PLP הוא חוקר עמית במרכז לבריאות המחקר של סנפורד לילדים. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים כדי PLP: R01AR056712, R01AR052779 וAR061303 P30 מהמכון הלאומי לבריאות / המכון לאומי של דלקת מפרקים ושלד ושרירים ומחלות עור (NIAMS), מד&quot;א ואת הפרס לחקר בריאות ילדי סנפורד. עבודה זו יש נהנתה בחלק ממימון מחקר מתכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית בפרויקט FP7-בריאות - 2009 ENDOSTEM 241,440 (הפעלה של תאי כלי דם הקשורים גזע ותאי גזע שריר לתיקון והתחזוקה של רקמת שריר) SA נתמכה על ידי. מלגת CIRM.

1. זיהום של hESCs פרוטוקול זה דורש BAF60C גבוה lentiviruses כייל הקידוד וMyoD 13. מבנים אלה זמינים על פי דרישה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המלצות לפני שמתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להבטיח את היעילות גבוהה של הזיהום, hESCs צלחת לזיהום בתנאים ללא מזין (איור 2 א) כדי לחסל את המתחרים סלולריים בעת הספיגה נגיפית. ואכן, MEFs קל יותר לשמצה להדביק לעומת hESCs ומוכשרים לגיור בתיווך MyoD. לפיכך, ביטול MEFs מתרבויות hESC מגדיל את שיעור הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לי lentiviruses כייל גבוה כדי להבטיח יעילות גבוהה של זיהום. אפשרויות כדי לשפר את היעילות של זיהום נדונות בסעיף &quot;בדיקת זיהום&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הצלחות מצופים matrigel על ידי הוספת 1 מיליליטר של 1 מ&quot;ג / מיליליטר Matrigel בכל טוב ולהשאיר שעה לפחות 1 ב RT (או O / N אטום על 4 מעלות צלזיוסאם הכין היום קודם). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תא שיבוט הס &amp; מוסף שחזור במדיום בדילול 1,000 X (2 ריכוז סופי מ&quot;מ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 - זיהום עם BAF60C הערה: בצע את הזיהום של hESCs עם BAF60C הראשון ואחריו זיהום עם MyoD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק גם צלחת 6 היטב של hESCs גדלה כמושבות 14 בהשעית תא בודד על ידי דגירה עם 1 מיליליטר של TrypLE 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת השעיה לצינור 15 מ&quot;ל, להוסיף 9 מיליליטר של מדיום hESC ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, להכין את תערובת הזיהום בצינור נקי על ידי הוספת 1 מיליליטר של mTeSR1, polybrene (6 מ&quot;ג / מיליליטר) ותוספת תא הס שיבוט ושחזור (2 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות את התא גלולה (x 5 -1 10 6 תאים כ 5 x 10 מג אחדonfluent גם של hESCs) עם 1 מיליליטר של תערובת זיהום וצלחת על צלחת קובץ מצורף 6 גם נמוכה, מה שמונע מתאי שמירה על הפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת BAF60C-IRES-GFP וירוס ב10 8 משרד הפנים ודגירה 3 שעות בחממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה התא המכילה וירוסים ולחלק באופן שווה בשתי בארות מצופים matrigel. לאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של תא מוסף שיבוט ושחזור mTeSR1 + הס היטב כל אחד ולעזוב O / N בחממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את המצע המכיל את הווירוס ולהחליף עם 2 מיליליטר של תא שיבוט mTeSR1and הס &amp; מוסף שחזור. תאים יתחילו להתנהל בכבדות, כפי שמוצג באיור 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Day2 - זיהום עם MyoD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שימשיך לבדוק את מצב הקרינה של התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לוודא שיש יעילות גבוהה של זיהום. אם לא, עיין בסעיף &quot;בדיקה להדביקיון &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים הגיעו לפחות 80% ממפגש, פעל באופן הבא; אחרת לחכות ליום נוסף לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב TrypLE לנתק את התאים. דגירה 