quot; אישור &quot;כדי לסגור את החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה משלים את הגדרת פרמטרים של מכשיר הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת נוכל להגדיר את הקורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="סמל 2" /> כפתור, אשר יביא את חלון ההתקנה MPR על העליונה. </li></ul> בחר בארות עבור התקנים דוגמאות בכרטיסייה חלון / פלייט ההתקנה MPR, כפי שמוצג באיור 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="איור 7" /> איור 7. MPR חלון ההתקנה, הכרטיסייה פלייט. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על המיקום A1 ו לגרור את העכבר כדי E1, ואז ללחוץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="סמל 3" /> כפתור. זה יבחר את העמדות לשמש הסטנדרטים. עמדות אלו יודגשו בצבע ירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו אנחנו צריכים לבחור F1 עמדות H3 עבור הדגימות. לחץ וגרור את העכבר החל F1 עמדה, לעמדה H3 ולאחר מכן לחץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="סמל 4" /> כפתור, זה ידגיש את עמדות בצבע צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז לחזור על הפעולה זהה עבור עמדות A2 ל-E3, כדי לבחור אותן עמדות למדידות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, בואו לטעון את הקובץ מופרדים בפסיקים הקובץ משתנה (CSV) שהוכן מראש עם לתקנים מידע לדוגמא. </li></ul> לחץ על הכרטיסייה &quot;ובכן מידע&quot; של &quot;חלון MPR ההתקנה&quot;, כפי שמוצג באיור 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="איור 8" /> איור 8. MPR חלון ההתקנה, הכרטיסיה פרטי טוב. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לחץ על <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="סמל 5" /> כפתור. חלון Windows Explorer יפתח אשר כפי שמוצג באיור 9, אשר יאפשר איתור &quot;ובכן information.csv&quot; קובץ וטעינה בו. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="איור 9" /> איור 9. טעינת מידע מדגם היטב. לאחר טעינת הקובץ &quot;ובכן מידע&quot;, &quot;מידע טוב&quot; ייראה כפי שמוצג באיור 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="איור 10" /> איור 10. מידע טעון מדגם היטב. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. לדוגמה Picogreen Assay הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1X TE חוצץ (10 mM טריס-HCl, 1 mM EDTA) על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 20 X TE הצפתעד 19 מ&quot;ל di H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PicoGreen מגיב על ידי הוספת 50 μL 200 X מגיב PicoGreen עד 9.95 הצפת מ&quot;ל 1 X TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תקנים (Lambda dsDNA) על ידי ביצוע דילולים הסידורי של המניות dsDNA (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל). ראשית להכין תמיסה של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​dsDNA ידי הוספת 25 μL של המניה dsDNA (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו -25 הצפת μL 1 x TE. ואז להכין את פתרונות סטנדרטיים על ידי הוספת כמויות המצוין של dsDNA ו חיץ כמפורט בטבלה שלהלן: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריכוז dsDNA </td><td> נפח dsDNA </td><td> נפח של הצפת </td></tr><tr><td> 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 20 μL של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​dsDNA </td><td> 980 μL 1 X TE הצפת </td></tr><tr><td> 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 100 μL של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​dsDNA </td><td> 900 μL 1 X TE הצפת </td></tr><tr><td> 0.01 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 100 μL של 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​dsDNA </td><td> 900 μL 1 X TE הצפת </td></tr><tr><td> 0.001 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> 100 μL של 0.01 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​dsDNA </td><td> 900 μL 1 X TE הצפת </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. מדידה לתקנים Fluorescence לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 150 μL של תקן זה לתוך בארות A1-E1 של צלחת 96 היטב, לכל איור 7, ועל פי הטבלה הבאה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טוב </td><td> תקן </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0.01 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0.001 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TE הצפת </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 150 דגימות ידוע μL לתוך בארות F1 כדי H3, שמוצג באיור 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים פתרון PicoGreen מוכן בשלב 1.2 לתוך שוקת מיועד לשימוש רב ערוצי פיפטה. השתמש פיפטה רב ערוצי לספק 150 μL פתרון PicoGreen לבארות A1-H3. מערבבים פתרון תקני בעדינות עם פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת באזור חשוך להמתין 2-5 דקות תגובה לפתח. </li></ol> 4. נציג תוצאות עקומת כיול טוב מוערך באמצעות פרמטרים שונים הניתנים על ידי תוכנת ה-F-7000 על מדידה של סטנדרטים החישוב של עקומת הכיול על ידי התוכנה. מקדם נחישות מציין את מטיב ההתאמה של הסטנדרטים נמדד עקומת כיול מחושב. ככל ערך זה היא &quot;1&quot;, טוב יותר את ההתאמה של הערך הנמדד ואת עקומת כיול. אם הערך הוא רחוק מלהיות &quot;1&quot;, סטנדרטים חייבים להיות נמדד מחדש, מוכן שוב, או הכושר של עקומת הכיול השתנה. איור 11 מציג דוגמה של עקומת כיול עם מקדם נחישות מחושב = 0.99993, השיג עבור כימות dsDNA PicoGreen באמצעות צבע. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="איור 11" /> איור 11. דוגמה של עקומת כיול dsDNA.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li></ol>

