החוקרים מעריכים מאוד של גב &#39;Haiying פאן מר איאן Bellayr לעזרה הטכנית שלהם על בידוד התא הסרטים הנוכחי מר קייל הולדן ומר יונתן לוקאס על עזרתם על עריכת שקופיות. תודה רבה על הרשימה הבאה של אנשים שהיו מעורבים בפיתוח של טכניקות preplate השתנה בשנים האחרונות: בני הזוג. בורהאן Gharaibeh, BaoHong קאו, דיזי ברידג&#39;ט, תומס ר &#39;פיין, Aiping לו, Hairong פנג, הידקי אושימה, בו זנג, Xiaodong מו, Kimimasa Tobita, רון ינקובסקי, Makato Ikezawa. אנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של ג&#39;יימס ה &#39;Cummins, ריאן Pruchnic, יוסף Feduska, רבקה ג Schugar, Haiying פאן וג&#39;סיקה Tebbets. המחבר גם רוצה להכיר תמיכה כספית עבור עבודה זו מפני ניוון האגודה שרירים (מד&quot;א), המכון הלאומי לבריאות (NIH), משרד ההגנה (DOD), בית החולים לילדים של פיטסבורג של UPMC, המחלקה ניתוח אורתופדי, של אוניברסיטת פיטסבורג.