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה כfrom1.2.2.2 תאר - 1.2.2.6 הוספת וירוס MyoD ב10 8 משרד הפנים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את המצע המכיל את הווירוס ולהחליף עם 2 מיליליטר של תא שיבוט mTeSR1and הס &amp; מוסף שחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEFs צלחת על matrigel מצופה צלחות ב2.5 x 10 5/2 סנטימטר ליום המחרת כדי לאפשר התפשטות של התאים הנגועים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב TrypLE לנתק את התאים. דגירה 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים בצינור בז 15 מ&quot;ל, להוסיף 9 מיליליטר של מדיום hESC ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 1,200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rסר supernatant מחדש להשעות ב6 מיליליטר של מדיום hESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המדיה מצלחת MEFs המכיל 6 היטב וhESCs צלחת ב1:02 יחס מפוצל, מחלק 3 מיליליטר לכל MEFs המכיל היטב. עצה! כאשר המושבות להגיע למפגש, חלק מהבארות של תאי MyoD/BAF60C-infected אפשר להקפיא בחנקן נוזלי כמניית מילואים. מדיום הקפאה כולל 90% מKOSR וDMSO 10% בתוספת 2 תאי שיבוט מ&quot;מ הס &amp; מוסף שחזור. הבארות הנותרות ניתן לאחר מכן נחשפו לפרוטוקול הבידול - ראו בהמשך לתיאור. אם יש צורך יותר תאים לייצר יותר myospheres, יכול להיות מופץ hESCs הנגוע נוסף באופן הבא: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום דגירה עם 1 מיליליטר של 1 מ&quot;ג / IV collagenase מיליליטר במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר IV collagenase ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום hESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה לגרד את המושבות עם טיפ 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את גושי colonies בצינור 15 מ&quot;ל ולאפשר למשקעים במשך 3 דקות. ואז להסיר את supernatant, resuspend במדיום hESC וצלחת על צלחות MEFs באמצעות 01:04 יחס. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבדיקה זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מתפשט התאים, מומלץ לצלחת התאים הנגועים בקנה מידה קטנה יותר למסוק לניתוח RNA ולבצע ניתוח ביטוי חלבון על ידי immunofluorescence כדי לבדוק סמנים ביולוגיים המשקפים את המצב ביולוגי הנכון בכל שלב (ראה תוצאות נציג). לlentiviruses גבוה כייל את אחוז הצפוי התאים נגועים צריך להיות לפחות 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח יעילות גבוהה, יכולים להיות שונה הווקטורים lentiviral, מציגים סמן בחירת ניאון ו / או עמידות לאנטיביוטיקה. פלסמיד lentiviral להביע BAF60C גם נושא הקרינה ה-GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיון hESCs עבור סמן פלואורסצנטי. במקרה של יעילות הנמוכה של זיהום מומלץ להשתמש בקרינהתאי ctivated מיון (FACS-מיון) להעשרה לתאים לבטא וירוס BAF60C ולאחר מכן להדביק את התאים בוירוס MyoD גבוה כייל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תא שיבוט הס &amp; מוסף שחזור במדיום היום לפני המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום המיון, לנתק את התאים על ידי TrypLE (כפי שמתואר ביום 0) ו resuspend התאים בסרום KO החלפה בתוספת תא הס מוסף שיבוט ושחזור בFACS-צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של המיון, לאסוף את התאים בסרום החלפת KO וצלחת על צלחות MEFs הוספת תא שיבוט הס &amp; מוסף שחזור. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. אינדוקציה והתמיינות כמו EB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך אינדוקציה והתמיינות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 - אינדוקציה EB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא, לפני שמתחיל בידול מBAF60C/Myod-infected hESCs, יש מספר גבוה של מושבות בבאר (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל r כןסר בינוני, לשטוף עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של 1 מ&quot;ג / IV collagenase מיליליטר. דגירה במשך 5 דקות ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר collagenase ולהוסיף 1 מיליליטר של EB בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה במהירות מכאנית לנתק את המושבות ל400-800 אגרגטים תא על ידי גירוד עם טיפ 10 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הגושים של מושבות בצינור 15 מ&quot;ל ולאפשר למשקעים במשך 3 דקות. הסר את supernatant, מחדש להשעות ב 3 מיליליטר של EB בינונית ולהעביר את ההשעיה התא היטב אחד 6 גם נמוך צלחת קובץ מצורף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את גודל המושבות והמוות של התאים לפני שתמשיך. אם גושים גדולים נמצאים, לשבור אותם בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה עם טפטפת 5 מ&quot;ל, 3-4 פעמים. אם המוות של התאים הוא גבוה מאוד (תאים רבים צפים ופסולת) להחליף את המדיום על ידי איסוף אגרגטים בצינור 15 מ&quot;ל על ידי כוח הכבידה וצלחת אותם עם 3 מיליליטר של מדיום EB הטרי, אחרת ימשיכו כדלקמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5מיליליטר של מדיום EB הטרי בבארות </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום על ידי איסוף אגרגטים מהבארות בצינור 15 מ&quot;ל. תן להם להתיישב למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant, להחליף עם 3 מיליליטר של מדיום EB הטרי ולהפיץ מחדש באותו בארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום EB הטרי בבארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך כמתואר ב&quot; יום 2 &quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5 - בידול myogenic של אשכולות כמו EB (איור 2 ד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף המצרפים כפי שמתואר ב2.1.3.1 ולשטוף פעם עם 2 מיליליטר של PBS; לאפשר מצטבר למשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 3 מיליליטר של מדיום DM; צלחת באותו בארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 6 - יום 20 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מD6 לD20 להחליף בינוני עם בינוני טרי כל 3 ימים. myospheres נציג מוצג בFigure 2E. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול myosphere בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתמשיך הלאה, מומלץ לבדוק את היעילות של בידול myogenic בתוך myospheres על ידי ביצוע חתכים של myospheres המשובץ במתחם אוקטובר, כפי שתואר בפרוטוקול יופיטר קודם 12. לבצע מכתים immunofluorescence עבור סמני myogenic כגון myognenin (F5D שיבוט, DSHB) ושרשרת שרירן כבדה (MF20 שיבוט, DSHB) (ראה תוצאות נציג). עצה! כדי להצליח עם הצביעה לmyogenin על סעיפי EB זה קריטי לבצע אחזור אנטיגן על ידי טיפול עם נתרן גופרתי dodecyl (SDS) 0.5% למשך 5 דקות. בנוסף, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לצביעה הכפולה באמצעות נוגדני F5D וMF20. </li></ol></li></ol> 3. מתכוני מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני ESC DMEM-F12 1 מ&quot;מ L-גלוטמין 20% סר נוקאממ בינוני החלפה (KOSR) 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ&quot;מ (NEAA) 50 פניצילין U / ml / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס) 0.1 מ&quot;מ בטא mercaptoethanol 8 ng / גורם גדילת מיליליטר בסיסי פיברובלסטים (bFGF) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EB בינונית DMEM F12 1 מ&quot;מ L-גלוטמין 15% FBS 5% סרום סוסים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני DM DMEF F12 מוסף שלה 1X הנוזלי מדיה מוסף 1X N-2 </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