לואיס מורנו א ו ל קנדרה קוקס מועסקים על ידי Hitachi גבוהה טכנולוגיות אמריקה המייצרת את המכשיר משמש במאמר זה.

Pipetting זהירות במהלך הכנת המדגם, וכן באמצעות ספקטרופוטומטר הקרינה יציבה רגיש חיונית להשגת תוצאות טובות לשחזור. במקרה של ספקטרופוטומטר את הקרינה משמשים מבחן זה, הוא הציע להשתמש מדגם 300 μL נפח הסופי הקורא microplate. נפח נמוך מקטין את רגישות, נפח גדול יותר עלול לגרום לזיהום הכלאה בין בארות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Distilled H2O</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>P7589</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>237108</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12 Channel Eppendorf Micropipette</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3516677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1000 &mu;L Eppendorf Pipette</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>200 &mu;L Eppendorf Pipette </td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mL serological pipet</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum foil</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette tips</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5J1-0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microplate Reader Accessory for F-7000</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5J0-0139</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of dsdna using the hitachi f-7000 fluorescence spectrophotometer and picogreen dye

כימות של ה-DNA, בעיקר בריכוזים קטנים, היא משימה חשובה עם מגוון רחב של יישומים ביולוגיים כולל תקן מבחני ביולוגיה מולקולרית כגון סינתזה וטיהור של ה-DNA, אבחון יישומים כגון כימות של מוצרי הגברה DNA, גילוי של מולקולות דנ&quot;א סמים ההכנות. במהלך וידיאו זה נדגים את היכולת של ספקטרופוטומטר Hitachi F-7000 Fluorescence מצויד אביזר Micro Reader פלייט לבצע כימות dsDNA באמצעות בדיקות מולקולריות קוואנט, זה PicoGreen ערכת צבע מגיב. ספקטרופוטומטר F-7000 Fluorescence מציעה רגישות גבוהה מדידות מהירות גבוהה. זוהי מערכת גמישה המסוגלת מדידת הקרינה, הארה, זרחני. מספר מצבי מדידה זמינים, כולל גל סריקה, סריקה בזמן, photometry ו 3-D מדידה סריקה. ספקטרופוטומטר יש רגישות בטווח של 50 picomoles של והעמסת בעת שימוש בנפח 300 מדגם μL ב microplate, והוא מסוגל למדוד מהירות סריקה של 60,000 ננומטר / דקה. כמו כן, יש טווח דינמי רחב של עד 5 סדרי גודל המאפשר שימוש של עקומות כיול על פני טווח רחב של ריכוזים. מערכת אופטית משתמשת בכל אופטיקה רעיוני לאנרגיה רגישות מקסימלית. טווח אורך הגל הסטנדרטי הוא 200-750 ננומטר, ניתן להרחיב 900 ננומטר, כאשר באחת photomultipliers אופציונלי אינפרא אדום הקרוב. המערכת מאפשרת בקרת טמפרטורה אופציונלי עבור הקורא צלחת 5-60 מעלות צלזיוס בטמפרטורה באמצעות אופציונלי חיצוני מבוקר circulator נוזלי. הקורא microplate מאפשר שימוש של 96 microplates היטב, את מהירות המדידה עבור 96 בארות הוא פחות מ 60 שניות בעת שימוש במצב קינטיקה. שולטת תוכנה עבור ה-F-7000 ו microplate Reader הם גם גמישה. דוגמאות ניתן להגדיר פורמטים או עמודה או שורה, וכן כל שילוב של בארות עשוי להיבחר מדידות מדגם. זה מאפשר ניצול אופטימלי של microplate. בנוסף, התוכנה מאפשרת ייבוא ​​מיקרו מדגם צלחת תצורות שנוצרו ב-Excel שנשמרו ערכים מופרדים בפסיקים, או &quot;csv&quot; פורמט. תצורות microplate מדידה ניתן לשמור נזכר על ידי התוכנה לנוחות ויעילות מוגברת. תוצאות הנתונים יכול להיות פלט דיווח סטנדרטי, ל-Excel, או תוכנית דווח אופציונלי גנרטור.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye at JoVE.com

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

הפגנה של כימות dsDNA באמצעות מולקולרית בדיקות PicoGreen לצבוע Hitachi ו-F-7000 ספקטרופוטומטר Fluorescence מצויד אביזר microplate הקורא.

