המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר ז&#39;אן מישל Ane במחלקה לאגרונומיה בUW-Madison עבור מתן דגימות truncatula Medicago. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (NSF) מענק מל&quot;ג-0,957,784, בית הספר למוסמכים באוניברסיטת ויסקונסין והקרן ויסקונסין בוגרי המחקר (WARF) ותכנית Romnes הפקולטה מלגת מחקר (לLL). EG מכיר בוגר מחקר אחוות NSF (DGE-1,256,259).

1. מכשור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSI MALDI-TOF/TOF. השתמש ספקטרומטר מסה מצויד במקור MALDI לניתוח של מולקולות קטנות (ראה טבלה של חומרים / ציוד). לבצע רכישות במצב יון חיובי או שלילי בהתאם לanalytes של עניין. ציין טווח המוני של עניין ולאסוף 500 יריות / כתם לייזר ב50 מיקרומטר מרווחים בשני x והממדים y על פני השטח של המדגם כדי ליצור תמונות ביון. רוחב סריקה ומספר יריות לייזר יכולים להיות מותאם כדי להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ועוצמת אות מקסימלי בהתאמה. השתמש פסגות מטריצת DHB או סטנדרטים פנימיים מוחלים על השקופית או ישירות לרקמה לכייל את הספקטרום ההמוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההחלטה LC-MS גבוה. (ראה טבלה של חומרים / ציוד) מדגם תמציות הפעלה עם LC-MS או באמצעות LC שלב הפוך (RP) עם עמודת C-18, או שלב נורמלי (NP) עם עמודת HILIC בהתאם analytes של עניין. השתמש בשלבים וניידיםשיפועים מתאימים כמו לסוג מדגם המסוים. לבצע רכישות במצבי יון חיוביים או שליליים בהתאם לסוג המדגם. </li></ol> 2. הכנת רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את גולה שורש מהצמח, ומשאיר 3-4 מ&quot;מ של שורש מחובר לגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר נתיחה, להשתמש במלקחיים כדי למקם את הרקמה בכוס cryostat ולכסות עם ג&#39;לטין (100 מ&quot;ג / מיליליטר במי deionized). זה חיוני לרקמה להיות דבוקה לתחתית הכוס ללא בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא את הרקמה על ידי הנחת הכוס באמבט קרח / אתנול יבש עד ג&#39;לטין מתקשה והופך להיות אטום. דגימות חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגימות ממקפיא -80 מעלות צלזיוס, לחתוך את כוס cryostat פלסטיק ולקצץ משם ג&#39;לטין העודף. הר הרקמות המשובצים לצ&#39;אק cryostat עם כמות בגודל מטבע של טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) בתקשורת, ואילו לא לתת לאוקטובר לגעת ברקמה. הנח בcryostatתיבה עד מתמצק OCT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לצ&#39;אק וג&#39;לטין לאזן בתיבת cryostat (סט ל-20 או -25 מעלות צלזיוס) במשך כ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש cryostat (ראה טבלה של חומרים / ציוד) לרקמות סעיף כ העובי של תא אחד (8-20 מיקרומטר תלוי בסוג הרקמה) והפשרת הר כל פרוסה על גבי הזכוכית המצופה-איטו ידי ההתחממות בחזרה (לא איטו מצופה בצד) של שקופיות זכוכית מצופים איטו על גב היד שלך. הנח את הצד המצופה איטו של השקופית התחממה ליד פרוסת הרקמה הקפואה ולאפשר הפרוסה להיצמד לשקופית. הצבת החלקים קרוב זה לזה בשקופית תספק התאמה טובה יותר במהלך MSI. </li></ol> 3. מטריקס יישום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום מברשת אוויר של MALDI מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע את כל הליכי מברשת האוויר במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את מיכל airbrush פתרון וזרבובית (ראה טבלה של חומרים / ציוד) עם מתנול ולמלא את מיכל הפתרון עם פתרון מטריצת DHB (150 מ&quot;ג / מיליליטר ב50%% methanol/0.1 v TFA / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מברשת האוויר כ 35 סנטימטר מהמדגם ולהחיל 10-15 שכבות של מטריקס על פני השטח של השקופית עם משך 10 תרסיס שניות ו30 זמן ייבוש שניות בין כל מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את מברשת האוויר שוב עם מתנול כאשר סיימתי, כדי למנוע סתימה מפתרון המטריצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוטומטי מרסס יישום של MALDI מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההוראות הזנק המסופקות על ידי היצרנים של מערכת המרסס האוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור MSI של מטבוליטים בגושי שורש באמצעות 40 מ&quot;ג / מיליליטר (ב50%% methanol/0.1 v TFA / V) DHB כמטריצה, הגדר את הטמפרטורה ל ~ 80 מעלות צלזיוס, מהירות ל1,250 מ&quot;מ / דקה, קצב זרימה ל50 μl / min, ומספר עובר ל24. לקבלת הכיסוי הטוב ביותר, מומלץ לסובב את הזרבובית 90 מעלות ו / או לקזז את מ&quot;מ זרבובית 1.5 בין כל מעבר. התחל בשיטת ריסוס. כsiהערה דה, מערכת מרסס המסוימת