מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע הוענק JOD (OCE-0623475), SPC (OCE-0623534 ו - 0727544), ו JHC (OCE OCE ו-0727587, 0623508), וכן על ידי משרד המחקר של הצי הוענק JHC ( N000140810654). KK נתמכת על ידי תוכנית חוקר פוסט דוקטורט במכון וודס הול לאוקיאנוגרפיה, עם במימון קרן Devonshire.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בהליך זה, אנו מבטיחים כי כל הרכיבים SCUVA יש סוללה מספיק, סרט ההקלטה (עבור-high-definition או מצלמת וידאו HD), וכן לתפקד כראוי. בהתאם זורם למדוד, לבחור מצלמת וידאו ברזולוציה מסגרת שיעורי תשואה כי התוצאות הטובות ביותר עבור velocimetry תמונה דיגיטלית החלקיקים (DPIV). 1,2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המצלמה מעטה לייזר לשימוש על ידי ניקוי O-טבעת חריצים O-טבעות עם מגבת נקייה או לנגב. יצרן מורחים בתנאי O-טבעת שומן באופן שווה על O-טבעות ולהחליף אותם חריצים דיור. בנוסף, נקיים הלייזר ואת המצלמה פתחים הדיור כדי למנוע עיוות גיליון לייזר וסימני על העדשה דיור המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את O-טבעת חותמות על ידי הצבת שני מעטה ריק באמבט מלא מים. אובייקטים משוקלל צריך להיות מונח על גבי מעטה כדי להטביע אותם מאז מעטה לצוף כאשר ריק. לאחר 5 עד 10 דקות, להסיר את מעטה מהאמבטיה ואת לא מגבת יבשההוא בחוץ. בדוק אם יש לחות בתוך מעטה. כמו כן לשקול שימוש חד פעמי, לחות רצועות נייר במהלך הבדיקה לחץ כדי לציין אם יש לחות מעטה לאחר הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מעטה במבחן הלחץ, במקום רכיבים SCUVA בתוך מעטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף בעוצמה גבוהה (HID) פריקה אור תרמילי לדיור המצלמה. ודא כי האורות מכוונים באופן כזה שהם מאירים את האזור ישירות לפני המצלמה מפעיל, ולא להפריע שמירה על ידיות אחיזה ותפעול של בקרות המצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה של תאורה נמוכה, להבטיח את קרן הלייזר מיושר כראוי ביחס העדשה אופטי מותקן דיור הלייזר. כאשר מיושר כראוי, שילוב לייזר / עדשות תיצור גיליון אנכי של אור מכוונת בניצב דיור המצלמה. בטיחות, שימוש גיליון טמפרטורה רגיש נייר כדי לקבוע אוריינטציה לייזר הגיליון. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקבצים מצורפים SCUVA ואת הזרוע נוקשה, להארכה, להתחבר הדיור לייזר הדיור מצלמה זו לזו. ודא מעטה מחוברים בחוזקה מעטה כי אינו יכול לסובב בכבוד זה לזה. זה קריטי, כי את הגיליון מונחה לייזר נשאר בניצב לשדה של המצלמה להציג במשך המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשל היכולות הנוכחיות של SCUVA, צלילות המדידה יכול להיות רק שנערך בתאורה נמוכה במקומות או בשעות הלילה כדי למנוע הפרעות של אור טבעי עם הסדין לייזר. לכן, אנו ממליצים להמתין עד השקיעה או במאוחר לפני הכניסה למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דיור המצלמה לפני הכניסה למים. דיור מצלמה בעלת חיישן מובנה לחות אלקטרוניים המספקת אזהרות חזותית (להבהב נורות LED) במקרה של רטיבות דיור המצלמה. החיישן פועל רק כאשר המצלמה היא על דיור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCUVA לטבול במים לצרף את מנגנון לעצמך באמצעותקו. מחוברים ברגע למנגנון, לשחרר SCUVA כדי לקבוע את מאפייני הציפה של המכשיר. בהתאם למאפיינים הציפה, הציפה לצרף קצף או להוביל משקולות אחד או שניהם מעטה כדי להבטיח ציפה ניטרלית ולמנוע סיבוב המנגנון בתוך המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לעבור על הלייזר והחזק המנגנון נייח. מקם את הלייזר באמצעות זרוע להארכה מספיק רחוק הצוללן כדי למזער את המדידה של צוללן המושרה זורם. כל המדידות של צוללן המושרה זורם ליד המטרה להציג את השגיאה ולא משמשים לניתוח שלאחר מכן. כוונן את הזום במצלמה עד בתחום מסגרות להציג את היעד והנוזלים המקיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שמירה על מנגנון נייח, למקד את מצלמת הווידיאו על הסדין לייזר עד חלקיקים מופיעים חדה בפוקוס. ברגע שהמטוס גיליון לייזר בפוקוס, לעבור את המצלמה למצב פוקוס ידני. זה ימנע את המצלמה refocusing על כל האובייקטים שמופיעים בתחוםלהציג בזמן המדידה, וכתוצאה מכך חלקיקים מטושטשים בגיליון לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכייל SCUVA, במקום אובייקט עם ממדים ידוע בגיליון לייזר בתחום של המצלמה וידאו של התצוגה. שיא למשך כמה שניות. לאחר הצלילה, התמונה תהיה מופק רצף וידאו זה כדי לקבוע את קבוע הכיול אשר ממירה את השדה של גודל תצוגה מיחידות של פיקסלים ס&quot;מ. אם בכל עת למפעיל מתאים את השדה של גודל להציג מחדש לתפקיד זרוע להארכה או לשנות את זום המצלמה במהלך הצלילה, שלבים 12 ו 13 יהיה צורך לחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הצלילה ידי יורד לעומק העבודה. עם מציאת המטרה, תזרים את המאפיינים הסביבתיים בתפזורת צריך להיות נחוש. אם ההווה, את הכיוון הנוכחי יכתיב מנגנון מיצוב צוללן ביחס ליעד במהלך המדידות. כיוון הזרימה בתפזורת סביב יעד ניתן להסיק על ידי התבוננות בועות נשף של הצוללן, ותוך לקיחה תנועה לרוחב שלהם. בתוךבנוסף בועות, כמות קטנה של צבע פלואורסצנטי (כלומר, והעמסת) ניתן לשחרר על מנת לקבוע את הכיוון הנוכחי. מאז צוללן שנוצר זרם יכול להיות מקור של טעות מדידה DPIV, צוללן לא צריך להיות ממוקם במעלה הזרם של היעד. בנוסף, בגיליון לייזר יש למקם במקביל בכיוון הנוכחי כדי למקסם מגורים חלקיק זמן בתוך הגיליון לייזר, ובכך לצמצם טעויות DPIV. עם זאת, אם אין זרימת הנוכחי או בתפזורת קיים, צוללן ומיצוב SCUVA ביחס ליעד הם בלתי מוגבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום SCUVA להאיר ולהקליט את ההצעה נוזל סביב היעד. אם מנסים לתעד את הזרימה סביב מטרה נעה first לחזות את מיקום המטרה, ולאחר מכן SCUVA עמדה במיקום החזוי תוך שמירה על תנועה. כפי יעד נע דרך שדה של המצלמה של נוף, להתחיל את ההקלטה. אם היעד הוא ללא ניע, מסגרת היעד והנוזלים המקיפים את המצלמה וידאו &amp;# X2019; בתחום של השקפה ולהתחיל הקלטה תוך שמירה על תנועה. המפעיל להימנע תנועות הסיבוב ו out-of-מטוס במהלך הקלטת וידאו מאז תוצאה תנועות אלו תוצאות שגויות DPIV. לכן, מדידות שנאספו במהלך הסיבוב ו out-of-מטוס צולל תנועות לא ישמש עבור ניתוח נתונים נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף וידאו תושלם, לכבות את כל המרכיבים של SCUVA ולשחזר את הזרוע לייזר למיקום שלה חזר בו. הסר SCUVA מן המים ולנתק את המצלמה מעטה לייזר מהזרוע. יש לשטוף או להשרות את המכשיר במים מתוקים לפני הייבוש כדי למנוע החלדה של המנגנון. לאחר מעטה הם מיובשים, להסיר רכיבים מן מעטה, וטען ולהחליף את הסוללות במידת הצורך לצלילה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור מצלמת וידאו למחשב ולחלץ וידאו מתוך הקלטת HD באמצעות תוכנת וידאו HD חבילה (כלומר, Adobe Premiere Pro או iMovie). לאחר הווידאו מופק, לקבוע את טווחוידאו כדי להפוך סדרה של תמונות לניתוח DPIV. ודא פיקסל היבט ratios וגדלים התמונה חילוץ להתאים את הגדרות וידאו HD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות אלה מיובאים בתוכנית עיבוד DPIV (כלומר, דייוויס או MatPIV). לאחר בחירה נכונה של קבוע כיול לכידת תמונה פרמטרים, אשר תונחה מחבילת תוכנה DPIV, שדות מהירות יכול להיות שנוצר מתמונות החלקיקים רצופים. נוסף שלאחר עיבוד שלבים, בהתאם לאיכות וסוגי מדידות, יכול להיות מיושם גם 3. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, את התמונות החלקיקים המקיף את היעד יהיה חד קל להבחין. שימוש בשדות החלקיקים שנתפסו באתרו על ידי מצלמת הוידאו של SCUVA (איור 1A) ואת חבילת תוכנה DPIV עיבוד, שדות מהירות הזרימה סביב היעד (איור 1B) יתגלה. וקטורים של המהירותבתחום ty מצביעים גודל וכיוון מהירות הזרימה המקומית. אם הווידאו נאסף מספיק כדי לספק סדרה של תמונות זמן, סדרת זמן של שדות מהירות יכול גם להיות נחושה. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1 נמדד בתחומים החלקיקים באתרו (A) סביב Aurelia labiata. מהירות השדה המתאים (ב) עם וקטורים צהוב המציין כיוון הזרימה ואת העוצמה. <img src="/files/ftp_upload/2615/2615fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2 החלקיקים בשדות שמסביב באתרו Mastigias sp. Solmissus ו sp. (A ו-B, בהתאמה). החץ האדום מצביע על אזור של רפלקטיביות גבוהה, שתוצאתה הרוויה של התמונה, ולכן קשה להבחין בין חלקיקים היעד. החץ האדום מצביע על B אזור של פסים כי התוצאות כאשר קצב הזרימה הואלא נדגמו בתדירות גבוהה מספיק.