ככלל, הנוהל המלא preplate שונה דורש 1-2 ימים של הכנות, 1 שבוע של ביצוע הליך טכני, 2-3 ימים של הזדהות עם התא immunocytochemistry, וכן תוספת של 2-3 שבועות הרחבה בתאי גזע האוכלוסייה. הציוד הנדרש תרבות בתאי גזע הם דומה לזו של מערכות תרבות אחרים תא הכולל ספסל העליונה צנטריפוגות, CO 2 באינקובטור, זרימה למינרית רקמות ברדס תרבות הפוכה מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה דיגיטלית. בתאי גזע בודד גם ניתן לשכפל ו יכול להיות מאוחסן לטווח ארוך חנקן נוזלי עבור 1,2 הלימודים הנוכחית או בעתיד. כל ריאגנטים החומרים המשמשים לצורך הליך זה חייב להיות סטרילי לטפל בסביבה נקייה מחיידקים. שלב 1: הכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל רקמת קולגן תרבות צלחות צלוחיות: אני סוג קולגן שמקורם בעור עגל (0.1 גרם לליטר 1; סיגמא אולדריץ &#39;). Plasticware המעיל כולל: T-25 צלוחיות, 6 או 12 צלחות טוב, מנות (60 ו - 100 מ&quot;מ, BD פלקון) כפי שתואר קודם 1,2. נער בעדינות את plasticware כל חצי שעה, במשך 4 שעות כדי להבטיח אפילו ציפוי של הקולגן. הפתרון קולגן מוסר מכן. וגם plasticware מצופה מותר אז לייבוש למכסה המנוע רקמה תרבות עם אור UV ואת מכסה המנוע הן, כדי להבטיח סטריליות, ו סגרה בסופו של דבר או כיסו לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרבית תאים בינוניים: 400mL DMEM (DMEM, גלוקוז גבוהה; Invitrogen), 50 מ&quot;ל סרום מומת חום שור עוברית (FBS, Invitrogen), 50 מ&quot;ל סרום סוס (HS, Invitrogen), ו - 5 מ&quot;ל צ&#39;יק העובר חלץ (CEE, מדויק כימית ושות ) יהיה ואקום מסונן באמצעות הפנויה 0.22 מיקרומטר-500-ml מערכת סינון סטרילי (קורנינג). פניצילין ועיקור / פתרון סטרפטומיצין (Invitrogen) יתווספו בסופו של דבר 100 יחידות / מ&quot;ל. פתרונות מוכנים ניתן לאחסן 4 ° C למשך חודש אחד לפחות. פתרון זה משמש כדי לנתק את התאים מהבקבוק כאשר תרבויות פיצול או הכנת תאים להשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חימום פתרונות בידוד תא: ריאגנטים הבא צריך להיות מחומם ל 37 מעלות לפני השימוש שלהם בבידוד בתא C: שנאגרו של האנק תמיסת מלח (HBSS, Invitrogen); 0.2% (wt / כרך) collagenase מסוג XI (Sigma אולדריץ &#39;), עם ממוצע של 3,200 יחידות העיכול קולגן לכל מ&quot;ל HBSS; Dispase 2.4 units/1mL (Invitrogen); 0.5% (wt / כרך) טריפסין (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ציוד כירורגי הכנה: הליך כירורגי מחייב מכשירי ניתוח סטרילי כולל: בגדלים שונים מלקחיים, מיקרו מספריים, מספריים איריס ו / או להבי אזמל. בנוסף, 15 ו - 50 מ&quot;ל צנטריפוגות צינורות פוליפרופילן (BD פלקון); מסננת Cell (גודל הנקבוביות 70 מ &#39;) (BD פלקון); 18 -, 23 - ו 27-מד מחטים (BD PrecisionGlide), ו 10 - או 20 מ&quot;ל מזרקים סטריליים (BD). </li></ol> שלב 2: ביופסיות רקמות, בידוד ניתוק מכני 1-4 ביופסיות רקמות מבוצעות מתחת למכסה המנוע תרבות סטרילית כוללים טריים שנקטפו הגידים ואת שרירי השלד מתקבלים השרירים השוקה או soleus של hindlimb של wild-type עכברים (C57BL/6J נקבה, 4-5 שבועות של גיל או צעירים יותר, ג&#39;קסון מעבדה). כל רקמות החיבור גלוי, כלי הדם, ורקמת השומן יוסרו אז מן דגימות ביופסיה. רקמות של גיד ושריר הם זיהו אז בזהירות תחת מיקרוסקופ ביתור כירורגי כדי להסיר שאריות עור ועצמות והניח בצלחת המכילה קר (4 ° C) HBSS (בתוספת להוסיף 5% FBS). רקמות מבודדות אז הם ממוקמים בנפרד על מנות המכיל קולגן מצופה HBSS קר יהיה טחון (&lt;1x1 מ&quot;מ 3) לתוך slurry גס באמצעות מיקרו מספריים ו / או להבי אזמל. שלב 3: עיכול אנזימתי של הרקמות: הרקמה טחון אז הוא ניתק enzymatically באמצעות סדרה של צעדים 2,4,5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את slurries רקמות טחון לתוך 15 מ&quot;ל צינורות נפרדים צנטריפוגות בסל&quot;ד 3500 ~ ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, לשטוף עם HBSS וחזור על צנטריפוגה שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, ולעכל אלה slurries ידי הוספת 10 מ&quot;ל של prewarmed 0.2% collagenase מסוג XI (Sigma). דגירה של 60 דקות בשעה 37 ° C תוך ברציפות מנענעת בעדינות את הצינורות. לחלופין, ללחוץ את ידו בכל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ו resuspend אלה slurries ב 10 מ&quot;ל dispase (2.4 יחידות / מ&quot;ל, Gibco) פתרון. דגירה של 45 דקות בשעה 37 ° C, רעד בידיים או מתנדנד בעדינות כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מחדש להשעות אלה slurries ב 10 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין 0.2% HBSS. דגירה תשתנה בהתאם למידה שבה תאים בודדים משתחררים הרקמות אשר יכול להתבצע על ידי התבוננות ההשעיה תחת מיקרוסקופ. זה לא מומלץ לעלות על 30 דקות בשעה 37 ° C עם היפוך הצינורות או מתנדנד בעדינות כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התא וכתוצאה מכךs מחדש להשעות את התא גלולה ב 10 מ&quot;ל של הפצת נשק בינוני (PM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את ההשעיה התא על ידי העברת לחלץ באמצעות סדרה של מחטים. התאים מועברים לאחר מכן 2 פעמים דרך 18G, אז 23G, ולבסוף מחט 27G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את תמצית התא דרך מסננת 70 מיקרומטר תא. </li></ol> שלב 4: Preplating לבודד אוכלוסיות תאים שונים המבוססים על הידבקות התא שיעור 1-3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ו resuspend את כדורי תא בינוני הפצתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא פלייט תערובות על בקבוק T-25 קולגן מצופה (או 60 צלחת מ&quot;מ) ולסמן אותו PP1. ההשעיה התא צריך לשמור כבעל מספר גדול של גרעינים השבירה ופסולת אחרת מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס humidified, 5% CO 2 באינקובטור למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים nonadherent כדי קולגן חדש מצופה T-25 צפחת (או 60 צלחת מ&quot;מ) סימן הוא כמו PP2. הוסף 5 מ&quot;ל PM לתוך צלחת שכותרתו PP1. התאים הראשונים אשר דבקות לצרף בקבוק הם ברובם myofibroblasts 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את צלוחיות אל האינקובטור לעוד 24 שעות, כדי להעביר תאים nonadherent חדש קולגן מצופה T-25 צפחת (או צלחת) ולסמן אותו PP3. הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום הפצת נשק לתוך צלחת שכותרתו PP2. תאים אלה דבקות אשר לצרף בקבוק זה הם בעיקר fibroblasts 2,3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור צלוחיות אל האינקובטור לחזור על התהליך בעוד 24 שעות עד PP6 האוכלוסייה נוצר. שמרו על כל קבוצה של תאים מושעה ולאפשר להם להתרבות ולבחון אותם באופן קבוע באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. PP3-PP4 הם בעיקר myoblasts בעוד הלוויין לתאי שריר נראים לעתים קרובות בעיקר PP5 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוב התאים לאט דבקות בדרך כלל לצרף ידי PP6. בשלב זה, התאים להופיע קטן, עגול השבירה, אור הם דלילים מאוד מספר נחשבים תא גזע 1,2 האוכלוסייה. </li></ol> שלב 5: זיהוי הרחבה בתאי גזע בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודדים PP6 תאים מעטים ביותר ויש צורך להישמר בינוני FBS הפצת נשק עשיר (20% FBS ב DMEM) כי הוא השתנה מדי יום. רוב התאים הנמצאים למות PP6 התרבות במהלך 1-2 השבועות הבאים של culturing, אבל גדול, אוכלוסייה בריאה PP6 נוצרת בדרך כלל לאחר 1-2 שבועות נוספים של התרחבות. בתאי גזע שבודדו עכברים מאוד לבטא בתאי גזע אנטיגן 1 (Sca1), CD34, kinase כבד עוברית 1 (Flk1), ו סמנים גזע אחרים 1,2,6,7 אשר ניתן דמיינו באמצעות מכתים immunocytochemical. אלה בתאי גזע גם להפגין יכולות התמיינות מספר 3,6,8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בודדים נשמרים והרחיב בצפיפות נמוכה תא בתרבות (12 מנות גם ב 50-100 תאים / או גם &lt;מפגש 20-30% בבקבוק או צלחת) כדי למנוע 1,2 בידול. תאים מעטים טופס שיבוטים במהלך הרחבה, אלה בתאי גזע משובטים יכול לעבור זמן רב התפוצה (LTP) עבור כל יכולת מחקרים אחרים. בתאי גזע משובטים גם ניתן לאחסן באמצעות חנקן נוזלי כללי אחסון הליכים כגון תא בינוני PM DMSO עם 10%. בצע מספר נמוך של מניות מעבר בתאי גזע עבור כל המחקרים את השני בחזרה. </li></ol>

