הפרוטוקול שלנו מתאר שיטת מיקרומילינג ברזולוציה גבוהה לייצור מכשיר מיקרופלואידי אקרילי לזיהוי חיסוני כמותי של ריכוזי אנליטים הדומים לטכניקת ELISA בתקן הזהב. גולת הכותרת היא ייצור של מכשיר מיקרופלואידי תרמופלסטי פשוט וזול ללא חדר נקי, המאפשר זמני בדיקה קצרים יותר ומגבלות זיהוי טובות באופן כמותי. מתחילים בשחיקה על פני השטח.
חתוך 9 מלבנים בגודל 25 מילימטר של PMMA בעובי 1.3 מילימטר עם סיבית טחנת הקצה של 800 מיקרומטר. חבר את אחד המלבנים הללו בזהירות עם סרט דבק דו-צדדי לפלטפורמה הפיאזואלקטרית. חבר והנח את חיישן Z על פני השטח של מלבן PMMA.
בחר את פין הזיהוי והזז אותו מעל משטח החיישן. הנמיכו את הסיכה באופן ידני מבלי ליצור קשר עם החיישן. הפעל את מצב חישת Z-zero.
סובב את טחנת הקצה של 200 מיקרומטר ב-14, 500 סל"ד. הורידו אותו באיטיות לקואורדינטות המקור על ציר z. לאחר מכן אפס את ציר z 30 מיקרומטר מתחת למקור.
הגדר קואורדינטות אלה כמקור Z החדש. לחץ על גזירה כפתור בתוכנת מכונת המיקרומילינג כדי להפעיל את לוח החיתוך. לחץ על הלחצן הוסף ובחר את קובץ TXT עם קוד שנוצר בעבר עבור שחיקה של משטח אקריליק.
לחץ על פלט כפתור כדי להתחיל בתהליך. עבור כרסום של הגבלת חמישה מיקרומטר, הראשון, להגדיר את מהירות הסיבוב של סיבית טחנת הקצה ל 11, 000 סל"ד. לאחר מכן, הרם את הפלטפורמה ב -6.5 מיקרומטר עם הממשק של הפלטפורמה הפיאזואלקטרית.
הזיזו את טחנת הקצה מעט לאורך ציר ה-y ב-500 מיקרומטר. החזר את הפלטפורמה הפיאזואלקטרית לערך ההתחלתי שלה על ציר z עם ממשק הבקרה. לאחר מכן, בצע כרסום של microchannels על ידי פתיחת קובץ העיצוב שנוצר בעבר מתוכנת העיצוב.
לחץ על כפתור ההדפסה, גש לתפריט המאפיינים ולחץ על חלון הצבע המתאים לשכבה המכילה את העיצוב שיש לעבד. קבעו את פרמטרי הייצור בחלונית הכלים. עבור כרסום של חורים, עבור אל סיבית טחנת הקצה 800 מיקרומטר.
הפעל את שכבת העיצוב של החורים בקוטר 1.2 מילימטר על ידי לחיצה על חלון הצבע המתאים ובחירת פרמטרי הייצור המתאימים. המכונה שני חורים נוספים בפינות קונטרלטרליות של המלבן ליישור האקריל באופן הפוך על פלטפורמה חדשה. הפוך את האקריליק והדביק אותו עם סרט דבק דו צדדי על המתאם עם העמודים המעובדים.
פתח את הקובץ עם העיצוב של החורים עבור הפנים ההפוכות מתוכנת העיצוב. טוחנים את המחצית הנותרת של חורי הכניסה והיציאה המגיב בקוטר של 1.5 מילימטרים ובעומק של 0.7 מילימטרים. יש לנקות את יריעות המלבן האקריליות עם אלכוהול איזופרופיל ולשטוף במים מזוקקים.
לטבול את אקריליק באמבט קולי במשך 10 דקות. יבשו את שתי יריעות האקריל והדביקו אותן לחלק הפנימי של מכסה צלחת פטרי מזכוכית עם סרט הדבקה דו צדדי. לאחר מכן מניחים את בסיס צלחת פטרי הזכוכית בתוך צלחת פטרי זכוכית גדולה יותר.
יוצקים מיליליטר אחד של כלורופורם לבסיס צלחת פטרי ומניחים במהירות את המכסה עם יריעות האקריליק. הוסיפו מיד מים מזוקקים לבסיס צלחת הפטרי הגדולה יותר עד לגובה מכסה צלחת פטרי. אפשר חשיפה של האקריליק לגז כלורופורם למשך דקה אחת.
לאחר מכן הטה את צלחת הפטרי כדי לשבור את חותם המים ומיד גלה את צלחת פטרי. להדבקה, יישרו את שני האקריליקים עם הצדדים החשופים לכלורופורם פנים אל פנים וצרו סנדוויץ'. מניחים את האקריליק במכבש למשך שני מרווחים של שתי דקות, ומשנים את יישור האקריליק.
לאחר מכן חבר שניים עד שלושה סנטימטרים של צינור לכל אחד מהחורים של המכשיר עם דבק נוזלי מתייבש מיידית. ממלאים את התעלות במים מזוקקים באמצעות מזרק. לטבול את המכשיר באמבט קולי במשך 10 דקות.
