תואר שני נתמכה על ידי מענק של שרדינגר קרן המדע האוסטרי (FWF, J3086-B11) ותודה מקס פלנק-החברה לתמיכה כספית ומנהלית. GS וJH נתמכו על ידי קרן המדע והטכנולוגיה וינה (WWTF, LS13-030).

<ol>
	<li>Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+TCR+germline+bias+for+MHC+is+surprisingly+simple.">The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple.</a> Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).</li><li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity.">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature.. 463, 963-967 (2010).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interdisciplinary+science+of+T-cell+recognition.">The interdisciplinary science of T-cell recognition.</a> Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).</li><li>Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Microscopy+on+Planar+Supported+Bilayers.">Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers.</a> Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158 (2015).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocrosslinkable+pMHC+monomers+stain+T+cells+specifically+and+cause+ligand-bound+TCRs+to+be+preferentially+transported+to+the+cSMAC.">Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC.</a> Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).</li><li>Toebes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+use+of+conditional+MHC+class+I+ligands.">Design and use of conditional MHC class I ligands.</a> Nat Med. 12, 246-251 (2006).</li><li>Tsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+recovery+of+functional+single-chain+Fv+fragments+from+inclusion+bodies+overexpressed+in+Escherichia+coli+by+controlled+introduction+of+oxidizing+reagent--application+to+a+human+single-chain+Fv+fragment.">Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment.</a> J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).</li><li>Ruegg, U. T., Rudinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reductive+cleavage+of+cystine+disulfides+with+tributylphosphine.">Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine.</a> Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).</li><li>Ruprecht, V., Brameshuber, M., Sch&#252;tz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+single+molecule+tracking+combined+with+photobleaching+for+the+detection+of+rare+molecular+interactions+in+fluid+biomembranes.">Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes.</a> Soft Matter. 6, 568-581 (2010).</li><li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+self+through+two-dimensional+chemistry+and+synapses.">Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li><li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse.">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).</li><li>Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+repeat+proteins:+well-expressed,+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins.">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

