מחקר כדי למנוע עיוורון; Bartly ג&#39;Mondino MD, מנהל מכון עיני ז&#39;ול שטיין, אוניברסיטת קליפורניה, ורמירו רמירז-סוליס, ג&#39;קי הלבן, וז&#39;אן Estabel במכון סנגר, קמפוס הגנום Wellcome Trust. מחקר זה תואם את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזותי.

1. Dissection הבוטה: enucleation של עין העכבר בדגימות מבולבלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את העפעפיים כדי לשפר את החשיפה וגישה למשטח הגלובוס האחורי (גלגל עין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מלקחי הלבשה מעוקלים מאחור (תחת) את כדור הארץ במסלולו (שקע עין). Mahajan Sharptip הלבשת המלקחיים הם מכשיר מותאם אישית עם מחודדים כדי לעשות את הצעד הזה קל יותר (ראה טבלת חומרים וריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המלקחיים ותופס את רקמת חיבור מסלולית ועצב אופטי מאחורי העולם בעת היותו זהיר ולהימנע מסחיטת הגלובוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את המלקחיים כלפי מעלה וקוטף את גלגל העין ממסלולו. הרקמות הלבנות דמויות חוט היא עצב הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העין בPBS. באמצעות מחט 30-מד, לבצע ניקור יחיד לפצוע מייד אחורי לימבוס ידי הוספת 1-2 מ&quot;מ המחט לתוך גלגל העין. זה מאפשר fixatives, כגון glutaraldehyde, שאחרת לא הצליחו לחדור לרקמות העין, לישירות enter העין. יצירה של פצע זה לא יכול להיות הכרחית אם מקבע, כגון paraformaldehyde או אלכוהול, הוא מסוגל לשדר לרקמות עין של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כל העין באופן מיידי למקבע לקיבעון טבילה. </li></ol> 2. Dissection שארפ: enucleation של קיבעון זלוף בא עין העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Colibri מלקחיים מעוקלים, כדי להחזיק את העפעף מהעולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים מעוגלים אוריינט Westcott נתיחה מקביל לעולם, תוך חתירה לכיוון חלק האחורי של המסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את רקמת חיבור הקבועה שמקיפה את הגלובוס מהצדדים הנחותים, המדיאלי, המעולים, ורוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המלקחיים המעוקלים מאחורי העולם, אחוז ברקמת החיבור, מבלי ללחוץ על הגלובוס, ולמשוך קדימה כדי enucleate העין. מאז רקמת חיבור מסלולית היא נוקשה מקיבעון זלוף, חיתוך נוסף של רקמות מסלול עשוי להיות נחוץ כדי לשחרר את הגוש לחלוטיןדואר. </li></ol> 3. קיבעון ואריזה משלוח של רקמות קבועות חייב לעקוב אחר הדרישות המוסדיות ודואר שירותך כולל תוויות ואריזה מתאימות. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה למשלוח דגימה ביולוגית שאינן מדבקת בטמפרטורת הסביבה. זה דורש 3 שכבות של אריזה אבל לא ברמת חומר ביולוגי / B או תוויות של חנקן נוזליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העין לתוך בקבוקון זכוכית נצנץ 5-מ&quot;ל עם לפחות מקבע 3-מ&quot;ל, או הבולם לאחר מקבע אם הקיבעון הוא קצר. כתוב את מספר המעקב על מכסה מכל ולאטום אותו עם Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקוני scintillation מקום לדגימה ביולוגית שאושרו מכולה. במכון שלנו, למשל, מכולות שאושרו דורשות שלוש שכבות: מכל אטום שבמדגם ממוקם, שכבה אמצעית סופגת, ושכבה חיצונית ומגנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המכל לתוך חבילת אריזות בועות ולאחר מכן ליישוםמכל שוטט מעבדת משלוח יחד עם תיעוד מתאים. </li></ol> 4. נציג תוצאות בדיקה היסטולוגית של עיניים יכולה להתבצע על ידי מגוון שיטות, כולל Hematoxylin ומכתימים Eosin, זיהוי ביטוי האנזימטית מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים, ואימונוהיסטוכימיה. לאחר טבילה בקיבעון paraformaldehyde 4%, רקמה הייתה מוטבעת בפרפין ונותח על microtome. בphenotyping