1. אוסף רקמות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעכברים בין 7 ל 12 שבועות. בדרך כלל, לפחות שני בעלי חיים משמשים: האחד הוא להגדיר את FACS צבע שולט יחיד נדרש פיצוי עבור הקרינה מינוס אחד דגימות בקרה אלוטיפ. השני הוא מדגם בפועל למיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים משאיפת CO 2 או לפי פרוטוקול אתיקה של בחירה. עכברים מניחים על מגבת נייר, פונה כלפי מעלה, ולרסס עם אתנול 70% ביסודיות על מנת למנוע זיהום עם פרווה העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור באזור הבטן עם מלקחיים, ולאחר מכן לבצע חתך אורכי קטן במספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולפים את שני קפלי עור בכיוונים מנוגדים (למעלה ולמטה) כדי לחשוף לגמרי את שרירי הגפיים האחוריות מתחתיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת השריר והבלו ידי הוספת והארכת מספריים לאורך שני הצדדים של השוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך זהה עבור עצם הירך כדי לחלץ את רקמת השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את כל רקמת שריר נכרת ב-60mm פטרי מנות, באמצעות צלחת אחת עבור הרקמה מהעכבר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הנ&quot;ל עבור כל העכברים. </li></ol> 2. לנתק את רקמות לתוך התאים על ידי יחיד עיכול אנזימטי: לאורך קטע זה של הפרוטוקול, להשתמש ריאגנטים סטרילית כלים לעבודה בתנאים סטריליים. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של collagenase II (Sigma, חתול # 6885, 500u / mL) ו - 20 μL של המניה 250mm CaCl 2 אל צלחת פטרי כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוע את רקמת השריר לחתיכות קטנות (כ 1 מ&quot;מ 3) עם שני מלקחיים (אחד משונן, אחת מתוך כלים מדע טוב, עם 2 שיניים, חתול # 11051-10, 11154-10), לשים לב להסיר ולסלק כמה מזוהם ללא רקמות השריר ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את פטרי, כלים דגירה אותם 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את פטרי, כלים להשתמש הבוכנה 3 מ&quot;ל המזרק ביסודיות מחית החלקים רקמות. השתמש באחת הבוכנה עבור כל דגימה, כדי למנוע זיהומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף קצת (~ 5 מ&quot;ל) סטרילי קר PBS על צלחת פטרי כל העברת הבוצה רקמה לתוך צינור פלקון 50 מ&quot;ל (לשטוף את צלחת פטרי, אם יש צורך לשחזר את כל הרקמה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער את הצינורית פלקון במרץ, למלא את הצינור עם PBS, צנטריפוגה @ 800rpm x 5 דקות (דגם Eppendorf הספסל העליון: 5810R), וכן לשאוב supernatant (חוזר 3 פעמים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים תערובת של 1mL collagenase ד &#39;(רוש, חתול # 11088882001, 1.5u / mL) / Dispase II (רוש, חתול #: 04942078001, 2.4u / mL) ו 10μL של CaCl 2 (250mm) כדי צינור אחד, דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רוטציה למשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5-10 מ&quot;ל של מערבולת קר, סטרילי, PBS ו פיפטה ביסודיות כדי homogenize הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את צינורות עם PBS ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הנוזל מסננת תא 40μm מונח על גבי צינור פלקון 50 מ&quot;ל לסנן את חתיכות גדולות של רקמה הנותרים. מחלקים כל דגימה שווה לשלוש מבחנות פלקון 50 מ&quot;ל. מלאו את כל הצינורות עם PBS אז צנטריפוגות @ 1600rpm במשך 5 דקות על 8 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant לאסוף תאים מכתים. </li></ol> 3. נוגדן מכתים ומיון: לאורך קטע זה של הפרוטוקול, להשתמש FACS סטרילית מאגרים לאיסוף ולעבוד בתנאים סטריליים. נוגדנים מסחרי נחשבים בדרך כלל סטרילי אם ינוהלו כהלכה. <ol start="20" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת צבע יחיד ושליטה דגימות אלוטיפ, resuspend המדגם במאגר FACS 1mL ולחלק את התאים מושעה בתשע 1.5mL מראש שכותרתו צינורות Eppendorf (100 μL כל שפופרת). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מכתים צבע יחיד מערבב על פי הטבלה הבאה: שים לב: הריכוז הסופי של נוגדנים לשלוט אלוטיפ את הכתם צריך להתאים לזה של נוגדן הראשוני הם הבקרה. לדוגמה, אם אנטי SCA-1 משמש 1 μg/10 6 תאים, אלוטיפ המתאים יש להשתמש בריכוז זהה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> שם שפופרת </td><td> חברה </td><td> חתול # </td><td> שיבוט </td><td> אלוטיפ </td><td> מהילה </td></tr><tr><td> 1 </td><td> ללא כתם </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> סיגמא </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> סיגמא </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> ebioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> עכברוש IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> בית עשה </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> עכברוש IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Sca1-PECY7 </td><td> ebioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> עכברוש IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> בית עשה </td><td></td><td> R2F2 </td><td> עכברוש IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מכתים אלוטיפ לשלוט מתערבב באמצעות הטבלה הבאה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> שם של הצינור </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Scal- PE-CY7 </td><td> -7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> שוה CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> שוה Scal- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> שוה α-7-APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet יחיד צבע איזוטופ מכתים לשלוט מתערבב (אנחנו בדרך כלל להתאים את הריכוז של נוגדנים כך בין 5 ל 10 μL של מכתים לערבב מתווספים כל דגימה) לתוך הצינור Eppendorf המתאים שלב 20. מערבבים היטב לדגור על הקרח במשך שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם תאים העכבר מדגם 800μL עם קוקטייל של נוגדנים (להלן) למיון תא FACS. מערבבים היטב לדגור על הקרח במשך שעה 1. קוקטייל נוגדנים: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC שים לב: יחס אופטימלי של נוגדנים לתאי צריכות להיקבע על ידי כל אחד בנפרד titrating נוגדנים, כמו הבדלים משמעותיים עשויים להתקיים בין קבוצות. כמות אופטימלית של נוגדנים כדי לשמש צריך לבוא לידי ביטוי μgs של נוגדנים לכל 10 6 תאים היעד והמשיך קבוע בעת השימוש אצווה אותו נוגדן. ברור שאם את מספר התאים היעד אינו משתנה משמעותית בין ניסויים, או אם נפח מכתים ישתנה עם מספר תאים, דילול קבוע של נוגדן זה יכול לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי: הוסף 1mL של כ חיץ FACS לכל אחד 9 צינורות שליטה; להוסיף 20mL של כ חיץ FACS אל הצינור המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות Eppendorf @ 3000rpm במשך 5 דקות (Eppendorf צנטריפוגות גבי ספסל, דגם: 5417C). צנטריפוגה צינור דגימה @ 1600rpm במשך 5 דקות (למעלה Eppendorf ספסל צנטריפוגות, דגם: 5810R). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולזרוק supernatant מכל הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend במאגר FACS (1mL עבור כל אחד שולט, 4mL למדגם מיון), תאים פיפטה לתוך &quot;צינורות FACS&quot; דרך מסננת תא כובע (חתול פלקון BD # 352235, 40μm גודל הנקבוביות) כדי להסיר גושים שנותרו שעשויים להשפיע על cytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סדרן FACS עם צבע שולט יחיד ושולט אלוטיפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ממוינים על פי הטבלה הבאה חיץ mL 3.5 אוסף (95% DMEM, 5% FBS) בנפרד. בדרך כלל, כאשר קצירת הן הגפיים האחוריות, עכבר אחת סוג בר יכולה להניב כ 150,000 ובתאים myogenic או 100,000 ובתאים adipogenic, עם הכדאיות מעל 95%, דהיינו על ידי FACS ידי תאים ממוינים reanalyzing בסוף ההליך (איור 1 ) הגדרה של אבות myogenic ו adipogenic מבוסס על משטח מכתים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נוגדן / כתם </td><td> אבי Myogenic (MP) </td><td> אבי Adipogenic (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td&gt; - </td><td> - </td></tr><tr><td> Sca1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. השתלה: <ol start="28" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים ממוינים @ 1500rpm במשך 5 דקות, להסיר את התאים supernatant ולהעביר autoclaved Eppendorf צינורות (1.5 מ&quot;ל), לשטוף עם תאים μL של 500 סטרילי PBS (נסיוב בחינם!), ואז צנטריפוגות @ 3000rpm במשך 5 דקות. שמירה על כל ריאגנטים בתנאים סטריליים ולעבוד במנדף בתרבית רקמה, resuspend אבות myogenic ב-PBS, או אבי adipogenic ב Matrigel (חתול BD # 354234) על כ 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתלות או אבי אבות myogenic adipogenic לעכברים הנמען. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר עם isoflouran פי מדיניות המוסד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את השיער סביב איזור ההזרקה, ולאחר מכן לחטא את העור על ידי שפשוף עם אתנול 70% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 20μL של אבות myogenic או אבות adipogenic (= 20k תאים) באמצעות 3 / 10 מזרק אינסולין CC (חתול BD # 309300). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן מתאים (שלושה שבועות עובד היטב, אבל הבעת myofibers התורם הנגזרות סמנים מהונדס הם בדרך כלל מאליה בתוך שבוע לאחר ההשתלה), לטשטש את העכברים הנמען משלב 29 בזריקה intraperitoneal של 400 Avertin μL (חתול Sigma # T04840-2, 25 מ&quot;ג / מ&quot;ל), אנקב transcardially עם 50 מ&quot;ל PBS (מכיל 10 מיקרומטר של EDTA) הראשון, ואחריו 15 מ&quot;ל של PFA 4%. איסוף רקמות היעד, שלאחר לתקן עם PFA 4% בין לילה, אם נדרש, ואז להעביר סוכרוז 20% בין לילה. שבץ להקפיא, אוקטובר ו cryosection. </li></ol> 5. נציג תוצאות: כאשר חבר פרלמנט מושתלים לתוך השריר שלד העכבר, הם בקלות עם הפתיל קיימים myofibers. לכן כל תווית גנטי הנוכחית בתאי התורם יהיה להבחין בקלות הסיבים כי קיבל אותם. תרשים 2 מציג דוגמה שבה הביע את התאים המושתלים phostphatase אלקליין בני האדם, גילו histochemically. כאשר AP מושתלים התוצאה היא תלויה מאוד בסביבה של אתר ההשתלה: כאשר המושתלים מתחת לעור תאים אלו כדי לתת מקורות adipocytes ו myofibroblasts (ראה איור 2). באתרים רבים אחרים, כולל שרירים, הם אינם שורדים אלא ניוון שומן כבר המושרה 3. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מיון אסטרטגיה לבידוד של אוכלוסיות אבי מן שרירי השלד (א) אסטרטגיה מיון:. תאים חיים זוהו המבוססת על פיזור קדימה פיזור לוואי. מכתים Hoechst שימש להוציא פסולת anuclear ו יודיד propidium (PI) מכתים להוציא תאים מתים. Hematopoietic (CD45) לבין האנדותל (CD31) תאים הוצאו משערי מיון. Α7 Hoechst + + PI - CD45 - CD31 - Scal - משנה זה מכיל את כל אבות myogenic (MP). + + Scal Hoechst לצרכן - CD45 - CD31 - α7 - האוכלוסייה כוללת אבות adipogenic (AP). (ב) Fluorescence מינוס אחד (FMO) שולטת אלוטיפ לאשר את הספציפיות של הכתם. (ג) טוהר בדיקות של תת MP ו AP לאחר מיון. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תוצאות נציג הבאים MP ו AP השתלה. AP הושתלו תת עורי (פאנל עליון) MP לתוך שריר (הפאנל התחתון). בשני המקרים, תאים התורם שמקורה עכבר מהונדס המבטא phosphatase אלקליין אדם, שזוהה על ידי מכתימה את החום.