מדידת אינטראקציות בין חלבונים באתרו היא רצויה מאוד במיוחד כאשר התמודדות עם אינטראקציות זיקה נמוכות כגון TCR-pMHC מחייב 11. סיבה לכך הוא על-השיעור, כמו גם את היציבות של אינטראקציות אלה השפיעו באופן משמעותי על ידי נסיבות מסוימות שבהם מחייבים מתרחשים. גישות הדמיה מבוססת סריג מינימאלי פולשנית ולכן הם באופן עקרוני בצורה מושלמת המתאימים למשימות כגון, עדיין כרוכות במספר המכשולים שצריכים להתגבר ראשון. רעש שנוצר על ידי autofluorescence הסלולרי מגביל את הרגישות של המדידות ולכן צריך להיות כל הזמן במינימום. מיקרוסקופיה TIRF משרתת את הצורך הזה גם 12 מאוד אבל דורשת functionalization זכוכית שקופיות, באופן אידיאלי בצורה של bilayer שומנים מישוריים נתמך זכוכית מעוטרת עם חלבונים של הבחירה 13-15. יתרון נוסף של גישת reconstitutive חלקית הוא ששותפי סריג bilayer תושב רקומביננטי יכולים להיות הרבה מ &#39;עפרות שכותרתו בקלות באופן כמותי, באתר ספציפי והגיוני עם fluorophores קטנה יותר ובהירה יותר יהיה אפשרי עם חלבונים הביעו פני תא. TCRs מתויג עם SCF רקומביננטי V של, שאינו משפיע על הכרת תא T, כפי שנבדק בעבר 2. יתר על כן, הרכב החלבון של SLB, למשל הצפיפות של pMHCs והבחירה של גורמי אבזר יכולים להיות מותאם לצרכים של אחד ספציפיים. אנחנו ביצענו בעבר ניסויים עם משתנה צפיפות של pMHCs גירוי, אך לא זוהו הבדלים משמעותיים ב2D-K את ו2D-K D 2. עד כה כאן ההכרה של מולקולות MHC II כיתה כבר עסקה רק, בעיקר בגלל האופי של שסע פפטיד מחייב, אשר פתוח בשני הקצוות וכך להכיל פפטידים גדולים כוללים מקשר לקובץ מצורף fluorophore. במקרים מסוימים גישה כזו עלולה גם לעבוד עבור CLA MHC תיוגss אני מולקולות 16 אבל יש לנקוט זהירות רבה כדי לוודא את השימוש בם בניסויים. הרגישות של תאי T כלפי אנטיגנים, שניתן למדוד באמצעות מבחני התפשטות תאי T, כמו גם pMHC-TCR מחייב קינטיקה כפי שנמדדו במבחנה על ידי תהודת plasmon פני השטח לא צריך להיות מושפעת על ידי התוספת של מקשר וfluorophore ל פפטיד. לחלופין, מעמד MHC אני מולקולות עצמן יכול להיות מתויג באופן ספציפי לאתר עם ההקדמה של ציסטאין מזווג בתוך הרצף של השרשרת הכבדה (תצפיות לא פורסמו). עם השימוש בבדיקות מולקולריות מתאימות כל אינטראקציה בין חלבונים סינפטיים יכולה בעיקרון להיות למדה באופן מתואר במסמך זה. בדיקות כאלה, למשל, של SCF V או חלבונים עוצב Ankyrin חזרו (DARPins) 17, צריכה להיות חד ערכי וצריך לקשור היעד שלהם ביציבות מבלי להשפיע על האינטראקציה של עניין. כמובן, informatio המבניn רצוי מאוד לעיצוב בדיקה רציונלים אבל לא חובה מוחלטת. בעת הקמת זוג שותפי סריג חדש, מומלץ להקליט ולנתח סריג בכמויות הגדולה הראשונה. אתרים של קובץ מצורף תווית עשויים להיות מגוונים במידה ניכרת על מנת למקסם את אות סריג וגם כדי לוודא שתשואות שנמדדו סריג להשתנות בהתאם למרחק בין הצבע. ברגע שהמערכת מותאמת, מולקולה בודדת סריג אותות עשויים להיות מוקלטים על ידי הגבלת התיוג של שותף סריג שפע הגבוה ל10-30% והלבנת שותף סריג שפע הנמוך עד מולקולות בודדות הן פתירות בתחום התאורה. אחרון חביב יש לציין כי SLBs משוער כמה אבל לא את כל ההיבטים של קרום פלזמה פיסיולוגי. תכונות כגון עקמומיות קרום וגמישות, מידור תחום, שחלופי cytoskeletal ותנועתיות תא, כמו גם מגוון גבוה של חלבונים בממברנה-הביע משטח אינן מיוצגות על ידי SLBs אבל עשוי להשפיע לאהוא לעבד תחת חקירה. הרבה מאמץ צריך להיות מושקע להקים שיטות הדמיה המאפשרות ניטור אינטראקציות חלבון-חלבון עם רזולוציה מולקולה בודדת בסינפסות הפיזיולוגית, שאינן נגישים להדמית TIRF.

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bacterial expression</td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>insect cell media for baculo virus production</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>insect cell media for baculo virus expression</td></tr><tr><td>Sf9 cells</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>cells for virus production and expansion</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>cells for potein expression</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bacterial expression</td></tr><tr><td>Centramate System</td><td>Pall</td><td></td><td>protein concentartion from large volumes</td></tr><tr><td>Centramate cassette 10kDa cutoff</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>protein concentartion from large volumes</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>protein concentartion</td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta pure 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Gilson HPLC system</td><td>Gilson</td><td></td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*250mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*50 mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 column&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>protein purification</td></tr><tr><td>Gilson HPLC system</td><td>Gilson</td><td></td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*250mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 &amp;micro;m particle size, 21.2*50 mm column size</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td></tr><tr><td>Cy3 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Cy5 maleimide</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, cell permeant</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td></tr><tr><td>dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>for dissolving fura-2 am</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>imaging buffer</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>supplement for imaging buffer</td></tr><tr><td>14-4-4S antibody</td><td>affimetrix eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round-bottom tube</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter 0.2&amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &amp;micro;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Microscope for fura-2-based calcium measurements&amp;nbsp;</td><td>LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope for (single molecule) FRET measurements</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td><td>for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>planar supported lipid bilayers</td><td></td><td>for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, with L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>T-cell media</td></tr><tr><td>non-essential amino acid 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>mouse interleukin-2 recombinant protein</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>Research Grade Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td>T-cell media supplement</td></tr><tr><td>Origin (analysis program)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td><td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td></tr></tbody></table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