משמשת כאן מחממת את הזרבובית לאידוי מהיר יותר של הממס. כממס מתאדה, הריכוז של המטריצה ​​מגביר מהירות. יש המטריצה ​​מוחלת על המדגם עם מברשת האוויר והמרסס האוטומטי ריכוזים דומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הוראות הכיבוי שסופקו על ידי היצרנים של מערכת המרסס האוטומטית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום העידון של MALDI מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 300 DHB מ&quot;ג לחלק התחתון של חדר סובלימציה (ראה טבלה של חומרים / ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היצמד שקופיות זכוכית לאצבע הקרה (חלק העליון של חדר סובלימציה) עם סעיפי הרקמות כלפי מטה עם קלטת דו צדדית, מוליך. מכסה את כל החלק האחורי של השקופית עם הסרט דו צדדי לאף מוליכות, ייצור אפילו מטריצה ​​בתצהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את החצאים העליונים ותחתונים של חדר סובלימציה יחד עם ה-C-המהדק. חבר את הוואקום ומודעותקרח ד ומים קרים למאגר העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קאמרי סובלימציה במעטפת חימום שהיא בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת הוואקום. חכה 15 דקות ולהדליק את מעטפת החימום. מעטפת החימום צריכה להגיע 120 מעלות צלזיוס במהלך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות, מכבה את האש, קרוב לשסתום ואקום (כך הפנימי של החדר נשאר תחת ואקום) ולכבות את משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר החדר כדי להגיע לטמפרטורת חדר, פתח את שסתום שחרור לחץ הוואקום ולהסיר את המדגם. הגודל של חדר סובלימציה יקבע את הסכום של מטריצה ​​בסובלימציה לשקופית הזכוכית. תאי סובלימציה גדולים יותר (בגודל של כוס מיליליטר 400) ישתמשו כ 300 מ&quot;ג DHB תוך התאים הקטנים (בגודל של כוס מיליליטר 150) ישתמשו כ 100 מ&quot;ג DHB וידרשו חיתוך שקופיות הזכוכית, כך שהוא מתאים בתא. </li></ol></li></ol> 4. רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; מארק דפוס + בכל פינה של המדגם עם עט נוזל תיקון WiteOut כדי לשמש &quot;נקודות ללמד&quot;. מניחים את שקף הזכוכית לתוך צלחת מתאם שקופיות MALDI ולקחת תמונה אופטית של המדגם באמצעות סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קובץ תמונת רכישה באמצעות התוכנה המסופקת על ידי חברת המכשיר עם גודל סריקה צעד של 50 מיקרומטר וקוטר לייזר שווה או קטן יותר מגודל צעד סריקה. במכשיר הספציפי הזה, הגדרת לייזר המינימום נותנת קוטר לייזר של הגדרת לייזר כ 10 מיקרומטר וקטן בעל קוטר 40-50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התמונה האופטית לתוך התוכנה וליישר את הצלחת עם התמונה האופטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את המכשיר לפני תחילת הרכישה באמצעות יונים נפוצים מטריצת אשכול, סטנדרטים פנימיים, או שילוב כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציין את האזורים של רקמה להיות מנותחים עם MSI, כולל מקום של מטריצה ​​טהורה בשקופית כדי לשמש &quot;ריק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין acquisition. </li></ol> 5. דור תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ ההדמיה בתוכנה זמינה באופן מסחרי הניתנת על ידי הספק ולחלץ את תמונות יון. תוכנות קוד פתוח אחרות זמינה עבור עיבוד נתונים MSI 19. </li></ol> 6. זיהוי המטבוליט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מ &#39;/ z ספציפי של עניין מהספקטרום ההמוני באמצעות התוכנה ספציפית הספק (ראה טבלה של חומרים / ציוד). אנליטי ניתן להבחין בין יון מטריצה ​​כאשר שיא אנליטי נבחר מהספקטרום ההמוני ותמונות יון נוצרות במיוחד מקומית לקטע הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור רשימה של analytes של עניין ולבצע ניסויי MS / MS. ראה טבלת 1 וטבלה 2 בנציג תוצאות עבור רשימות מדגם של analytes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח LC-MS ממוקד בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה המוני (או ברזולוציה גבוהה MALDI-MS אם זמין) כדי להשיג מדויקמדידות מסה של analytes של עניין וגם לבצע LC-MS/MS של analytes היעד להשיג דפוסי פיצול אופייניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חיפוש באתר כדי לקבוע הזדהויות המשוערת לanalytes הממוקד. דוגמאות למאגרי מידע המטבוליט כוללים: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, וHMDB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את ההזדהויות המשוערת מחיפוש מסד הנתונים מסה מדויק, להתאים את MS / MS מanalytes הממוקד לMS / MS הספקטרום של סטנדרטים, ספרות, ו / או תוכנת חיזוי פיצול. </li></ol>

