פרוטוקול זה מסייע לך לזהות מוטציות המתרחשות במהלך תיקון של שבר דו-גדילי המושרה על-ידי RNA ו-CAS9 חד-כיווניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזוהי דרך חסכונית וחזקה לזהות מוטציות בלוקוס גנומי מסוים. אנו משתמשים בקרטינוציטים אנושיים כדוגמה, אך פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל קווי תאים הניתנים להעברה.
מי שידגים את הפרוטוקול הזה יהיה טיילור בוגבי, עוזר לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, תרבית HFK LXSN ותאי HFK 8E6 בלוחות 10 ס"מ ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני בחממת ז'קט המכילה מדיה של תרבית קרטינוציטים עם תוסף גדילה קרטינוציטים אנושי ו-1%פניצילין סטרפטומיצין. החליפו את המדיה התרבותית בשלושה מיליליטרים של טריפסין-EDTA ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.
לאחר מכן, נטרל את הטריפסין עם נפח שווה של מדיה בתוספת FBS. כעת, העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-300 פעמים G למשך חמש דקות. להשעות מחדש תאים עם 10 מיליליטרים של מדיה תרבית קרטינוציטים עם תוסף גדילת קרטינוציטים אנושי ולקבוע את ריכוז התאים עם המוציטומטר.
לאחר מכן, זרעו שתי צלחות כל אחת עבור תאי HFK LXSN ו-HFK 8E6 בארבעה מיליליטרים של תרבית קרטינוציטים עם תוסף גדילה קרטינוציטים אנושי ו-1%פניצילין סטרפטומיצין. לאחר הזריעה, הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור ז'קט. ביום הטרנספקציה, החליפו את המדיה בשלושה מיליליטרים של מדיה ללא אנטיביוטיקה ותוספי דגירה במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת ז'קטים.
כדי לבצע טרנספקטציה של התאים, מחממים את ריאגנטים טרנספקציה לטמפרטורת החדר ומטפטפים אותם בעדינות לפני השימוש. מניחים כמות מתאימה של חיץ טרנספקציה בשני צינורות צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר עבור כל קו תאים ומתייגים אותם כצינור אחד ולועגים לטרנספקציה מדומה, או צינור שני. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוגרם של פלסמידים המבטאים דנ"א, CAS9, מדריך יחיד, מכוון RNA אנושי CD4 כדי לצינור אחד ופיפט בעדינות כדי לערבב לחלוטין.
מוסיפים נפח שווה של מים סטריליים לצינור שתיים. הוסיפו כמות מתאימה של מגיב הטרנספקציה לצינור אחד עם תערובת DNA וההעתקה המדומה או הצינור השני. באמצעות פיפטה, ערבבו אותם בעדינות לחלוטין ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 30 דקות כדי ליצור את המתחמים.
מוסיפים את תערובת הטרנספקציה בצורה טיפתית לצלחת ומנערים בעדינות את צלחת התרבית למשך דקה אחת כדי להפיץ באופן שווה את תערובת הטרנספקציה. כדי לקצור את התאים על ידי טריפסיניזציה, החליפו את מדיית התרבית במיליליטר אחד של טריפסין EDTA ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר מכן, נטרל את טריפסין עם נפח שווה של מדיה בתוספת FBS.
עבור כל צלחת של תאים, העבירו את תרחיף התא לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה עם אליקוטים שווים וצנטריפוגה ב-300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, להשעות מחדש את גלולת התא מצינור אחד במיליליטר אחד של PBS לריצוף, ובצינור אחר, עם PBS קר כקרח עבור אימונובלוט. בדיקת Immunoblot בוצעה כדי להשוות את ביטוי CAS9 בתאי HFK לא מתורגמים ומתעלים.
התוצאות מראות שתאי HFK לא מתורגמים ומתעלים ביטאו כמות דומה של CAS9, מה שמצביע על כך שנצילות הטרנספקציה דומה בין שני קווי תאים. התקבלו תמונות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של היסטון H2AX S139 זרחני בתאים טרנספקטציה SgRNA/CAS9 ובקרה לא מתורגמת. התוצאות הצביעו על כך ששתי הפסקות דו-גדיליות הושרו על ידי CAS9 SgRNA.
וריאציות גנומיות קובצו לפי סוגים של אירועים מוטציוניים ב-HFK LXSN וב-HFK 8E6, כאשר כל קבוצה של וריאציות גנומיות והמספר הכולל של וריאציות הושוו בין HFK LXSN ל-HFK 8E6. התוצאות הראו כי 8E6 מגביר את הווריאציות הגנומיות בטווח של 200 קילו-בסיס סביב הפסקות הגדיל הכפול המושרות על-ידי CAS9, מה שמצביע על כך ש-HPV 8E6 מבטל את הוויסות של תיקון שברים דו-גדילי ומגביר את חוסר היציבות הגנומית. מטרת האימונובלוט היא למדוד את יעילות הטרנספקציה, שיש לקחת בחשבון במהלך ניתוח הנתונים.
בנוסף ליעילות הטרנספקציה, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית יכולה לשמש לאישור אינדוקציה של שבר דו-גדילי באמצעות phospho-H2AX כסמן. אנו משתמשים בבטא HPV 8E6 כדוגמה. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות שינויים בתדירות המוטציה או בסוג שנגרמו על ידי ריאגנטים אחרים כגון מעכבי מולקולות קטנות.