ההקלטה של סידן תוך תאי באמצעות צבע סידן פורע-2, כמו גם הניתוח הסלולרי שלאחר מכן כדי לאמת את עצמת גירוי ולכן הפונקציונליות של SLBs מוצג באיור 4. כמתבררת, רמות סידן לעלות בתאי T (מבוטאות 340nm 380nm יחס מנורמל פורע-2 / עם בסיס להיות 1) מייד ברגע שהם מתיישבים על SLBs גירוי. רמות סידן לחזור לרמות בסיס זמן קצר לאחר התוספת של נוגדנים אשר חוסם pMHCs מאירוסי TCR ואשר מסתיים הפעלת תאי T. איור 6 מתאר ניסוי טיפוסי מעורב התאוששות תורם סריג לאחר הלבנת acceptor, אשר מועסקת למדוד תשואות סריג ואשר משמשת לחישוב ערכי 2D-K D (שמוצג באיור 4). שים לב העלייה בעוצמת תורם סריג, המייצגת TCR שכותרתו באמצעות AF555, לאחר אבלציה המהירה והמלאה של סריגמיני cceptor (כאן: AF647 הקשורים pMHCs). ניכר גם היא הירידה החזקה בערוץ סריג, כלומר, ערוץ סריג-acceptor תחת עירור תורם סריג, לאחר הלבנת acceptor סריג. האות שנותרה בקושי נראית מתאימה לסריג bleedthrough תורם. תשואות סריג בתוך microclusters TCR הבודד או כל סינפסות מחושבות על בסיס הערכים שצוינו בעוצמה הנמדדת (איור 6). איור 7 מתאר לשגות מסלול והזמן של מולקולת אירוע סריג אחת גלוי בשתי מסגרות זמן. כפי שתואר לעיל במבוא התנהגות כזו נגרמת על ידי שני הריקבון של TCR-pMHC הסינפטי המחייבים וphotobleaching. להפלות בין שתי התרומות הללו, המסגרות הניסיוניות זמן רכישה צריכה להיות מגוונות בזמן: בעוד photobleaching נשאר קבוע, שינויים באורך מסלול אירוע סריג נגרמים רק על ידי קינטיקה המחייבות. כימות של tracelengths, w<html> hich מהווה את הבסיס לחישוב מחוץ לשיעורים והלבנה מוצגים באיור 7, מסופקים בשולחנות 1 עד 3. קביעת 2D-K D של דורשת הקלטה של תפזורת סריג תשואות לTCRs כותרת סריג-תורם. עם השימוש של C להסיק בניסוי הקבוע (איור 4), תשואת סריג נמדדה microcluster TCR או כל סינפסה ניתן להמיר את TCR תפוסה, כלומר, היחס של TCRs pMHC-עוסק וכולל (איור 4C) . עם צפיפות pMHC ידועה כיום על SLB לפני תוספת של T-cell, ניתן ליישם את הערכים כדי לקבוע ערכים הסינפטי 2D-K D (איור 4D). על-שיעורים ניתן לחשב עם החוק של פעולה המונית (2D-k ב= 2D-K את / 2D-K D) מהסינפטי נקבע מחוץ לשער וערכי 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 53,157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. מתווה סכמטי של bilayer שומנים מישוריים המערכת נתמכת זכוכית (SLB). SLBs () מורכב מPOPC (90-99%) והשומנים סינטטיים DGS Ni-נת&quot;ע (1-10%) וליצור באופן ספונטני כאשר משטחי זכוכית נקיים נזקפים עם שלפוחית ​​unilamellar הקטנה (רכבי שטח) בהיקף של השומנים המקביל. (ב) לאחר שנוצר, יכול להיות פונקציונליות SLBs כזה עם חלקים מסיסים-מתויג polyhistidine תאיים נגזרים מpMHCs, costimulatory B7-1 חלבונים וחלבוני הדבקה ICAM-1, שישמש כנגמ&quot;שים לתאי T. לקבלת מידע נוסף על הכנת SLBs מתייחס לAxmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> מחדש 2. פורסטר תהודת אנרגיה מבוסס ההעברה assay לכמת