<ol>
	<li>Seeley, E. H., Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+Intact+Tissue+Sections:+Moving+beyond+the+Microscope.">Imaging of Intact Tissue Sections: Moving beyond the Microscope.</a> J. Biol. Chem. 286, 25459-25466 (2011).</li><li>van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+review+of+mass+spectrometry+imaging.">A concise review of mass spectrometry imaging.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).</li><li>Lietz, C. B., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+drugs+and+metabolites.">Qualitative and quantitative mass spectrometry imaging of drugs and metabolites.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65, 1074-1085 (2013).</li><li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+mass+spectrometry-assisted+molecular+imaging+of+metabolites+during+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula-Sinorhizobium+meliloti+symbiosis.">MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis.</a> Plant J. 75, 130-145 (2013).</li><li>Ye, H., Gemperline, E., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vision+for+better+health:+mass+spectrometry+imaging+for+clinical+diagnostics.">A vision for better health: mass spectrometry imaging for clinical diagnostics.</a> Clin. Chim. Acta. 420, 11-22 (2013).</li><li>Wei, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+and+Its+Practical+Value+in+Pharmaceutical+Industry.">Metabolomics and Its Practical Value in Pharmaceutical Industry.</a> Curr. Drug Metab. 12, 345-358 (2011).</li><li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Serum+Metabolomics-Based+Diagnostic+Approach+to+Pancreatic+Cancer.">A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach to Pancreatic Cancer.</a> Cancer Epidem. Biomar. 22, 571-579 (2013).</li><li>West, P. R., Weir, A. M., Smith, A. M., Donley, E. L. R., Cezar, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+human+developmental+toxicity+of+pharmaceuticals+using+human+embryonic+stem+cells+and+metabolomics.">Predicting human developmental toxicity of pharmaceuticals using human embryonic stem cells and metabolomics.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 247, 18-27 (2010).</li><li>Spegel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+metabolomics+analysis+of+beta-cells+implicates+the+pentose+phosphate+pathway+in+the+control+of+insulin+release.">Time-resolved metabolomics analysis of beta-cells implicates the pentose phosphate pathway in the control of insulin release.</a> Biochem. J. 450, 595-605 (2013).</li><li>Pendyala, G., Want, E. J., Webb, W., Siuzdak, G., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+neuroAIDS:+The+widening+scope+of+metabolomics.">Biomarkers for neuroAIDS: The widening scope of metabolomics.</a> J. Neuroimmune. Pharm. 2, 72-80 (2007).</li><li>Prell, J., Poole, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+of+rhizobia+in+legume+nodules.">Metabolic changes of rhizobia in legume nodules.</a> Trends Microbiol. 14, 161-168 (2006).</li><li>Kutz, K. K., Schmidt, J. J., Li, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tissue+analysis+of+neuropeptides+by+MALDI+FTMS+in-cell+accumulation.">In situ tissue analysis of neuropeptides by MALDI FTMS in-cell accumulation.</a> Anal. Chem. 76, 5630-5640 (1021).</li><li>Stemmler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-mass-resolution+direct-tissue+MALDI-FTMS+reveals+broad+conservation+of+three+neuropeptides+(APSGFLGMRamide,+GYRKPPFNGSIFamide+and+pQDLDHVFLRFamide)+across+members+of+seven+decapod+crustaean+infraorders.">High-mass-resolution direct-tissue MALDI-FTMS reveals broad conservation of three neuropeptides (APSGFLGMRamide, GYRKPPFNGSIFamide and pQDLDHVFLRFamide) across members of seven decapod crustaean infraorders.</a> Peptides. 28, 2104-2115 (2007).</li><li>Rubakhin, S. S., Churchill, J. D., Greenough, W. T., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+signaling+peptides+in+single+mammalian+cells+using+mass+spectrometry.">Profiling signaling peptides in single mammalian cells using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 78, 7267-7272 (1021).</li><li>Neupert, S., Predel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+analysis+of+single+identified+neurons+of+an+insect.">Mass spectrometric analysis of single identified neurons of an insect.