<ol>
	<li>Gharaibeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique.">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li><li>Qu-Petersen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+population+of+muscle+stem+cells+in+mice:+potential+for+muscle+regeneration.">Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.</a> J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).</li><li>Li, Y. &. a. m. p. ;. a. m. p., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+muscle-derived+cells+into+myofibroblasts+in+injured+skeletal+muscle.">Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle.</a> Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).</li><li>Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+donor+muscle+precursor+cells+into+an+area+of+muscle+regeneration+in+the+host+mouse.">Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse.</a> J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).</li><li>Lu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myogenic+progenitor+populations+from+Pax7-deficient+skeletal+muscle+based+on+adhesion+characteristics.">Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics.</a> Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).</li><li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+isolation+of+muscle-derived+cells+capable+of+enhancing+muscle+regeneration+and+bone+healing.">Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing.</a> J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).</li><li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+receptors+in+the+maturation-dependent+adenoviral+transduction+of+myofibers.">The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers.</a> Gene Ther. 8, 627-637 (2001).</li><li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+stem+cells+differentiate+into+haematopoietic+lineages+but+retain+myogenic+potential.">Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential.</a> Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).</li><li>Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+based+on+muscle+stem+cells.">Regenerative medicine based on muscle stem cells.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).</li><li>Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+musculoskeletal+system+based+on+muscle-derived+stem+cells.">Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells.</a> J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