TCR-pMHC מחייב באתר. (א) מבנה מורכב של TCR ומורכב עם בר שרשרת אחת H57 עוסק pMHC ממחישה את הגישה מבוססת סריג המתואר במסמך זה. שים לב למרחק הקצר של כ 41 א מפריד בין שני fluorophores המקביל עובר סריג. אתרי acceptor לfluorophore-maleimides מסומנים בירוק ואדום. (ב) עיקרון גילוי אינטראקציות TCR-pMHC באתר מאויר. רק SCF V -decorated TCRs וpMHCs (כאן k IE), המהווים מתחמים ספציפיים, להצמיח אות סריג מדידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;/&gt; איור 3. chromatograms של עליית שלב סינון ג&#39;ל נותנת הסופית לk -2x6H מולקולות IE monomeric של SCF V והטעון פפטיד. X-צירים מייצגים שימור נפח במ&quot;ל, Y-צירים מצביעים הספיגה ב 280 ננומטר ביחידות שרירותיות (AU) . (א) אתר-במיוחד H57 SCF V מסומן בmaleimide אלקסה פלואוריד 555 היה נתון לכרומטוגרפיה S75 להפריד צבע unreacted מהחלבון (שלב 1.2.5). שברים המתאימים למרווח שמירה 14 מיליליטר עד 15 (קווים מקווקווים) מייצגים כותרת V H57 SCF monomeric. מולקולות (ב) IE k -2x6H ומורכבים עם פפטיד בעל ANP-חלל UV-cleavable הייתה מוקרן UV, מודגרות עם אלכס אתר-במיוחד 647 פפטיד שכותרת maleimide ולבסוף נתון לכרומטוגרפיה S200 להפריד את החלבון מפפטיד בחינם (שלב 1.1.2.4). המרווח בין הקווים מקווקווים מכיל מקופל כראוי וpMHCs monomeric. (A, B) </sטרונג&gt; 0.7 מיליליטר המדגם היה מוחל על הטור בתחילת הרום (0 מיליליטר נקודה). שברים שנאספו רוכזו. יחס חלבון לצבע נקבע על ידי photospectrometry לפני הדיאליזה נגד גליצרול / 50% PBS (לאחסון ב -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> איור 4. קביעת D של 2D-K ו2D-K על ים. () המתאם בין תשואת סריג כפי שנקבע על ידי התאוששות תורם לאחר הלבנת acceptor ותפוסת TCR נמדדו בניסוי. תפוסת TCR ניתן לקבוע לmicroclusters TCR פרט כפי שהוסברה בסעיף 4.2. נכון ליניארית של הנתונים המוצגים על ידי הקו, המדרון שבם הוא שווה ל- C היחס בין TCRהתפוסה ותשואת סריג. C הוא ספציפי קבוע למערכת סריג וfluorophores (כאן Cy3 ו Cy5) מועסקות. בדוגמא זו הניבה 1.988. (ב) סריג נתוני תשואה נקבעו לmicroclusters TCR הבודד (N = 187, טמפרטורה = 24 ° C) דרך התאוששות תורם של הלבנת acceptor. מספרים מתחת ברים היסטוגרמה לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. המרה (C) של הנתונים המוצגים ב( ב &#39;) על ידי הכפלה נמדד סריג תשואות עם הקבוע C שנקבע ב(). מספרים מתחת ברים לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. היסטוגרמה (ד) (חצי-לוגריתמים, בסיס = 4) המתאר את חלוקת 2D-K D של נמדדה microclusters TCR הבודד. 2D-K D החציון מצויינים בכחול. מספרים מתחת ברים לציין את הגבול העליון בתוך המרווח. (E) היסטוגרמה מוצגת ב( ד) הוסב intOA 2D-K על -histogram (חצי-לוגריתמים, בסיס = 4) העסקת k הסינפטי לסירוגין במשך 24 ° C (0.41 s -1). 