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 327, 640-645 (2005).</li><li>Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+biological+samples:+localization+of+peptides+and+proteins+using.">Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using.</a> MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).</li><li>Baluya, D. L., Garrett, T. J., Yost, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+MALDI+matrix+deposition+method+with+inkjet+printing+for+imaging+mass+spectrometry.">Automated MALDI matrix deposition method with inkjet printing for imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 79, 6862-6867 (2007).</li><li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging.">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li><li>Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MSiReader:+an+open-source+interface+to+view+and+analyze+high+resolving+power+MS+imaging+files+on+Matlab+platform.">MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 718-721 (2013).</li><li>Northen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrate+nanostructures+for+mass+spectrometry.">Clathrate nanostructures for mass spectrometry.</a> Nature. 449, (2007).</li><li>Shrivas, K., Hayasaka, T., Sugiura, Y., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+simultaneous+imaging+of+endogenous+low+molecular+weight+metabolites+in+mouse+brain+using+TiO2+nanoparticles+in+nanoparticle-assisted+laser+desorption/ionization-imaging+mass+spectrometry.">Method for simultaneous imaging of endogenous low molecular weight metabolites in mouse brain using TiO2 nanoparticles in nanoparticle-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7283-7289 (2011).</li><li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids:+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1,5-diaminonapthalene+deposition.">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene:+a+new+matrix+for+the+selective+analysis+of+low+molecular+weight+amines+and+direct+determination+of+creatinine+in+urine+by+MALDI-TOF+MS.">2,3,4,5-Tetrakis(3',4'-dihydroxylphenyl)thiophene: a new matrix for the selective analysis of low molecular weight amines and direct determination of creatinine in urine by MALDI-TOF MS.</a> Anal. Chem. 84, 10291-10297 (2012).</li><li>Shroff, R., Rulisek, L., Doubsky, J., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base-driven+matrix-assisted+mass+spectrometry+for+targeted+metabolomics.">Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).</li><li>Shroff, R., Svatos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+sponge:+a+novel+and+versatile+MALDI+matrix+for+the+analysis+of+metabolites+using+mass+spectrometry.">Proton sponge: a novel and versatile MALDI matrix for the analysis of metabolites using mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 7954-7959 (2009).</li><li>Shimma, S., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Microscopy+to+Reveal+Distinct+Localization+of+Heme+B+(m/z+616)+in+Colon+Cancer+Liver+Metastasis.">Mass Microscopy to Reveal Distinct Localization of Heme B (m/z 616) in Colon Cancer Liver Metastasis.</a> J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. 55, 145-148 (2007).</li><li>Paschke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mirion-A+Software+Package+for+Automatic+Processing+of+Mass+Spectrometric+Images.">Mirion-A Software Package for Automatic Processing of Mass Spectrometric Images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 1296-1306 (2013).</li><li>Parry, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=omniSpect:+an+open+MATLAB-based+tool+for+visualization+and+analysis+of+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+images.">omniSpect: an open MATLAB-based tool for visualization and analysis of matrix-assisted laser desorption/ionization and desorption electrospray ionization mass spectrometry images.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24, 646-649 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאמור לעיל, הכנת מדגם היא השלב הקריטי ביותר בתהליך העבודה של MSI. הטבעת הרקמה בצורה לא אחידה תגרום חתך להיות קשה או בלתי אפשרי במקרים מסוימים. גודל הסעיף וזמן איזון נאות הם קריטיים לשמירה על שלמות הרקמה וההימנעות מתקפל ודמעות. בחירה של מטריצה ​​ואת טכניקת יישום תשחק ת?...