זה כבר הכיר בכך כמה רקמות בוגרות מכילים בתאי גזע מרובים. במהלך השנים האחרונות של המחקר, בתאי גזע זוהו ברקמות השלד רך, כולל שריר גיד השלד. זה פרוטוקול הנוכחית פרטים הליך המכונה הטכניקה preplate שונה, כי שימש בהצלחה במעבדה שלנו לבודד בתאי גזע בוגרים של גידים שרירי השלד. באמצ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#11995-073</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat-inactivated horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#26050-088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chick embryo extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>#CE650T-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100U ml penicillin/streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hank&#x2019;s Buffered Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#24020-117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase type XI 0.2%(wt/vol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>#C7657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase2.4U ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#17105-041</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#15400-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>#C-9791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>#D-2650</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolating stem cells from soft musculoskeletal tissues

בתאי גזע בוגרים כבר מזמן דנו לגבי היישום שלהם ברפואה רגנרטיבית. בתאי גזע בוגרים יצרו מידה רבה של התרגשות לטיפול רקמות פצועים וחולים בגלל היכולות המרשימות שלהם לעבור רב השושלת התמיינות תאים ויכולת התחדשות עצמית שלהם. והכי חשוב, התכונות הללו הפכו אותם יתרון לשימוש טיפולים עצמיים השתלת תאים. הפרוטוקול הנוכחי יהיה להכניס את הקוראים לטכניקה preplate שונה שבו הרקמות הרכות של מערכת השלד, שריר גיד למשל ואת, הם 1<sup&gt; רחוב</sup&gt; ניתק enzymatically ואז להציב צלוחיות קולגן מצופה בינוני. Supernatant, המורכבת בינוני התאים הצפים הנותרים, מועבר סדרתי היומי צלוחיות חדשות. בתאי גזע האיטי ביותר לדבוק צלוחיות אשר בדרך כלל לוקח 5-7 ימים (העברות סדרתי או preplates). באמצעות טכניקה זו, בתאי גזע בוגרים הנמצאים ברקמות אלה ניתן לקצור בקלות דרך למדי פולשני ההליכים.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues at JoVE.com

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

בידוד גזע בוגרים תאים ברקמות הרכות השלד מבוסס על מהירות הדבקות של התא בקבוק.

בידוד בתאי גזע רקמות השלד והשרירים Soft

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of ...

isolating-stem-cells-from-soft-musculoskeletal-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  Stem Cell Research Center, Childrens Hospital of Pittsburgh of UPMC. בידוד גזע בוגרים תאים ברקמות הרכות השלד מבוסס על מהירות הדבקות של התא בקבוק.

Video: Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

בידוד תאי גזע ממעיים למבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Midguts ידי FACS ללמוד את התנהגות תאי גזע במהלך הזדקנות

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...