2D-k החציון נקבע על ערך מצויינים בכחול. הנתונים פורסמו במקור חופה et al. 2 והם דמיינו כאן בפורמט חדש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> איור 5. אימות פונקציונלית של SLBs מועסק לגירוי תא T והדמיה. תקיעות T-cell () TCR-מהונדסים עמוסות פורע-2 התעמתו עם SLB גירוי מחסה pMHCs אנטיגני, ICAM-1 ו- B-7. פורע-2 פליטה סלולרית נרגשת ב340 ננומטר ו 380 ננומטר, כמו גם תמונות דסק&quot;ש נרשמו. כפי שצוין, ערכי יחס של עוצמות הפליטה נרגשות על 340 ו 380 ננומטר מוצג בפנל הימני. תוספת של pMHC חסימת נוגדנים 14 דקות לניסוי הריצה הביאה לירידה ברמות סידן תוך תאי דומים לזה של מנוחה תאי T. (ב) פרופיל זמני טיפוסי של יחסי פורע-2 ממוצע בתאי T הפנייה SLBs גירוי מאופיין על ידי עלייה ראשונית בסידן תוך תאי שהוא 2 עד 4 פעמים גבוהות יותר בהשוואה לזו של תאי T שאינו מופעלים או תאי T נשללו אנטיגן לאחר מצור בתיווך נוגדנים. עיגולים ירוקים מצביעים נקודות זמן מאוירות ב(). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> גורף 6. איור סריג תשואות כפי שנמדד באמצעות שחזור תורם סריג לאחר הלבנת acceptor סריג. <strאונג&gt; () מוצג הוא דוגמא לסריג-מדידה הסינפטי טיפוסית. כפי שעולה משמאל ועל גבי סדרה של תמונות נרכשה עם השימוש במפצל קרן פליטה הוליד תורם סריג וערוץ acceptor סריג (למידע מפורט יותר על מפצלי אלומה מתייחס לAxmann et al 4). הקו שמוצג בתמונה דסק&quot;ש עזבה מציין את הגבול של סינפסה T-cell. שים לב להפסד בעוצמה בתוך ערוץ acceptor סריג גם היא העלייה בעוצמת בערוץ תורם סריג לאחר הלבנת acceptor סריג (שלב 4). (ב) סריג ניתן לכמת את היעילות כפי שצוין לאזורים הסינפטי בודדים או לכל סינפסות. לבדיקה, תמונות לפני ואחרי הלבנת acceptor סריג מוצגות עם השימוש בשני שולחנות בדיקה (luts, ירוק ופיסיקה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </p&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> איור 7. מולקולה בודדת סריג אירועים מופיעים ונעלמים צעדי insingle ומיושרים באופן מושלם עם fluorophore acceptor סריג יחיד. לשגות של המולקולה בודדת אירוע סריג הזמן מוצג. תמונות נרכשו באמצעות מצלמה EMCCD-אחורית מואר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> איור 8. קביעת τ את = 1 / k מן מסלולי smFRET נמדדו. (א) הסכומים המצטברים מנורמלים של אותות סריג לצפייה (הנגזרים מH57 SCF V -AF555 מעוצב 5c.c7 תקיעות T-cell מהונדס TCR הכרת IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 ב 24 מעלות צלזיוס) במשך ארבעה פיגורים שונים זמן (42 אלפיות שניים, 490 אלפיות שניים, 1,007 אלפיות שני, 1,989 אלפיות שני) היו זמם כפונקציה של המספר הכולל של תצפיות. פונקציות בכושר מונו מעריכי להצמיח מקביל ההפוך השלילית של ערכי הציפייה &lt;n (פיגור t)&gt;. ערכים (ב) ציפייה היו זממו נגד פיגור t עיכובים ומצוידים באמצעות משוואה &lt;n (פיגור t)&gt; = τ את / {(Τ את / &lt;n להלבין&gt;) + פיגור t} להניב τ את ו&lt; n להלבין&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay at JoVE.com