<ol>
	<li>Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-imaging+techniques+for+experimental+fluid+mechanics.">Particle-imaging techniques for experimental fluid mechanics.</a> Ann. Rev. Fluid Mech. 23, 261-304 (1991).</li><li>Willert, C. E., Gharib, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+particle+image+velocimetry.">Digital particle image velocimetry.</a> Exp. Fluids. 10, 181-193 (1991).</li><li>Raffel, M., Willert, C., Wereley, S., Kompenhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Particle Image Velocimetry: A Practical Guide. , (2007).</li><li>Agrawal, Y. C., Pottsmith, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+diffraction+particle+sizing+in+STRESS.">Laser diffraction particle sizing in STRESS.</a> Cont. Shelf Res. 14, 1101-1121 (1994).</li><li>Katz, J., Donaghay, P. L., Zhang, J., King, S., Russell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submersible+holocamera+for+detection+of+particle+characteristics+and+motions+in+the+ocean.">Submersible holocamera for detection of particle characteristics and motions in the ocean.</a> Deep Sea Res. 46, 1455-1481 (1999).</li><li>Katija, K., Dabiri, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+field+measurements+of+aquatic+animal-fluid+interactions+using+a+self-contained+underwater+velocimetry+apparatus+(SCUVA).">In situ field measurements of aquatic animal-fluid interactions using a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA).</a> Limnol. Oceanogr.-Meth. 6, 162-171 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אילוץ פוטנציאל בתחום הוא הצורך חלקיקים בזרימה, אשר נחוצים כדי ליישם החלקיקים תמונה דיגיטלית velocimetry (DPIV). במים החוף, חומר חלקיקי מושעה תערוכות גדלים בסדר גודל של 10 מיקרומטר בקוטר ריכוזים בין 0.002 ו - 10 מ&quot;מ ל 3. 4 מחקרים נוספים באמצעות holocamera הצוללת לגילוי חלקיק לאשר נוכחות מספקת של זריעת חלקיקים לבצע DPIV במי האוקיינוס. 5 במהלך צלילה בים הפתוח חופי האוקיינוס, מצאנו כי צפיפות החלקיקים וגדלים אינם אילוץ לביצוע באתרו DPIV. מלבד צפיפות החלקיקים וגדלים, עוד דאגה רלוונטי מדידות DPIV הוא ההומוגניות של ריכוזי החלקיקים. איכותית, אם האזור בתוך חלון חקירה יש ריכוזי החלקיקים גדולה יותר אחר, את גודל מהירות שנוצר על ידי ד &#39;ניתוח PIV יהיה מוטה כלפי האזור עם ריכוזים גבוהים של חלקיקים. לכן, מדידות SCUVA חייב להתנהל בו השתנות ריכוז החלקיקים הוא ממוזער. מצאנו ריכוזים thatcle הם קבועים יחסית במהלך ריכוזי החלקיקים הם קבועים יחסית במהלך צלילות שבו הצולל תלויה באמצע בעמודת המים. עם זאת, שדות החלקיקים בסביבות benthic יש פוטנציאל inhomogeneity בשל resuspension של חלקיקים על ידי תנועות סביבתיות או צוללן-Induced ליד קרקעית הים. יש להקפיד למזער את ההפרעה של חלקיקים במהלך המדידות בסביבות benthic. למיטב המחברים, ניתוח פורמלי של טעויות שנוצר על ידי שדות הומוגניות ריכוז החלקיקים לא נערכו או בתנאי מעבדה או שדה, יש נושא שיקול נוסף בפרסום נפרד. בנושאים שונים יש לשקול בעת הכנת וביצוע ניסויים באתרו באמצעות פרוטוקול. במהלך הקלטת, המפעיל הוא הורה להישאר נייח ולהימנע מכל מטוס מחוץ של תנועה סיבובית. בקשה זו היא פשוטה בתיאוריה, אבל בפועל קשה, ומדידות אלה דורשים מיומנות צלילה מתקדם להסתיים בהצלחה. Out-of המטוס בתנועות הסיבוב של התוצאה המפעיל נתונים שגויים DPIV. עם זאת, מטוס תנועות ניתן לתקן באמצעות in-house תוכנה. 6 מומלץ המפעיל לתרגל שליטה הציפה עבור מספר צלילות לפני השימוש SCUVA כדי למקסם את היעילות המדידה. מלבד השיקולים הציפה, המפעיל צריך להיות מודע לכיוון זרימת היעד. תזרימי כי נסיעה מחוץ למטוס יחסית גיליון הלייזר לא תניב תוצאות DPIV אמין, והמפעיל צריך להתמצא SCUVA ללכוד זרמים אלה בצורה היעילה ביותר. בנוסף, עמדתו של הצוללן יחסית היעד חייב להיות selecteד כדי למזער צוללן-Induced לזרום המדידות. צולל-Induced זרימה מציג שגיאה לזרום היעד, מדידות הכוללות השפעות צוללן לא אמור לשמש לניתוח נוסף. במקרה זה המטרה יש משטח מהורהר מאוד, באזור והנוזלים המקיפים את היעד יהיה מואר מאוד, ולכן קשה להבחין בין חלקיקים בודדים הסמוכה מן הנוזל המקיף (אזור מסומנים בחץ אדום, איור 2A). מסננים מקטבים או ניתן להוסיף את מעטה לייזר או מצלמה כדי להפחית את עוצמת האור הלייזר שנתפסו על ידי חיישן המצלמה וידאו. אם הדבר אינו אפשרי בשל אילוצים לוגיסטיים גישה מוגבלת, שלאחר עיבוד של תמונות באמצעות ציוד in-house תוכנה יכול לספק תיקון מספיק על ידי הפחתת מן התמונות בעוצמות גבוהות פיקסל ליד המטרה. שיקול נוסף אשר משפיע על איכות DPIV נתונים היא אם פסים החלקיקים נמצאים. אם חלקיקשדות יש אזורים של פסים (מסומנת אדום החץ, איור 2B), את מצלמת הווידאו הוא הקלטה בקצב מסגרת נמוך מדי כדי לפתור את מהירויות גבוהות. על ידי הגדלת מסגרת הדולר, פסים חלקיק יכול להיות מופחת. עם זאת, התוצאה היא הפחתה של אור להגיע לחיישן המצלמה וידאו הופך את תחום החלקיקים דימר להסתכל. אם מצלמת וידאו יש את היכולת להגדיר באופן ידני את הגדרות הצמצם, להגדיל את ההגדרה הצמצם כדי למנוע עמעום של השדה החלקיקים. קביעת הגדרות המכשיר האופטימלי עשוי לדרוש צלילות מרובות עם SCUVA לפני איסוף הנתונים מוצלח.