לאחר מכן רוקנו את המים בתוך תעלות המכשיר והשתמשו במזרק כדי להציג תמיסת BSA של 5%. הכינו תרחיף של מיקרו-חלקיקי ברזל בקוטר של 7.5 מיקרומטר ב-5% BSA. דגרו את השבב ואת מתלה המיקרו-חלקיקים עם תמיסת החסימה למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הכנס את המיקרו-חלקיקים לתוך השבב עם מחט מזרק דרך צינור היציאה הצדדי. מניחים את השבב אנכית, ואז מסובבים את השבב בשני שלבים של 90 מעלות כך שהמיקרו-חלקיקים מכוונים וקומפקטיים במגבלת חמשת המיקרומטרים. אטמו את כל הצינורות של המכשיר האקרילי בחום.
חותכים את צינור הכניסה עד שנותרו רק כמה מילימטרים. מלאו את מחט החלוקה במאגר כביסה והכניסו אותה לצינור החתוך. תן לפתרון לטפטף ולאחר מכן לחבר את המחט למכשיר.
חותכים את צינור היציאה מהערוץ הצדדי, ולאחר מכן מתחברים למשאבת המזרק. לאחר מכן, חזור על אותו הליך עבור צינור יציאת הערוץ הראשי. לאחר מכן חבר את השבב למגנט.
עבור זיהוי חיסוני, שמור על מאגר הכביסה זורם במשך 10 דקות במהירות של 50 מיקרוליטר לשעה. הסר את חיץ הכביסה הנותר ממחט החלוקה באמצעות מיקרופיפט והוסף 50 מיקרוליטר מתרחיף הננו-חלקיקים. הזרימו את תרחיף הננו-חלקיקים במשך שבע דקות בקצב זרימה של 100 מיקרוליטר לשעה.
לאחר מכן שנה את קצב הזרימה ל -50 מיקרוליטר לשעה והמשיך את הזרימה עוד 15 דקות. החליפו את מחט החלוקה והזרימו את חיץ הכביסה למשך 10 דקות באותו קצב. הסר את חיץ הכביסה הנותר ממחט החלוקה עם מיקרופיפטה והוסף 100 מיקרוליטר של המצע הפלואורוגני.
התאם את פרמטרי קצב הזרימה והזמן עבור קלט מצע, מדידת פלואורסצנציה ושלב הכביסה. הפעל את זרימת הקלט של המצע הפלואורוגני במשך שש דקות ב 50 microliters לשעה. 15 שניות לפני שזרימת המצע נפסקת, הפעילו את הפלואורסצנציה של המיקרוסקופ.
התחל את לכידת התמונה עם התוכנה של מצלמת המיקרוסקופ 10 שניות לפני שהמצע נעצר עם זמן חשיפה של 1, 000 אלפיות השנייה. לחץ על כפתור התחל של פרמטר קצב הזרימה הרצוי מיד לאחר הפסקת שטיפת המצע. בצע הדמיה במשך שש דקות במסגרת אחת לשנייה.
לחץ על לחצן התחל של זרימת הכביסה מיד לאחר הפסקת זרימת המדידה שנבחרה. ננו-חלקיקים מצומדים של ליזוזים ונוגדן משני מצומד של צנון סוס שימשו לבדיקה החיסונית. נצפתה עלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות לריכוזים שונים של נוגדנים ראשוניים בהשוואה בין אזורים לפני ואחרי המלכודת, והראתה שהשינוי בפלואורסצנטיות המצע עומד ביחס ישר לריכוז הנוגדן הראשוני.
עבור ריכוז נתון של נוגדן ראשוני, עוצמת הפלואורסצנטיות תוכננה כפונקציה של זמן בקצבי זרימה שונים של המצע הפלואורוגני. יכולת ההמרה של המצע על ידי אנזים HRP הייתה ביחס הפוך לקצב הזרימה, עוצמה מקסימלית התקבלה עבור קצב זרימה של מיקרוליטר אחד לשעה. עבור קצבי הזרימה השונים עבור ריכוזי נוגדנים ראשוניים שונים, עקומות של ההבדלים הפלואורסצנטיים לאחר ולפני התגובה החיסונית הראו כי עבור ריכוז של 1, 000 ננוגרם למיליליטר, הרוויה הפלואורסצנטית עבור כל קצבי הזרימה המוערכים.
עקומת כיול הוכנה תוך שימוש בערך המרבי של ההבדלים בעוצמת הפלואורסצנטיות שהתקבלו ביחס לריכוז הנוגדן הראשוני לכל קצב זרימה. השונות הגבוהה ורמות הפלואורסצנטיות הגבוהות במיקרוליטר אחד לשעה הצביעו על כך שהקצב אינו מעדיף את זרימת המצע המגיב ונוטה להצטבר מיד לאחר המלכודת. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשלבי האיטום של המיקרו-ערוצים מכיוון שהחשיפה לכלורופורם רגישה מאוד לטמפרטורה.
לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור, הטמפרטורה חייבת להיות תמיד זהה. המערכת שלנו מסייעת להבין היכן קומפקטיות וגודל של מיקרו-חלקיקים, גודל ננו-חלקיקים, אנטיגנים, נוגדן זיהוי ומצע הם הגורמים הקובעים את גבול הגילוי בבדיקה חיסונית מיקרופלואידית מבוססת ננו-חלקיקים.