הפרוטוקול המוצע כאן מתאר כיצד ליצור אשכולות תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres) ישירות מhESCs. יש האסטרטגיה המוצעת פוטנציאל חסר תקדים ויוצא דופן כדי לייצר את שרירי מיני בהשעיה שיכולה להיות מתאים כמו &quot;מחלה בצלחת&quot; מודל עבור שני מבחני מיון ומחקרים התפתחותיים. יתר על כן, השיטה לייצר myospheres מhESCs היא פשוטה ואינה דורשת כל צעד מיון FACS במהלך ההתמיינות, אשר בדרך כלל יש לו השפעה שלילית על התשואה של תאים התאוששו. חוץ מזה, הליך מיון במהלך ההתמיינות יפריע לצבירה מכיוון שהיא מרמזת ניתוק של EB לתוך תאים בודדים. השיטה המוצעת מבוססת על reprograming אפיגנטיים של hESCs עם גורמים ספציפיים, MyoD וBaAF60C, שאינם באים לידי ביטוי בתאי גזע עובריים pluripotent. MyoD וBAF60C לספק את ה החלבון המורכבת &quot;הליבה&quot;בסימני הלוקוסים הגנומי שממנו השעתוק ממשיך להפעיל את תכנית myogenic השלד. שני הגורמים מועברים לתאים בדרך של זיהומי lentiviral ולכן זה קריטי כדי להשיג את יעילות גבוהה של זיהום של שני הגורמים בכל התאים. זו יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בוירוסי כייל גבוהים או וירוסי ניחן סמני בחירה. תנאי תרבות גם לשחק תפקיד חשוב באופטימיזציה של מידת בידול myogenic. אנו מציעים מבוססי פרוטוקול סרום בידול לבידול של MyoD/BAF60C להביע hESCs לתוך אשכולות של מבשרי myogenic, ואחריו דגירה במדיום מוגדר סרום ללא (המכיל אינסולין transferrin - ITS) כדי להשיג המרה של מבשרי myogenic לmyotubes שלד. עם זאת, זה אפשרי, כי תקשורת מוגדרת אחרת יכולה להשיג בידול myogenic שווה או טוב יותר. מגבלה הנוכחית של הפרוטוקול היא שהוא מסתמך על השימוש בסרום שור עוברי, אשר, מלבד להכילing חלבונים מן החי וחומרים רבים, מציג וריאציות הרבה להרבה. זה עלול לגרום ליעילות נמוכה יותר או ההטרוגניות של המרה myogenic בתוך myospheres. ראוי לציין, שלא כל המבנים דמויי-EB נגזרים מBAF60/MyoD-expressing hESCs הם myospheres; כלומר, חלקם מצרפים כמו EB לחלוטין המורכב של myofibers. מספר myospheres בדרך כלל נגזר מhESCs להביע BAF60C וMyoD יכול להשתנות 30-60% כפי שהוערך על ידי immunostaining על סעיפי EB שבוצעו בסוף הפרוטוקול (ראה תוצאות). גישת פוטנציאל להעשיר את המנה תרבות לmyospheres רק תהיה להשתמש כתב myogenic. זה יקל על השלכת האשכולות כמו EB באופן חלקי או לא מובחנים ובחירה רק myospheres. לבסוף, הבנה טובה יותר של המנגנונים שבבסיס הדרישות זמניות של הגורמים הציגו תהיה שימושית כדי לשפר את השיטה של ​​מסירה. לדוגמא, אם BAF60C וMyoD נדרשים רק עבור shזמן אורט &quot;בעיטה&quot; התאים בכיוון הנכון, שיטות המבוססות על משלוח mRNA שונה יכול להיות מיושמת. לעומת זאת, אם הגורמים נדרשים לזמן ארוך יותר לפני שהתאים לנצל החלבונים אנדוגניים שלהם, גישת episomal תהיה מומלצת לחסל את השונות והשפעות בלתי מבוקרות בשל האינטגרציה בגנום. לבסוף, נציין שזה חובה להביע BAF60C לפני או במקביל לMyoD (לא לאחר) על מנת להשיג גיור hESC לשרירי שלד. הדרישה לביטוי מוקדם של BAF60C ככל הנראה מסתמכת על תפקידה בהגדרה מראש הנוף אפיגנטיים להפצת הכרומטין MyoD נכונה דרך הגנום 6,15. ככזה, פרוטוקולי עתיד עשויים להיות משופרים על ידי תרכובות או מניפולציות אחרות שמקדמות ביטוי BAF60C בhESCs.