<ol>
	<li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+stem+cells.">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li><li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+stem+cells.">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li><li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li><li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibro/adipogenic+progenitors:+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration.">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li><li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors:+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle.">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li><li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells.">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li><li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration.">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מטרת פרוטוקול זה היא איזון סביר בין תשואות גבוהות כדאיות גבוהה של תאים מטוהרים. השלב הקריטי ביותר להבטיח כי תאים בריאים הם התאוששו הוא, כצפוי, ניתוק האנזימטית של רקמת המוצא. הטיפול של הרקמה צריך להיות עדין במיוחד, אשר קשה להוכיח או להעריך אפילו בפורמט אורקולי. גורם המפתח הוא אורך ההליך. ככל שנדרש כדי לצאת מן התורם אל החיה הנמען, התחתון את הכדאיות, ולכן את היעילות engraftment. אם יש איזו שאלה לגבי כדאיות שלא ענה מיד על ידי הסתכלות תדירות האירוע לצרכן חיובי דגימות תאים מטוהרים לאחר מיון, אנו ממליצים כי assay דילול הגבלת למדוד clonogenicity מבוצעת 3. מיני טיפוסיות מן השריר ניזוק באופן שגרתי התשואה על 1 ב 15-20 תאים המסוגלים ליזום מושבות myogenic או fibro / adipogenic במבחנה. בעוד למעשה 100% במושבות יזם של חברי פרלמנט להכיל myotubes הבדיל, רק כשליש מושבות המתקבל FAPs מכילים adipocytes בנוסף חלקה אקטין myofibroblasts שריר חיובית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C-6885, </td><td> 500 u / ml </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> רוש </td><td> 11088882001 </td><td> 1.5 u / ml </td></tr><tr><td> לעקור II </td><td> רוש </td><td> 04942078001 </td><td> 2.4 u / ml </td></tr><tr><td> תא מסננת </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Tube עם מסננת תא </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 מיקרומטר </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> B2261 </td><td> 2-5 UG / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Clone 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> תוצרת בית </td><td></td><td> Clone I3 / 2 </td></tr><tr><td> Sca1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Clone D7 </td></tr><tr><td> α-7 integrin APC </td><td> תוצרת בית </td><td> תחקור עם רוסי מעבדה </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