השדה הולך וגדל של metabolomics יש יישומים ביולוגיים חשובים רבים, כולל גילוי סמן ביולוגי, פענוח מסלולים מטבוליים בצמחים ומערכות ביולוגיות אחרות, ופרופיל טוקסיקולוגיה 4,6-10. אתגר טכני עיקרי כאשר לומדים במערכות ביולוגיות הוא ללמוד מסלולי metabolomic מבלי לשבשם 11. MALDI-MSI מאפשר ניתוח ישיר של רקמות שלמות המאפשר זיהוי רגיש של analytes באיברים בודדים 12,13 ואפילו תאים בודדים 14,15. הכנת מדגם היא צעד חיוני בייצור דימויי רפאים המוניים לשחזור ואמינים. האיכות של התמונות מאוד תלויה בגורמים כגון בינוני רקמות הטבעה, עובי פרוס, מטריקס MALDI, ויישום טכניקת מטריצה. עבור יישומי הדמיה, עובי סעיף אידיאלי הוא הרוחב של תא אחד (8-20 מיקרומטר תלוי בסוג המדגם). MALDI דורש תצהיר של אורגני, Crystallinמתחם מטריצת דואר, בדרך כלל חומצה חלשה, על המדגם כדי לסייע אבלציה ויינון אנליטי. 16 מטריצות שונות מספקים עוצמות שונות אות, יונים מפריעים, ויעילות יינון של סוגים שונים של תרכובות. טכניקת יישום המטריצה ​​גם משחקת תפקיד באיכות של מסת תמונות רפאים וטכניקות שונות מתאימים לסוגים שונים של analytes. שלוש שיטות יישום מטריצה ​​מוצגות בפרוטוקול זה: מברשת אוויר, מרסס אוטומטי, ומראה. יישום מטריצת Airbrush כבר בשימוש נרחב בתחום ההדמיה MALDI. היתרון של יישום מטריצת מברשת אוויר הוא שזה הוא יחסית מהיר וקל. עם זאת, האיכות של יישום מטריצת airbrush מאוד תלויה במיומנות של המשתמש ונוטה להיות פחות לשחזור ולגרום לדיפוזיה של analytes, במיוחד מולקולות קטנות 17. יש מערכות מרסס אוטומטיות מכניקה דומה לairbrush יישום מטריצה, אבל havדואר פותחו כדי להסיר את ההשתנות ראו עם יישום airbrush ידני, מה שהופך את ספריי לשחזור יותר. שיטה זו יכולה לפעמים להיות יותר זמן רב יותר מאשר יישום מטריצת מברשת האוויר מסורתי. שני airbrush הידני ומערכות מרסס אוטומטיות שיטות יישום מטריצה ​​ממיסים מבוססות. העידון הוא טכניקת יישום מטריצה ​​יבשה שהופכת יותר ויותר פופולרי עבור ההדמיה ספקטרלי המונית של מטבוליטים ומולקולות קטנות משום שהיא מפחיתה דיפוזיה אנליטי, עם זאת, היא חסרה את צורך ממס כדי לחלץ ולבחון תרכובות מסה גבוהות יותר 18. זיהוי בטוח של מטבוליטים בדרך כלל דורש מדידות מסה מדויקות כדי להשיג הזדהויות המשוערות אחריו מסת טנדם ניסויים (MS / MS) עבור אימות, עם MS / MS ספקטרום שהשוואה לסטנדרטים, ספרות, או ספקטרום תיאורטי. , כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה פרוטוקול זה (מסת פתרון כוח של 60,000 במ &#39;/ z 400) (LC)-MS הוא מצמידים את MALDI-MSI לקבל גם מידע במרחב ובהזדהויות בטוחים של מטבוליטים אנדוגני, באמצעות Medicago truncatula שורשים וגושי שורש כמערכת הביולוגית. ניתן לבצע ניסויי MS / MS ישירות על הרקמה עם MALDI-MSI או על תמציות רקמה עם LC-MS ומשמשים לאימות של הזדהויות המטבוליט. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה למפה מטבוליטים אנדוגני בתוך: מ &#39; truncatula, אשר יכול להיות מותאם ומיושם על MSI של מולקולות קטנות בסוגי רקמות שונים ומערכות ביולוגיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gelatin</td>
			<td style="width:181px;">Difco</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td>
			<td style="width:611px;">heat to dissolve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat- HM 550</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:163px;">956564A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">indium tin oxide (ITO)-coated glass slides&#160;</td>
			<td>Delta Technologies</td>
			<td>CB-90IN-S107</td>
			<td>25-75-0.8 mm (width-length-thickness)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix&#160;</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td><a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx?ItemID=1787195">PI90033</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Airbrush</td>
			<td>Paasche Airbrush Company</td>
			<td>TG-100D</td>
			<td>coupled with 75 ml steel container</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td style="width:163px;">HTX.TMSP.H021-U</td>
			<td>Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sublimation apparatus&#160;</td>
			<td>Chemglass Life Science</td>
			<td style="width:163px;"><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vaccum pump- Alcatel 2008 A</td>
			<td>Ideal Vacuum Products</td>
			<td>P10976</td>
			<td>Ultimate Pressure = 1x10-4 Torr</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td style="width:163px;">276601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">FlexImaging</td>
			<td style="width:181px;">Bruker Daltonics</td>
			<td>269841</td>
			<td>One example of &#34;vender specific software&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MALDI LTQ Orbitrap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td>
			<td>High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Q Exactive</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maldi-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in medicago truncatula root nodules