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

מדידת TCR-pMHC כריכה<em&gt; באתר</em&gt; באמצעות assay מיקרוסקופית המבוסס על סריג

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.3K Views.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 

Video: Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Immunology and Infection

Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the environment, a cell must be able to recognize and process it. This task mainly relies on the function of membrane receptors, whose role is to convert signals into the biochemical language of the cell. G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptor proteins in humans. Among GPCRs, metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are a unique subclass that function as obligate dimers and possess a large extracellular domain that contains the ligand-binding site. Recent advances in structural studies of mGluRs have improved the understanding of their activation process. However, the propagation of large-scale conformational changes through mGluRs during activation and modulation is poorly understood. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) is a powerful technique to visualize and quantify the structural dynamics of biomolecules at the single-protein level. To visualize the dynamic process of mGluR2 activation, fluorescent conformational sensors based on unnatural amino acid (UAA) incorporation were developed that allowed site-specific protein labeling without perturbation of the native structure of receptors. The protocol described here explains how to perform these experiments, including the novel UAA labeling approach, sample preparation, and smFRET data acquisition and analysis. These strategies are generalizable and can be extended to investigate the conformational dynamics of a variety of membrane proteins.

This study presents a detailed procedure to perform single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) experiments on G protein-coupled receptors (GPCRs) using site-specific labeling via unnatural amino acid (UAA) incorporation. The protocol provides a step-by-step guide for smFRET sample preparation, experiments, and data analysis.

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

Biochemistry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) soluble cytokines. T cells release two kinds of effector particles in response to activation: trans-synaptic vesicles (tSVs) and supramolecular attack particles, which transfer intercellular messengers and mediate cytotoxicity, respectively. These entities are quickly internalized by APCs engaged in physical contact with T cells, making their characterization daunting. This paper presents the protocol to fabricate and use Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) as antigen-presenting cell (APC) mimetics to capture and analyze these trans-synaptic particles. Also described are the protocols for the absolute measurements of protein densities on cell surfaces, the reconstitution of BSLBs with such physiological levels, and the flow cytometry procedure for tracking synaptic particle release by T cells. This protocol can be adapted to study the effects of individual proteins, complex ligand mixtures, pathogen virulence determinants, and drugs on the effector output of T cells, including helper T cells, cytotoxic T lymphocytes, regulatory T cells, and chimeric antigen receptor-expressing T cells (CART).

Here we present the protocol for the stepwise reconstitution of synthetic antigen-presenting cells using Bead-Supported Lipid Bilayers and their use to interrogate the synaptic output from activated T cells.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

ניתוח ברזולוציה גבוהה של תפקוד מיטוכונדריאלי במרכזיות אנושיות

High-Resolution Fluorespirometry to Assess Dynamic Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Human Immune Cells

Peripheral mononuclear cells (PBMCs) exhibit robust changes in mitochondrial respiratory capacity in response to health and disease. While these changes&#160;do not always reflect what occurs in other tissues, such as skeletal muscle, these cells are an accessible and valuable source of viable mitochondria from human subjects. PBMCs are exposed to systemic signals that impact their bioenergetic state. Thus, expanding our tools to interrogate mitochondrial metabolism in this population will elucidate mechanisms related to disease progression. Functional assays of mitochondria are often limited to using respiratory outputs following maximal substrate, inhibitor, and uncoupler concentrations to determine the full range of respiratory capacity, which may not be achievable in vivo. The conversion of adenosine diphosphate (ADP) to adenosine triphosphate (ATP) by ATP-synthase results in a decrease in mitochondrial membrane potential (mMP) and an increase in oxygen consumption. To provide a more integrated analysis of mitochondrial dynamics, this article describes the use of high-resolution fluorespirometry to measure the simultaneous response of oxygen consumption and mitochondrial membrane potential (mMP) to physiologically relevant concentrations of ADP. This technique uses tetramethylrhodamine methylester (TMRM) to measure mMP polarization in response to ADP titrations following maximal hyperpolarization with complex I and II substrates. This technique can be used to quantify how changes in health status, such as aging and metabolic disease, affect the sensitivity of mitochondrial response to energy demand in PBMCs, T-cells, and monocytes from human subjects.

מחבר זרקור: תובנות חדשות על תגובות מיטוכונדריאליות PBMC באמצעות פלואורספירומטריה

Methods for studying mitochondrial bioenergetics under physiologically relevant substrate concentrations in immune cells are limited. We provide a detailed protocol that uses high-resolution fluorespirometry to assess changes in the response of the mitochondrial membrane potential to energy demand in human T-cells, monocytes, and peripheral mononuclear cells.

מדידת TCR-pMHC כריכה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video