Parasponia הוא עץ טרופי של משפחת הקנביס כי הוא מסוגל להקים סימביוזה תיקון חנקן עם רזוביום. מחקרים השוואתיים בין Parasponia ו קטניות יכול לספק תובנה לתוך רשתות גנטיות הליבה שבבסיס סימביוזת קנה הנשימה. עם פרוטוקול זה, Parasponia andersonii קווי מוטציה מהופנטים יציבים יכולים להיווצר בתקופה של חודשיים עד שלושה חודשים.
ניתן להפיץ קווים אלה ביעילות באמצעות הפצה במבחנה. פרוטוקול זה מספק פלטפורמה ניסיונית לחקר סימביוזה ריזוביאלית, כמו גם היבטים אחרים של הביולוגיה של עץ טרופי זה. מיומנויות בסיסיות בתרבות הרקמות ובשכפול מולקולרי מספיקות כדי ליישם פרוטוקול זה.
זה מאפשר לכל מעבדה להתאים את Parasponia כמודל מחקר. הדגמת ההליך יהיו סטודנטים לדוקטורט טיטיס Wardhani ויודה Roswanjaya יחד עם מרייקה הרטוג, טכנאי במעבדה שלנו. כדי לגדל עצי Parasponia andersonii, להתחיל על ידי נביטת הזרעים.
הסר את הזרעים מ פירות יער Parasponia על ידי שפשוף על החלק הפנימי של מסננות תה או למעוך אותם על פיסת נייר טישו. לחטא זרעים באמצעות אקונומיקה hypochlorite 4% במשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן לשטוף את הזרעים שש פעמים עם מים מעורקים. מעבירים את הזרעים לצינורות PCR סטריליים של 200 מיקרוליטר, וממלאים את הצינורות במים מעוקרים כדי להטביע את הזרעים.
דגירה הצינורות במשך 10 ימים בתרמוציקלר על פי הוראות כתב היד. לאחר הדגירה של 10 ימים, מעבירים את הזרעים לצלחות SH-0, וסגרו אותם בשתי שכבות של רדיד איטום אלסטי למניעת ייבוש. דגירה ב 28 מעלות צלזיוס עם מחזור של 16 שעות ביום, שמונה שעות בלילה במשך שלושה עד ארבעה שבועות.
לאחר השתילים לפתח את הסט הראשון שלהם של עלים אמיתיים, להעביר אותם סירים מלאים באדמת שתיל מסחרית, ולכסות אותם עם פלסטיק שקופה כדי למנוע ייעוד. מניחים את הסירים בחדר אקלים של 28 מעלות, 85% לחות יחסית או חממה תחת משטר של 16 שעות ביום, שמונה שעות בלילה. לאחר שבוע, להסיר את הפלסטיק.
באופן קבוע להשקות את הסירים, ותוסף עם דשן כדי לקיים את צמיחת העצים. היכונו לשינוי על ידי קצירת ענפים צעירים של חמישה עד שמונה ס"מ מהעצים הגדלים בחממה, הקפדה להשתמש רק בענפים בריאים ולא מדביקים. חותכים את העלים, משאיר סנטימטר אחד בריבוע של רקמת עלה בסוף כל petiole.
לחטא את הרקמה במשך 15 דקות עם 2%hypochlorite אקונומיקה המכילה כמה טיפות של פוליסורבט 20, ולאחר מכן לשטוף אותו שמונה פעמים עם מים autoclaved. להשעות מחדש את תאי האגרובקטריום ב 25 מיליליטר של מדיום חדירה לצפיפות אופטית של כחמש. חותכים את הגבעול ואת רקמת petiole לחתיכות סנטימטר אחד בתוך ההשעיה התא.
הסר את רקמות העלה להדגיר את חתיכות גזע petiole בהשעיית התא במשך 10 עד 30 דקות. מייבשים את חתיכות הרקמות על פיסת נייר סטרילית ומ מניחים אותן על מדיום השתרשות שהוכן על פי הוראות כתב היד. הדגירה את הצלחות בחושך ב 21 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
לאחר יומיים, לבדוק את הצלחות לזיהום פטרייתי או חיידקי להשליך צלחות מזוהמות. מעבירים את חתיכות הרקמה ל-10 מיליליטר של מדיום SH-10 המוכן לפי הוראות כתב היד. השאירו את הרקמה במדיום לפחות 10 דקות, בעדינות להתסיס כל שתיים עד שלוש דקות לשטוף.