תפוקה גבוהה, אנו מנתחים את סעיפי עצב אופטי תלמיד שהמדגם כל סוגי הרקמות בעין (איור 1). קטעי הרקמה נבדקו גם לביטוי lacZ (איור 2), מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של אברונים סלולריים (איור 3), וביטוי של מולקולות ספציפיות עם נוגדנים (איור 4). בשיטת הקרנת הפנוטיפ שלנו, זה לא היה חשוב לשמור על נטייה של העין ביחס לאף (canthus מדיאלי) וזמן (lateraצדדים) l canthus. יש לפחות שתי אפשרויות אם נטיית עין היא הכרחית. לאחר enucleation, יש לנו להחיל כוויית אור לקרנית הזמנית במעמד 03:00 עם מכשיר כוויית כף יד. הנגע ברור על היסטולוגיה ואינו הולכות לאיבוד בעיבוד כמו דיו היסטולוגית. החסרון הוא כי ניזקי כווייה בקרנית, אשר עשוי להיות קריטיות לבדיקת רקמות. האפשרות האחרת דורשת אנטומיה מיומנת שיכול לזהות את הוספות שרירי extraocular. תחת stereomicroscope, זיהוי של הכנסת השרירים האלכסוניות מעולה הנחותה ומסמן את ההיבט הנח ומעולה של הגלובוס. 3 עם אף אחת משיטות ההתמצאות, חשוב לעקוב אחר הדגימה כעינו ימנית או שמאלית. יחד, זה יאפשר התמצאות עולם מדויקת לקראת חתך. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. תמונות היסטולוגית עין עכבר afte<html> מרחוק רכישת r. עיניים מאוסות enucleated ידי נתיחה חדה בעקבות קיבעון זלוף עם paraformaldehyde 4%. סעיף א תלמיד אופטי עצבים מוכתמים בHematoxylin וEosin מראה שימור של כל substructures הרקמות. ON, עצב ראייה. (סרגל קנה מידה ירוק = 500 מיקרון) ב &#39;מבט גבוה יותר גדלה של הרשתית הנורמלית מראה את המבנה שלה מינרית:, תאי הגנגליון ברשתית RGC;, השכבה פנימית plexiform IPL; שכבת INL, פנימית גרעינית;, השכבה חיצונית plexiform OPL; ONL, חיצוני שכבה גרעינית (תא photoreceptor) (חץ); IS, מגזרי photoreceptor פנימיים (ראש חץ); OS, קטעי photoreceptor חיצוניים; RPE, אפיתל הפיגמנט ברשתית; C, דמה עין. (סרגל קנה מידה ירוק = 50 מיקרון) ג בהשוואה לרשתית הנורמלית, העותק הזה הוא דק יותר בשל התנוונות photoreceptor. ONL, IS, ומערכת ההפעלה נעדרת לחלוטין (חץ). (בר סולם ירוק = 50 מיקרון) &quot;Alt =&quot; איור 2 &quot;/&gt; איור 2. ביטוי lacZ בעכברים הטרנסגניים. עיניים היו enucleated ידי נתיחה בוטה ושקוע בפתרון 1 מ&quot;ג / מיליליטר X-גל (5 מ&quot;מ K3Fe (CN) 6, 5 המ&quot;מ K4Fe (CN) 6, 2 מ&quot;מ MgCl2, 0.02% NP40 , ו -0.1% deoxycholate נתרן) לילה בשעת 37 ° C. עיניה היו נעוצות ב2% glutaraldehyde formaldehyde/0.2% במשך 30 דקות ומחולקות בmicrotome. X-Gal מוצרים (כחול) תוויות: א ריסי האפיתל, האפיתל של קרנית ב &#39;, וג גנגליון תא שכבת הרשתית (RGC) ברשתית. INL, שכבה פנימית גרעינית; שכבת ONL, חיצונית גרעינית. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של אפיתל הפיגמנט ברשתית (רשתית). לאחר נתיחה ויצירה בוטות של פצע, עיניים היו טבילה קבועה בParaformaldehyde 2.5% / 2.5% בGlutaraldehyde חיץ פוספט נתרן 0.1M. עיניים היו seconקבוע darily ב1% textroxide אוסמיום, בהדרגה מיובשת, ומוטבע בשרף של Spurr. הרקמה נותחה ב 90 ננומטר והניחה על גבי רשתות הימורי נחושת המכוסית בFormvar וצלמה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים. מיקרוסקופ תערוכות, מגזרי photoreceptor חיצוניים של הרשתית, נוירו melanosomes (M) בתוך אפיתל הפיגמנט ברשתית, וקרומו של ברוך. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. תיוג immunohistochemical של dismutase-3 superoxide (ירוק) בזגוגית העכבר. עיניים היו enucleated ידי נתיחה בוטה ועבר קיבוע טבילה בparaformaldehyde 4%. הם גלומים בנפט, ונותח באמצעות microtome. סעיפי רקמות הודגרו עם ארנב SOD3 antiserum polyclonal דילול 1:50. SOD3 ביטוי אובחן באמצעות עיזים נגד ארנב IgG (H + L)-Alexa פלואוריד 488 נוגדנים משניים מצומדות. תיוג של SOD3 מוצג בGREen.