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

24.5K Views.  Hitachi High Technologies America. הפגנה של כימות dsDNA באמצעות מולקולרית בדיקות PicoGreen לצבוע Hitachi ו-F-7000 ספקטרופוטומטר Fluorescence מצויד אביזר microplate הקורא.

Video: Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and research of illumination, AV equipment, organic EL material, films, filters and fluorescent probes for bio-industry.
Quantum yield is calculated as the ratio of the number of photons absorbed, to the number of photons emitted by a material. The higher the quantum yield, the better the efficiency of the fluorescent material.
For the measurements featured in this video, we will use the Hitachi F-7000 fluorescence spectrophotometer equipped with the Quantum Yield measuring accessory and Report Generator program. All the information provided applies to this system. 
Measurement of quantum yield in powder samples is performed following these steps:
<ol>
 <li>Generation of instrument correction factors for the excitation and emission monochromators. This is an important requirement for the correct measurement of quantum yield. It has been performed in advance for the full measurement range of the instrument and will not be shown in this video due to time limitations.</li>
 <li>Measurement of integrating sphere correction factors. The purpose of this step is to take into consideration reflectivity characteristics of the integrating sphere used for the measurements.</li>
 <li>Reference and Sample measurement using direct excitation and indirect excitation.</li>
 <li>Quantum Yield calculation using Direct and Indirect excitation. Direct excitation is when the sample is facing directly the excitation beam, which would be the normal measurement setup. However, because we use an integrating sphere, a portion of the emitted photons resulting from the sample fluorescence are reflected by the integrating sphere and will re-excite the sample, so we need to take into consideration indirect excitation. This is accomplished by measuring the sample placed in the port facing the emission monochromator, calculating indirect quantum yield and correcting the direct quantum yield calculation.</li>
 <li>Corrected quantum yield calculation.</li>
 <li>Chromaticity coordinates calculation using Report Generator program.</li>
</ol>
The Hitachi F-7000 Quantum Yield Measurement System offer advantages for this
application, as follows:
<ul>
 <li>High sensitivity (S/N ratio 800 or better RMS). Signal is the Raman band of water measured under the following conditions: Ex wavelength 350 nm, band pass Ex and Em 5 nm, response 2 sec), noise is measured at the maximum of the Raman peak. High sensitivity allows measurement of samples even with low quantum yield. Using this system we have measured quantum yields as low as 0.1 for a sample of salicylic acid and as high as 0.8 for a sample of magnesium tungstate.</li>
 <li>Highly accurate measurement with a dynamic range of 6 orders of magnitude allows for measurements of both sharp scattering peaks with high intensity, as well as broad fluorescence peaks of low intensity under the same conditions. </li>
 <li>High measuring throughput and reduced light exposure to the sample, due to a high scanning speed of up to 60,000 nm/minute and automatic shutter function. </li>
 <li>Measurement of quantum yield over a wide wavelength range from 240 to 800 nm.</li>
 <li>Accurate quantum yield measurements are the result of collecting instrument spectral response and integrating sphere correction factors before measuring the sample.</li>
 <li>Large selection of calculated parameters provided by dedicated and easy to use software.
</li>
</ul> 
During this video we will measure sodium salicylate in powder form which is known to have a quantum yield value of 0.4 to 0.5.

In this video we will demonstrate measuring and calculating absolute quantum yield and chromaticity coordinates directly in powder samples using the Hitachi F-7000 Quantum Yield Measuring System.

מדידה אבסולוטית קוונטית תשואה של דוגמאות אבקת

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis algorithms which can be used effectively to count various biological particles. When counting large numbers of cell samples, the hemocytometer presents a bottleneck with regards to time. Likewise, counting membranes from migration/invasion assays with the ImageJ plugin Cell Counter, although accurate, is exceptionally labor intensive, subjective, and infamous for causing wrist pain. To address this need, we developed two plugins within ImageJ for the sole task of automated hemocytometer (or known volume) and migration/invasion cell counting. Both plugins rely on the ability to acquire high quality micrographs with minimal background. They are easy to use and optimized for quick counting and analysis of large sample sizes with built-in analysis tools to help calibration of counts. By combining the core principles of Cell Counter with an automated counting algorithm and post-counting analysis, this greatly increases the ease with which migration assays can be processed without any loss of accuracy.

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

ויזואליזציה, כימות פוטנציאל בידול Adipogenic תא Mesenchymal עם סמן ספציפי שושלת היוחסין

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...