רוב הטכניקות המשמשות ללמוד מולקולות קטנות, כגון תרופות סמים או מטבוליטים אנדוגני, להעסיק תמציות רקמה הדורשות הומוגניות של הרקמות של עניין שעלול לגרום לשינויים במסלולים מטבוליים נחקרים 1. ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי אנליטי רב עוצמה שיכול לספק מידע המרחבי של analytes בתוך פרוסות שלמות של דגימות רקמה ביולוגיות 1-5. טכניקה זו נעשתה שימוש נרחב ללמוד סוגים שונים של תרכובות כוללים חלבונים, פפטידים, שומנים, ומולקולות קטנות, כגון מטבוליטים אנדוגני. עם desorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס (MALDI)-MSI, הפצות המרחבי של מטבוליטים רבים ניתן לאתר בו זמנית. בזאת, שיטה שפותחה במיוחד עבור ביצוע ניסויי MSI metabolomics לא ממוקדים בשורשי קטניות וגושי שורש מוצגת שיכול לחשוף תובנות התהליכים הביולוגיים המתרחשים.שיטה שהוצגה כאן מראה זרימת עבודה MSI טיפוסית, מהכנת מדגם לרכישת תמונה, ומתמקדת בשלב יישום מטריקס, הוכחת כמה טכניקות יישום מטריצה ​​כי הם שימושיים לאיתור מולקולות קטנות. ברגע שהתמונות של הטרשת הנפוצה שנוצרו, הניתוח וזיהוי של מטבוליטים של העניין נדון והפגינו. זרימת העבודה סטנדרטית שהוצגה כאן ניתן לשנות בקלות לסוגי רקמות שונים, מינים מולקולריים, ומכשור.

