המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר כריס טיילור (אוהיו סטייט) מציגה טכנולוגיה שורש שעיר למעבדה שלנו, בני הזוג. Senthil סבראמאניאן (דרום דקוטה סטייט), ג&#39;אנג חואן (Ludong אוניברסיטת שנדונג בסין) כדי לשפר את הפרוטוקול. כמו כן, אנו מבקשים להודות לד&quot;ר האו נג (נאנג&#39;ינג החקלאות באוניברסיטה) עבור מסייע ביצירת הווידאו הזאת. עבודה זו נתמך בחלקו על ידי מענקי DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) ו USDA (2010-65116-20514) אל OY

פרוטוקול הבאים נעשה שימוש כדי ליצור צמחים שורש שעיר מורכב קטניות מודל מינים מ truncatula. פרוטוקולים דומים הותאמו לפחות שמונה מיני צמחים 1-4. השתמשנו מ צמחים truncatula שורש שעיר מרוכבים ללמוד פונקציות גנים שורש ופיתוח גולה. הפרוטוקול היה מופרד לארבעה חלקים: 1) חומרי plant בהכנת; 2) יצירת צמחים שורש שעיר מרוכבים: 3) הסימביוטי זיהום Rhizobia, ו 4) זיהוי שורש מהונדס. השתמשנו וקטור בינארי המכיל גן ירוק ניאון (GFP) חלבון ככתב להקרנה שורש מהונדס בצמחים מורכבים 3. בהשוואה מבחר אנטיביוטיקה מבוססת, GFP מבוססי ההקרנה היא מהירה, קלה וזולה. ב לבנות שלנו, ER-ביטוי ממוטב את הגן GFP הוא מונע על ידי האמרגן היוביקוויטין סופר, אשר חזקה אותות ה-GFP מכונן שורשי מהונדס, המאפשר הבחנה קלה בין השורשים מהונדס ולא מהונדס. 1. הכנת חומרים Plant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ &#39;זרעים truncautla נקצרים מצמחים הגדלים בחממה (לחות יחסית 50%, 16 / 8 שעות אור / חושך, 22/18 ° C יום / לילה טמפרטורה). זרעים מבוגרים ניתן לאחסן 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -100 זרעים הם התחוח של 10 מ&quot;ל חומצה גופרתית מרוכזת (95-98%, סיגמא אולדריץ, MO) במשך 10 דקות עם רעד תקופתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרעים הם שטופים 5-7 פעמים עם מים סטריליים עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרעים הם ספוג אז בטמפרטורת החדר במים במשך 6 שעות וכל הזמן על 4 מעלות צלזיוס למשך 36-48 שעות כדי לסנכרן נביטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 20-30 זרעים מפוזרים על ניירות מסנן לחות להציב בצלחת פטרי. הם שמרו על 22 מעלות צלזיוס, עם 16 / 8 שעות אור / חושך מחזור, ו 40 μmol.m -2. S -1 עוצמת האור, עבור 5-6 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתילים מונבטים מועברים לתוך האדמה והניח בחממה במשך חודש. </li></ol> 2. יצירת צמחים שעירים שורש מרוכב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בונה בינארי נושאים גנים של עניין הפכו א rhizogenes באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. יש לנו מהונדסים קבוצה של וקטורים בינארי המכיל את הגן GFP כסמן המאפשרים הקרנת רקמות מהונדס. וקטורים אלו מכילים מקדמי שונים ולכולם יש שיבוט Gateway אתרים (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) לביטוי מעל או השתקה של גנים ממוקד 3,5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rhizogenes א &#39;בתרבית בינוני 50 מ&quot;ל LB עם מבחר אנטיביוטי מתאים בגיל 28 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקים נאספים מחדש מושעה לריכוז סופי של OD 600 = 0.3 פתרון ללא חנקן מזין הצמח (טבלה 1 ו 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתמוך התחדשות שורש שעיר, מטריצה ​​תמיכה מעוקר (&quot;צמר סלעים&quot;, Hummert הבינלאומי, כדור הארץ סיטי, מיזורי) הוא חתך לתוך התקעים של כ 3 ס&quot;מ 3. אנחנו מקום 4 plugs לתוך צלחת פטרי אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החור הוא שירבב על גבי תקע כל משתמש קצה פיפטה כדי להקל על הכניסה של explants א. rhizogenes (5 מ&quot;ל) הוא הוסיף לחבר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטע לירות עם 2-3 בלוטות בבית השחי הוא נכרת על ידי חתך אלכסוני. Explant מוכנס מכן לתוך התקע, גדל ב 22 מעלות צלזיוס למשך כשלושה שבועות. אנחנו שומרים explants Medicago ללא השקיה עבור 10 הימים הראשונים, ולאחר מכן, מים להם פתרון 5 מ&quot;ל חנקן חופשי בעת הצורך. מצאנו כי הסרת meristem apical עשוי להפחית את היווצרות שורשים adventitious. </li></ol> 3. הסימביוטי Rhizobia (Sinorhizobium Meliloti) זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה שבועות, כמה שורשים adventitious תצא מן צמר הסלע. צמחים שורש שעיר מרוכבים מועברים חול או vermiculite (עיקור), עם או בלי צמר הסלע. הם גדלו בחממה ב 22 ° C, 16 / 8 שעות אור / חושך מחזור, ו 300 μmol.m -2. S -1 עוצמת האור למשך שבוע נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני rhizobia זיהום, ש meliloti 1201 הוא בתרבית תמצית שמרים, מניטול 50 מ&quot;ל בינוני למשך 7 ימים ב 30 מעלות צלזיוס (לוח 2, 6,7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-מושעה תאים rhizobia הם מדולל לריכוז סופי של OD 600 = 0.08 באמצעות פתרון חופשי חנקן תזונה. ההשעיה של 10 מ&quot;ל טרי של ס meliloti היה מוחל על כל צמח מורכב לגרום להיווצרות גולה. </li></ol> 4. זיהוי שורש טראנסגנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועיים לאחר rhizobia חיסון, הצמחים הם מורכבים עד מושרשת על ידי שטיפה במים. שורשיה ניתן להפריד בקלות במים מן החולות או perlite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו שמים את השורשים שעיר תחת מיקרוסקופ-UV (ניקון SMZ1500, עירור 460-500nm, 505nm dichroic, הגדר יותר 510nm). שורשי מהונדס GFP הם חיוביים שורשי adventitious GFP הם שליליים. לאחר מכן, אנו אוספים את השורשים accordinז אות ה-GFP, ולספור את המספרים גולה, למדוד את אורך שורש, ולחשב צפיפות שורש לרוחב. שורשי ה-GFP שלילי משמשים שליטה. </li></ol> 5. נציג תוצאות בניסוי שלנו, את שורשי השיער החדש מחדש מתוך explants ב 2-3 שבועות לאחר A. rhizogenes innoculation. תחת מיקרוסקופ-UV, שורשים מהונדס נושאת את הגן GFP להראות חזק פלואורסצנטי ירוק (איור 1). כמות השורשים מחדש את החלק של ה-GFP השורשים חיובית תלוי בתנאי explants והסביבה צמיחה ממוצע של plants.On מרוכבים, 25% את השורשים הפיק היו שורשים שעירים מהונדס 3. כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, 1) אבדון כיסוי פלסטיק, כפי שמוצג על הוידאו, זה מספיק כדי לשמור על לחות במגש הצמיחה בימים הראשונים, וצמחים רק דורשים מעט מים בימים הראשונים. השקיית יתר הוא מזיק היווצרות שורש שעיר; 2) את ריכוז innoculant Agrobacterium חשוב לשינוי. כמות מוגזמת של תאים לא מועילים היווצרות שורש שעיר או היווצרות גולה. ליצירת גולה, הפתרון צריך להיות להשקות חנקן חופשי, אחרת, מעט גושים יהוו. צמחים שורש שעיר מורכב יכול להיווצר באמצעות cotyledons או שתילים entact כחומר המוצא. רק שינויים קלים של הפרוטוקול הנ&quot;ל ncessary ליצור שורשים שעירים מרקמות אחרות 8. חשוב לציין, כל שורש שעיר הוא אירוע שינוי עצמאית. לכן, פנוטיפים שנצפתה נטמון מרוכבים הם סכום של אירועים transforamtion כמה צריכה להיות מאושרת על ידי חזרות בצמחים מורכב מרובים <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. א השורשים טראנסגנטי ניתן למיין מתוך שורשים שעירים. גושים ב נוצרו הצמחים שורש שעיר מרוכבים. הנחנו 4 שבועות בת מ צמחים truncatula שורש שעיר תחת מיקרוסקופ-UV ואת השורשים GFP חיובית ניתן לזהות בקלות. (החץ האדום: שורש GFP, חץ צהוב: אי - GFP שורש) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מניות </td><td> g/200ml </td><td> מניות מ&quot;ל / ליטר </td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> 12.3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> 14.7 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 0.3 H 2 O </td><td> 6.8 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> K 2 SO 4 </td><td> 11 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> פה Cl 3 0.6 H 2 O </td><td> 0.49 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Micronutrients </td><td> ראה להלן </td><td> 1 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Micronutrients </td><td> גרם לליטר </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0.142 </td></tr><tr><td> MnSO 4. H 2 O </td><td> 0.077 </td></tr><tr><td> ZnSO 4 0.7 H 2 O </td><td> .1725 </td></tr><tr><td> CuSO 4 .5 H 2 O </td><td> 0.037 </td></tr><tr><td> NaMoO 4. H 2 O </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td> CoCl 2. H 2 O </td><td> .0025 </td></tr><tr><td> NiSO 4 </td><td> 0.001 </td></tr></tbody></table> 1. טבלת Nitogen ללא תזונה פתרון <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> K 2 HPO4 </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 0.1g </td></tr><tr><td> MgSO 4 ° 7H 2 O </td><td> 0.2g </td></tr><tr><td> תמצית שמרים </td><td> 0.4g </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 10g </td></tr><tr><td> pH = 6.8 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2. שמרים תמצית בינוני מניטול (לליטר)