בגלל היכולת הייחודית שלהם לעצמית לחדש תוך שמירת pluripotency, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נחשבים משאב יקר ערך ברפואת רגנרטיבית. דור גזע אכלוס תא בתיווך של שרירים פגועים ותאי hESC או גזע pluripotent מושרה (iPSC) נגזר של שרירי שלד לדוגמנות מחלה במבחנה הם מטרות עיקריות של מחקרים שמטרתם איתור וטיפולי הבהרה בפתוגנזה של מחלות רבות התוקפת. עם זאת, מחקרים אלה כבר לערער על ידי ההתנגדות של hESCs להמיר לתאי שרירי שלד ועל ידי מיעוט מידע לגבי הרגולציה המולקולרית של hESC-מחויבות כלפי myogenesis שלד. ואכן, ניסיונות קודמים ליצור אבות שרירי שלד מhESCs גילו כי רק גוף embryoid progenies (EB) נגזרת או תאי mesenchymal מוסמך להפעיל myogenesis השלד הבא ביטוי מחוץ לרחם של מפעילי תעתיק (לדוגמא:PAX3 או Myf5) 1-3 או על ידי חשיפה לתנאי תרבות הספציפיות 4-5. הראינו בעבר כי רכיב SWI / SNF, BAF60C (המקודד על ידי SMARCD3), הוא מרכיב חיוני של מכונות תעתיק המאפשרת הפעלה בתיווך MyoD של לוקוסי שרירים ספציפיים 6. יש לנו גילינו לאחרונה כי ההיעדר סלקטיבית של BAF60C מקנה על hESCs ההתנגדות להפעלה בתיווך MyoD של myogenesis שלד 7 כי הוא ציין אחרת בBAF60C לבטא בתאים סומטיים 8-10, תהליך המכונות המרת myogenic כ. ביטוי מאולץ של BAF60C מאפשר MyoD להפעיל ישירות myogenesis השלד בhESCs, בתנאי תרבות ספציפיים, עם BAF60C וMyoD הטלת חתימה אפיגנטיים המתחייבת hESCs כלפי שושלת myogenic 7. ראוי לציין, ניתוח proteomic הקודם חשף את ההיעדר סלקטיבית של BAF60C, בין רכיבי SWI / SNF, ב11 ESCs. השתמשו בידע זה כדי להטיל מחויבות אפיגנטיים של hESCs על שושלת myogenic, מוביל את הדור של אוכלוסייה הומוגנית של myoblasts שלד שיכול להצטבר ליצירת התכווצות תלת ממדים מבנים (myospheres) כי שרירים פונקציונלי לחקות מיניאטורי שלד 7. אכן, השיטה של יצירת תאי אב שרירי שלד מhESCs מסתמכת על המחויבות אפיגנטיים של hESCs לשושלת myogenic, שהוא phenotypically סמויה עד תאים נחשפים לאותות בידול, כגון תא צבירה ותרבות במדיום התמיינות (ראה פרוטוקול ספציפי). אסטרטגיה זו מאפשרת הרחבה של אוכלוסייה הומוגנית של hESCs שepigenetically מחויבים לשושלת שרירי שלד ומתאימה להיווצרות myospheres התכווצות תלת ממדים כי לשחזר היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים של שלדשרירים. Myospheres מספק את ההוכחה הראשונה של שרירים מוקטנים לניצול ל&quot; מחלה בצלחת &quot;מודל של מחלות שרירים. כאשר נוצר מiPSCs המטופל נגזר, יש לי myospheres אלה הפוטנציאל לברר שאלות התפתחותיות ארוכי שנים ופתוגנזה של מחלות נדירות, בנוסף למציע פוטנציאל האדיר ככלי להקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות טיפוליות. אנחנו גם לציין כי קריאת נתונים מיידיות אחד של ניתוח myosphere יכולים להיות מסופקים על ידי אימונוהיסטוכימיה על סעיפים, כפי שתוארו בפרוטוקול יופיטר על ידי גומז et al. 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