<ol>
	<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+Mouse+Eye+Phenomics+System.">A high-throughput Mouse Eye Phenomics System.</a> Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).</li><li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Research Methods For Mutant Mice. , (2002).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+genes+encoding+melanosomal+proteins+cause+pigmentary+glaucoma+in+DBA/2J+mice.">Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice.</a> Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).</li><li>Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+from+screening+over+9000+mutation-bearing+mice+for+defects+in+the+electroretinogram+and+appearance+of+the+fundus.">Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus.</a> Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).</li><li>Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+mouse+retinal+degenerations.+I.+Correlation+of+indirect+ophthalmoscopy,+electroretinograms,+and+histology.">Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology.</a> Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).</li><li>Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+in+mice+lacking+the+gamma+subunit+of+the+rod+cGMP+phosphodiesterase.">Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase.</a> Science. 272, 1026-1029 (1996).</li><li>Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+carrying+the+H258N+mutation+in+the+gene+encoding+the+beta-subunit+of+phosphodiesterase-6+(PDE6B)+provide+a+model+for+human+congenital+stationary+night+blindness.">Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness.</a> Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

עכברים הטרנסגניים ביותר קיימים במעבדות שלא לבחון את העיניים. טכניקת הווידאו שלנו ממחישה שיטה פשוטה, סטנדרטית להעברת מיומנות כירורגית מרחוק כדי לייעל את רכישת רקמה ממעבדות עם ניסיון מועט עם העיניים. טכניקה זו עוזרת להתגבר על וידאו מכשלה עיקרית בphenotyping תפוקה גבוהה, שה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגים </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> מלקחי הלבשה מעוקלים </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> Mahajan Sharptip הלבשת מלקחיים </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1406 (REF SP7-64520) </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מעוגלים Westcott </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3321 WH </td><td></td></tr><tr><td> 15 ° BD ביבר המייקר Blade </td><td> קיטון דיקינסון- </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 מלקחי תפירה עדין Castroviejo </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0.12 מלקחי קוליברי </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2/132 </td><td></td></tr><tr><td> מחט 30-מד </td><td> קיטון דיקינסון- </td><td> 305128 </td><td></td></tr><tr><td> Biohazard מיילר </td><td> דיג </td><td> 03-523-4 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> דיג </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית בקבוקוני נצנץ </td><td> ויטון </td><td> 4500413033 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 7.4 pH </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15700 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5% Paraformaldehyde / 2.5% Glutaraldehyde בחיץ פוספט נתרן 0.1M </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15700 &amp; 16300 </td><td> מעורב במעבדה </td></tr><tr><td> 50% Glutaraldehyde </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 16300 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar% 0.25 </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15810 </td><td></td></tr><tr><td> שוטרלגריד משבץ </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> M2010-CR </td><td></td></tr><tr><td> 4% tetroxide אוסמיום </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 19140 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי SOD3 </td><td> Abcam </td><td> Ab21974 </td><td></td></tr><tr><td> עיזים נגד ארנב Alexa פלואוריד 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A11070 </td><td></td></tr><tr><td> השרף של Spurr ההטבעה </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 14300 </td><td></td></tr></tbody></table>

mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping

עין העכבר היא מודל גנטי חשוב למחקר translational של מחלת עיניים אנושית. מחלות מסנוורות בבני אדם, כגון ניוון מקולרים, ניוון photoreceptor, קטרקט, גלאוקומה, רטינובלסטומה, רטינופתיה סוכרתית וכבר סכם בעכברים מהונדסים. 1-5 עכברים הטרנסגניים ונוקאאוט רוב נוצרו על ידי מעבדות ללמוד מחלות שאינן לרפואת עיניים, אבל שימור גנטי בין מערכות איברים עולה כי רב מאותם הגנים עלולים גם לשחק תפקיד בהתפתחות מחלה ועינית. לפיכך, העכברים האלה מייצגים משאב חשוב לגילוי מתאמים חדשים גנוטיפ-פנוטיפ בעיניים. כי עכברים אלו מפוזרים על פני הגלובוס, קשה לרכוש, לתחזק ופנוטיפ בצורה יעילה וחסכונית. לפיכך, מסכי phenotyping רפואת עיני תפוקה הגבוהה ביותר מוגבלים לכמה מקומות שדורשים באתר, מומחיות העינים לבחון את העיניים בעכברים חיים. 6-9 גישה חלופית שפותחה על ידי המעבדה שלנו היא שיטה לרקמות רכישה מרחוק שניתן להשתמש בו בסקרים גדולים או בקנה מידה הקטן של עיני עכבר מהונדסות. נהלים סטנדרטיים להעברת וידאו מבוסס כירורגית מיומנות, קיבעון רקמות, ומשלוח לאפשר לכל מעבדה כדי לאסוף עיניים שלמות מבעלי חיים מוטנטים ולשלוח אותם לphenotyping מולקולרי ומורפולוגי. במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקות לenucleate ולהעביר עיני עכבר קבועות גם מבולבלות וזלוף לניתוחי phenotyping מרוחקים.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping at JoVE.com