purification of progenitors from skeletal muscle

שריר השלד מכיל אוכלוסיות מרובות אבי ממוצא עובריים ברורים הפוטנציאל ההתפתחותי. אבות Myogenic, בדרך כלל תושבי &quot;העמדה תא הלוויין&quot; בין הממברנה myofiber פלזמה הממברנה laminin עשיר במרתף ensheaths זה, הן עצמית חידוש התאים מחויבים אך ורק 1,2 את השושלת myogenic. תיארנו לאחרונה מדרגה שנייה של אבות כלי קשורה כי ניתן להפיק myofibroblasts ו adipocytes לבן, אשר מגיב נזק על ידי הפצת ביעילות הכניסה ומספקת תמיכה trophic לתאי myogenic במהלך התחדשות רקמות 3,4. אחת מבחני האמינים ביותר לקבוע את הפוטנציאל ההתפתחותי ועל ההתחדשות של האוכלוסייה תא נתון מסתמך על הבידוד שלהם השתלת 5-7. לשם כך יש לנו אופטימיזציה פרוטוקולים לטיהור שלהם על ידי cytometry לזרום שריר ניתק enzymatically, אשר נתאר במאמר זה. האוכלוסיות שהושגו בשיטה זו תכלול גם תאים המושבה myogenic או fibro / adipogenic יוצרים: אין סוגי תאים אחרים ומסוגלים להרחיב במבחנה או לשרוד במשלוח vivo. עם זאת, כאשר אוכלוסיות אלו משמשים מיד לאחר למיין את ניתוח מולקולרי (למשל qRT-PCR) יש לזכור כי תת מיון טרי עשוי להכיל תאים מזהמים אחרים כי חוסר היכולת של יוצרים מושבות או engrafting הנמענים.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Progenitors from Skeletal Muscle at JoVE.com

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

שיטת ניתוק האנזימטית, תיוג משטח וטיהור על ידי cytometry זרימה של fibro / adipogenic ואת אבות myogenic מן שרירי השלד Murine.

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

purification-of-progenitors-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Views.  University of British Columbia. שיטת ניתוק האנזימטית, תיוג משטח וטיהור על ידי cytometry זרימה של fibro / adipogenic ואת אבות myogenic מן שרירי השלד Murine.

Video: Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

זיהוי, בידוד ואפיון של אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ואבעות מיוגניים (חברי פרלמנט) בשריר השלד בחולדה

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...