quantitatively measuring in situ flows using a self-contained underwater velocimetry apparatus (scuva)

היכולת למדוד ישירות שדות מהירות בסביבת נוזלים הכרחי כדי לספק נתונים אמפיריים של מחקרים בתחומים מגוונים כמו אוקיאנוגרפיה, אקולוגיה, ביולוגיה, מכניקת זורמים. מדידות שדה להציג אתגרים מעשיים כגון תנאים סביבתיים, זמינות בעלי חיים, ואת הצורך בשטח תואמת שיטות מדידה. כדי להימנע אתגרים אלה, מדענים משתמשים בדרך כלל סביבות מעבדה מבוקרים ללמוד על בעלי חיים נוזל אינטראקציות. עם זאת, סביר השאלה אם ניתן להסיק התנהגות טבעית (כלומר, אשר מתרחשת בתחום) ממדידות מעבדה. לכן, באתרו מדידות זרימה כמותי יש צורך לתאר במדויק שחייה בעלי חיים בסביבתם הטבעית. עיצבנו עצמאי, מכשיר נייד שפועל עצמאית של חיבור כלשהו אל פני השטח, והוא יכול לספק מדידות כמותיות של surrou בשדה זרימהnding חיה. מנגנון זה, מנגנון עצמאי velocimetry מתחת למים (SCUVA), יכול להיות מופעל על ידי צוללן אחד במעמקים עד 40 מ &#39; בשל המורכבות הוסיף הטבועה בתנאי שדה, שיקולים נוספים והכנה נדרשים בהשוואה מדידות במעבדה. שיקולים אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, תנועה המפעיל, לניבוי המיקום של מטרות שחייה, זמין חלקיקי מושעה טבעי, והכיוון של SCUVA לעומת תזרים של עניין. הפרוטוקול הבא נועד לטפל באתגרים אלה בשדה משותף על מנת למקסם את ההצלחה המדידה.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA at JoVE.com