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

mouse-eye-enucleation-for-remote-high-throughput-phenotyping

Research

JoVE Journal

Medicine

20.1K Views.  University of Iowa. טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

Video: Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps ב, עכברים מודעת בלתי מרוסנת

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

Remote Magnetic Navigation for Accurate, Real-time Catheter Positioning and Ablation in Cardiac Electrophysiology Procedures

New remote navigation systems have been developed to improve current limitations of conventional manually guided catheter ablation in complex cardiac substrates such as left atrial flutter. This protocol describes all the clinical and invasive interventional steps performed during a human electrophysiological study and ablation to assess the accuracy, safety and real-time navigation of the Catheter Guidance, Control and Imaging (CGCI) system. Patients who underwent ablation of a right or left atrium flutter substrate were included. Specifically, data from three left atrial flutter and two counterclockwise right atrial flutter procedures are shown in this report. One representative left atrial flutter procedure is shown in the movie. This system is based on eight coil-core electromagnets, which generate a dynamic magnetic field focused on the heart. Remote navigation by rapid changes (msec) in the magnetic field magnitude and a very flexible magnetized catheter allow real-time closed-loop integration and accurate, stable positioning and ablation of the arrhythmogenic substrate.

This report provides a detailed description of a new remote navigation system based on magnetic driven forces, which has been recently introduced as a new robotic tool for human cardiac electrophysiology procedures.

ניווט מגנטי מרחוק למיקום מדויק, בזמן אמת ואבלציה צנתר בלב Electrophysiology נהלים

New remote navigation systems have been developed to improve current limitations of conventional manually guided catheter ablation in complex cardiac ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

תפוקה גבוהה ELISA סדרתית עבור אימות של סמנים ביולוגיים של מחלות אקוטיות שתל נגד מארח

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

תפוקה אפיון גבוה של תאי גזע בוגרי תכנון הנדסי למשלוח גורמים טיפוליים לאסטרטגיה הגנה עצבית

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the quality of life. BPH includes 2 major treatments: medication and surgery. Surgical treatment is often the most effective and final intervention. Holmium laser enucleation of the prostate (HoLEP), one of the most efficient surgical procedures for BPH, is conducted transurethrally. During surgery, the most important and most difficult part is to locate the surgical capsule of the prostate, which is consistent to the idea of anatomic surgery. Different skills may be needed in treating different parts of the prostate. HoLEP tends to be efficient and safe with good hemostatic properties, and able to treat bladder calculus, which may be the complications of BPH. The technique is particularly suitable for prostate of varying volumes and sizes. Indeed, HoLEP also presents certain disadvantages, such as a long learning curve and costly equipment. Regardless, this method may be the "new standard" and the excellent method for the surgical treatment of BPH.

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate HoLEP.

Here we present a safe and efficient protocol, holmium laser enucleation of the prostate, to treat benign prostatic hyperplasia.

טיפול כירורגי עבור הגדלה שפירה: לייזר הולמיום העקירה של הערמונית (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the ...

Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant for targeting neovascular glaucoma, a sight-threatening complication of diabetic retinopathy. This method is based on the induction of iris vascular response by a series of self-sealing uveal punctures on BALB/c mice and takes advantage of the postpartum maturation of mouse ocular vasculature. Mouse pups undergo uveal punctures from postnatal day 12.5, when the pups naturally open their eyes, until postnatal day 24.5. Due to the transparency of the cornea, iris vasculature can be analyzed easily through time by noninvasive in vivo methods. Furthermore, the semitransparent iris of BALB/c mice can be flatmounted for detailed immunohistologic analysis with minimal non-specific background staining. In this model, angiogenesis is mainly driven by the inflammatory and plasminogen activating systems. The puncture-induced model is the first to induce iris neovascularization in small rodents, and has the advantage of allowing direct noninvasive in vivo analysis of the angiogenic process. Moreover, the model can be combined with angiogenic modulating substances, which highlights its potential in the study of angiogenesis with an in vivo perspective.

Iris neovascularization, a common complication of ischemic retinal disease, may lead to sight-threatening neovascular glaucoma. Here, we describe a murine protocol for inducing experimental iris neovascularization that may be used for noninvasive evaluation of angiogenesis-modulating substances.

ניקוב-Induced כורוידאלית איריס כמודל העכבר של Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...