דור של אוכלוסייה הומוגנית ושפע של תאי שריר שלד מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הוא דרישה לטיפולים מבוססי תאים ול&quot; מחלה בצלחת &quot;מודל של מחלות neuromuscular אדם. מכשולים עיקריים, כגון שפע וההטרוגניות של האוכלוסייה של עניין, כמו גם חוסר פרוטוקולים להיווצרות של מבני התכווצות תלת ממדים נמוכים, הגבילו את היישומים של תאי גזע לטיפול בהפרעות התוקפת. יש לנו תוכנן פרוטוקול המתגבר על מגבלות אלה על ידי הכנסה מחוץ לרחם של גורמים שהוגדרו בhESCs - MyoD גורם נחישות השריר והכרומטין SWI / SNF שיפוץ BAF60C רכיב מורכב - כי הם מסוגלים לתכנת מחדש hESCs לתאי שרירי שלד. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול מבוסס כדי ליצור myoblasts נגזר hESC ולקדם את האשכולות שלהם לתוך מבני tridimensional מיניאטורי (myospheres) שרירי שלד מיניאטורי פונקציונלי לחקות 7 </sup&gt;.

איור 1 א מציג סכמטי של הפרוטוקול מוצע כדי ליצור myospheres מhESCs. שלבים הקריטיים כדי לשלוט (מסומן על ידי החיצים) הם את היעילות של הזיהום בhESCs והמרת myogenic בתוך myospheres. בניסויים שלנו אנו מנצלים BAF60C קידוד וקטור lentiviral שנושא הקרינה ה-GFP. אנחנו בדרך כלל להדביק את התאים עם BAF60C וFACS-סוג 72 שעות לאחר הזיהום להעשיר לאוכלוסייה להביע BAF60C. כאשר התאים מגיעים סביב 70-80% מנקודת המפגש, אנחנו להדביק עם lentivirus MyoD. לאחר ההדבקה הראשונה זה בדרך כלל לוקח יומיים או שלושה לתאים כדי להגיע למפגש הזה. איור 1 מציג את רמות ביטוי של גנים אקסוגניים כמו קיפול אינדוקציה ביחס לhESCs לא נגוע. תרשים 1C מציג את הביטוי והפצה ברמת החלבון של הגורמים הציגו. BAF60C<html> ביטוי מוצג כקרינת ה-GFP, ואילו ביטוי MyoD הוא זוהה על ידי immunofluorescence עם נוגדן MyoD. אנו רואים ביום 0 היום אנחנו מתחילים את הבידול של hESCs הנגוע לתוך אגרגטים כמו EB. לאחר 15 ימים במדיום DM, חלק מmyospheres (בדרך כלל גם כל אחד) מוטבע במתחם אוקטובר 12 ומחולק לבצע immunofluorescence עבור סמני myogenic כדי לבדוק את יעילות המרת myogenic. 1D איור תערוכות מכתים נציג לmyogenin ושרשרת כבדה שרירן ב בידול myogenic אופטימלי. Myospheres יכול לקבל צורות שונות או יוצאות דופן, אולי כתוצאה מהתמזגות עם myospheres קטן יותר. החל מיום 10, אפשר להתבונן התכווצות סדירה בmyospheres (ראה סרט 1 ו -2). &quot;/&gt; 43/51243fig1.jpg איור 1.) סכמטי של הפרוטוקול המשמש לייצור myospheres מhESCs. B) רמות ה-mRNA של גנים אקסוגניים בhESCs נגוע בBAF60C וMyoD (H9-BM) פיקוח על ידי qRT-PCR והביע כאינדוקציה לקפל, כמו לעומת ללעוג hESCs הנגוע תמונות Immunofluorescence (H9-CTR). C) מראים כתמי MyoD (אדום) וקרינת BAF60C (ירוק) בשל אלמנט IRES-GFP בוקטור Immunofluorescence. ד &#39;) שבוצע בסעיפי myosphere המוכתמים עבור Myogenin (MYOG ), שרשרת השרירן כבד (MyHC) וcounterstained לDAPI (ראה פירוט Immunofluorescence). בר סולם הוא 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> איור 2. תמונות מייצגות של מראה תא בשלבים שונים שלפרוטוקול מהזיהום (חלק I) לבידול (חלק ב &#39;). בר סולם הוא 100 מיקרומטר. ואילו מבנים דמויי-EB מD1 ל D5 הם בעיקר בצורה עגולה (ד &#39;), myospheres גדל מעל 15 ימים על פי התכנית באיור 1 א מציגה צורה בלתי צפויה והן הטרוגנית בתרבות; לראות שתי דוגמאות בE ו-F.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות של אדם שרירי שלד.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Views.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  כאן אנו מתארים פרוטוקול המבוסס על תכנות מחדש אפיגנטיים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לכיוון יצירת אוכלוסייה הומוגנית של אבות שלד שריר כי בתנאי תרבות המתירנית יצירת צבירים תלת ממדיים של myofibers ההתכווצות (myospheres), אשר מסכמים תכונות ביולוגיות...

Video: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

מ MEFs כדי Matrigel אני: hESCs Passaging בנוכחות MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

מ MEFs כדי Matrigel 2: hESCs פיצול מן MEFs על Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts עכבר עובריים עם פקטור ארבעה תמלול, דוקסיציקלין ועין מתנהלת מערכת התמרה lentiviral

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

בתכנות מחדש vivo של תאים סומטיים למבוגרים לpluripotency ידי ביטוי יתר של גורמי יאמאנאקה

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.