<ol>
	<li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula.">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li><li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vitro+composite+plants:+an+inexpensive,+rapid+method+for+root+biology.">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li><li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti.">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li><li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations.">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li><li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation.">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 .</li><li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots.">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li><li>Vincent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , 1-13 (1970).</li><li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae.">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יצירת plant שורש שעיר מרוכבים היא שיטה קלה ומהירה להשיג כמויות גדולות של חומר מהונדס עבור מינים רבים dicot. אמנם שיטה זו לא יכולה לייצר זרעים מהונדס, הוא יכול לייצר חומרים מהונדס בעוד כמה שבועות. השיטה מתאימה במיוחד עבור הצמחים מתקשים להקים תרביות רקמה או יצירת transformants יציב. במהלך השנים, יש לנו השתמשו בטכנולוגיה זו כדי ללמוד פונקציות גן, פונקציות האמרגן, רנ&quot;א, שורש ופיתוח שורש לרוחב, הגנה ותגובות אביוטי מתח, nodulation תהליכים סימביוטיים אחרים, התגובות הורמון, פרופיל מטבולי, פרופיל גנטי, ניתוח proteomic, ו תהליכים ביולוגיים אחרים. פרוטוקול איתנה לשכפול.

generation of composite plants in medicago truncatula used for nodulation assays

בדומה tumerfaciens Agrobacterium, rhizogenes Agrobacterium יכול להעביר DNAs זרים לתוך בתאי צמח על בסיס אוטונומי שורש וישכנע (הר&quot;י) פלסמיד א. rhizogenes יכול לגרום להיווצרות שורש שעיר על רקמות הצמח צורה צמחים מורכבים לאחר השינוי. על הצמחים האלה מורכבים, כמה שורשים מחדש הם מהונדס, נושאת את סוג בר T-DNA ואת וקטור בינארי מהונדסים, בעוד יורה עדיין לא מהונדס, המשמש על מנת לספק אנרגיה לתמוך בצמיחה. אלו צמחים שורש שעיר מרוכבים לא ייצרו זרעים מהונדס, אך יש מספר תכונות חשובות ההופכות את הצמחים האלה מורכב מאוד שימושי מחקר הצמח. ראשית, עם מגוון רחב מארח, א rhizogenes יכול להפוך מיני צמחים רבים, במיוחד dicots, המאפשר הנדסה גנטית במגוון רחב של מינים. שנית, א rhizogenes להדביק רקמות explants ישירות; לא בתרביות רקמה לפני השינוי הוא הכרחי כדי להשיג צמחים מורכבים, מה שהופך אותם אידיאליים עבור הפיכת מיני הצמחים הסוררים. יתר על כן, רקמות השורש מהונדס יכול להיווצר בתוך כמה שבועות. עבור Medicago truncatula, אנחנו יכולים להשיג שורשים מהונדס ב קצר ככל שלושה שבועות, מהר יותר מאשר שינוי נורמלי לטבול פרחים ארבידופסיס. בסך הכל, שורש שעיר המשולב בטכנולוגיה הצמח כלי תכליתי ושימושי ללמוד פונקציות גנים הקשורים שורש-פנוטיפים. כאן אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך מינים מ truncatula.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays at JoVE.com

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך מינים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt;.

דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

generation-composite-plants-medicago-truncatula-used-for-nodulation

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

15.9K Views.  Donald Danforth Plant Science Center. אנו מדגימים כיצד צמחים שורש שעיר המשולב יכול לשמש כדי ללמוד צמחים rhizobium אינטראקציות nodulation ב קשות להפוך מינים Medicago truncatula.

Video: Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

מבחני כדאיות לתאים בתרבית

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; רוט גושים

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

כיול ביצועים מיקרוקול MRM ושימוש הפגינו על שורשי truncatula Medicago ב 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have proven successful in identifying protein-protein interactions (PPIs). APEX, BioID, and TurboID, a revised version of BioID have some restrictions in addition to being valuable technologies. The recently developed AirID, a novel version of BioID for proximity identification in protein-protein interactions, overcame these restrictions. Previously, AirID has been used in animal models, while the current study demonstrates the use of AirID in plants, and the results confirmed that AirID performs better in plant systems as compared to other PL enzymes such as BioID and TurboID for protein labeling that are proximal to the target proteins. Here is a step-by-step protocol for identifying protein interaction partners using AT4G18020 (APRR2) protein as a model. The methods describe the construction of vector, the transformation of construct through agroinfiltration, biotin transformation, extraction of proteins, and enrichment of biotin-labeled proteins through affinity purification technique. The results conclude that AirID is a novel and ideal enzyme for analyzing PPIs in plants. The method can be applied to study other proteins in plants.

Here, we present a step-by-step protocol for performing the proximity labeling (PL) experiment in cucumber (Cucumis sativus L.) using AT4G18020 (APRR2)-AirID protein as a model. The method describes the construction of a vector, the transformation of a construct through agroinfiltration, biotin infiltration, protein extraction, and purification of biotin-labeled proteins through affinity purification technique.

תיוג קרבה מבוסס AirID לאינטראקציה חלבון-חלבון בצמחים

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...