סקירה ניסיונית של MSI מוצגת באיור 1. בתחילת הניסוי מאוד, הכנת מדגם היא שלב קריטי. גושים הם גזומים משורש הצמח ומשובץ בג&#39;לטין. הרקמה חייבת להיות לחוצה אל כוס cryostat, ללא בועות, בזמן שהוא קפוא, זה יהיה להבטיח יישור קל ותקין של הרקמות בזמן שהוא מחולק. כאשר הרקמה נמצאת...

Watch this Scientific Journal Video about MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules at JoVE.com

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בם כדי לגלות ולזהות תרכובות כימיות שונות ברקמות שלמות, שמירה על התרכובות בסביבות האם שלהם, אשר יכול לספק תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים. להלן שיטת MSI פיתחה לניתוח של מולקולות קטנות, הוא תאר.

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; רוט גושים

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

18.8K Views.  University of Wisconsin- Madison.  ההדמיה ספקטרומטריה (MSI) היא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בם כדי לגלות ולזהות תרכובות כימיות שונות ברקמות שלמות, שמירה על התרכובות בסביבות האם שלהם, אשר יכול לספק תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים. להלן שיטת MSI פיתחה לניתוח של מולקולות קטנות, הו?...

Video: MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) plasmid. A. rhizogenes can cause hairy root formation on plant tissues and form composite plants after transformation. On these composite plants, some of the regenerated roots are transgenic, carrying the wild type T-DNA and the engineered binary vector; while the shoots are still non-transgenic, serving to provide energy and growth support. These hairy root composite plants will not produce transgenic seeds, but there are a number of important features that make these composite plants very useful in plant research. First, with a broad host range,A. rhizogenes can transform many plant species, especially dicots, allowing genetic engineering in a variety of species. Second, A. rhizogenes infect tissues and explants directly; no tissue cultures prior to transformation is necessary to obtain composite plants, making them ideal for transforming recalcitrant plant species. Moreover, transgenic root tissues can be generated in a matter of weeks. For Medicago truncatula, we can obtain transgenic roots in as short as three weeks, faster than normal floral dip Arabidopsis transformation. Overall, the hairy root composite plant technology is a versatile and useful tool to study gene functions and root related-phenotypes. Here we demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species M. truncatula.

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

We demonstrate how hairy root composite plants can be used to study plant-rhizobium interactions and nodulation in the difficult-to-transform species Medicago truncatula.

דור של צמחים Composite ב Medicago truncatula המשמש מבחני Nodulation

Similar to Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes can transfer foreign DNAs into plant cells based on the autonomous root-inducing (Ri) ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution of efflux pumps from the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa in a biomimetic environment that allows for an accurate investigation of their activity of transport. Three prerequisites are fulfilled: compartmentation in a lipidic environment, use of a relevant index for transport, and generation of a proton gradient. The membrane protein transporter is reconstituted into liposomes together with bacteriorhodopsin, a light-activated proton pump that generates a proton gradient that is robust as well as reversible and tunable. The activity of the protein is deduced from the pH variations occurring within the liposome, using pyranin, a pH-dependent fluorescent probe. We describe a step-by-step procedure where membrane protein purification, liposome formation, protein reconstitution, and transport analysis are addressed. Although they were specifically designed for an RND transporter, the described methods could potentially be adapted for use with any other membrane protein transporter energized by a proton gradient.

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

We present a protocol for the in vitro investigation of efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa. This protocol allows for the generation of a robust, reversible, and tunable proton gradient within the liposome membrane and hence should be adaptable to any membrane protein energized by the protomotive force.

במבחנה של החקירה וMexAB זרימת המשאבה מPseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

סנכרון של<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; לחקירה של מחזור תא החיידק

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

מדידות התכווצות שרירים בpapillary מבודדים לחקירת הלב Inotropy בעכברים

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

כיול ביצועים מיקרוקול MRM ושימוש הפגינו על שורשי truncatula Medicago ב 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

הכנה לדוגמה ליצירת פרופיל מטבולי באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

סטייה של מיקרוביוטה שורש בבתי גידול שונים המבוססת על רשתות מתאם משוקללים

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...