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

פרוטוקול זה מספק הוראות על אופן השימוש מנגנון עצמאי velocimetry מתחת למים (SCUVA), אשר מיועד כימות של בעלי חיים שנוצר זורם באתרה. בנוסף, פרוטוקול זה כתובות האתגרים שמציב בתנאי שדה, וכולל תנועה המפעיל, עמדה בחיזוי של בעלי חיים, והכיוון של SCUVA.

ולמדוד באופן כמותי באתרו תזרימי באמצעות מנגנון עצמאי velocimetry תת (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

quantitatively-measuring-situ-flows-using-self-contained-underwater

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

12.9K Views.  Woods Hole Oceanographic Institution. פרוטוקול זה מספק הוראות על אופן השימוש מנגנון עצמאי velocimetry מתחת למים (SCUVA), אשר מיועד כימות של בעלי חיים שנוצר זורם באתרה. בנוסף, פרוטוקול זה כתובות האתגרים שמציב בתנאי שדה, וכולל תנועה המפעיל, עמדה בחיזוי של בעלי חיים, והכיוון של SCUVA.

Video: Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

יסודות Electrospinning: פתרון אופטימיזציה פרמטרים Apparatus

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים למדידות בפרופיל מהירות של מיקרו זורם דם

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

מכשירי חימום המבוסס על לייזר מותאם אישית המיועדים לשחרור עורר, ציספלטין מThermosensitive יפוזומים עם הדרכת תמונת תהודה מגנטית

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

מכשירי קצירת רקמות Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Meso-גודל החלקיקים תמונה Velocimetry מחקרים של נוירו-וסקולריים זורם במבחנה

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...