מכינים מדיום השתרשות עם cefotaxime ו kanamycin על פי הוראות כתב היד, ויוצקים צלחות. יבש את הרקמות על חתיכות סטריליות של נייר מסנן, ולהעביר אותם לצלחות. דגירה צלחות במשך שבעה ימים ב 28 מעלות צלזיוס תחת משטר של 16 שעות ביום, שמונה שעות בלילה.
בדוק צלחות לזיהום פטרייתי או חיידקי כל יומיים. במקרה של זיהום, מעבירים את חתיכות הרקמה הלא מדביקות לצלחת טרייה. לאחר שבעה ימים, מעבירים את חתיכות הרקמה למדיום הפצה שהוכן על פי הוראות כתב היד והדגירה ב-28 מעלות צלזיוס תחת משטר של 16 שעות ביום, שמונה שעות בלילה.
רענן את הצלחות פעם בשבוע עד יורה מהועבר לפתח, הקפדה רק להעביר חתיכות רקמה לא מושפעת צלחות חדשות. לאחר יורה מהוסס putative הם לפחות סנטימטר אחד ארוך, לחתוך את יורה ולתרבת אותם באופן עצמאי במדיום התפשטות עם אנטיביוטיקה. כדי להבטיח כי היורה מייצגים טרנספורמנטים עצמאיים, לקחת רק ירייה אחת מכל צד של explant.
להפיץ את הרקמה על ידי הצבת כ 10 יורה על צלחת טרייה של מדיום התפשטות וסגירת הצלחת עם שתי שכבות של רדיד איטום אלסטי. הדגירה את הצלחות ב 28 מעלות צלזיוס תחת משטר של 16 שעות ביום, שמונה שעות בלילה, ולחזור על צעד זה כל ארבעה שבועות. כאשר היורה להגיע סנטימטר אחד אורך, לחתוך אותם בבסיס שלהם למקם אותם על המדיום השתרשות.
מקם את היריות זקוף על ידי החדרת הקצה הבסיסי של לירות לתוך המדיום. כ -10 יורה ניתן להציב על צלחת אחת. התחל על ידי הכנת ריזוביום inoculum.
לחסן 10 מיליליטר של מדיום YEM נוזלי מושבה אחת של Mesorhizobium plurifarium BOR2, ודגירה ב 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים. השתמש בתרבות זו כדי לחסן נפח גדול יותר של אמצעי YEM נוזלי. לאחר הגידול, צנטריפוגה התרבות החיידקית במשך 10 דקות ב 3, 500 פעמים גרם כדי לקצור את התאים.
להשעות מחדש את גלולת חיידקי במדיום EKM נוזלי, ולקבוע את הצפיפות האופטית. הכינו שלושה ליטרים של מדיום EKM, וזה מספיק עבור כ 20 סירים, ולחסן אותו עם ההשעיה rhizobial. מערבבים את המדיום עם 1.25 ק"ג של פרליט, ומוסיפים 210 גרם של תערובת זו סירי פוליפרופילן שקופים סטריליים.
לשתול אחד עד שלושה Plantlets Parasponia andersonii לכל סיר, ולהכין כמה סירים עם plantlets טרנספורמציה עם מבנה הבקרה. שוקלים כמה מהסיר, ומכסים את החלק התחתון של כל סיר כדי להגן על השורשים מפני חשיפה לאור. דגירה הסירים בחדר צמיחה climatized ב 28 מעלות צלזיוס תחת משטר של 16 שעות ביום, שמונה שעות בלילה במשך ארבעה עד שישה שבועות.
פעם בשבוע, לשקול כמה סירים כדי לקבוע אובדן מים. אם אובדן המים עולה על 10 מיליליטר, להשלים עם מים טהורים במיוחד כדי לפצות על האובדן. לאחר הדגירה, נקה את השורשים מ perlite, ולקבוע מספרי גוש באמצעות משקפת.
טכניקה זו שימשה בהצלחה להפוך petioles ומקטעים של גבעולי Parasponia andersonii עם זן אגרובקטריום AGL1. ראשית, מתפוצץ הרקמות מעובד במשותף עם אגרובקטריום במשך יומיים. גידול שותף ממושך גורם להתיישבות יתר חיידקית ויש למנוע אותה.
כמה שבועות לאחר מכן, מיקרו-קאלי ירוק קטן נצפה לאורך משטח הפצע המקורי. קאלי אלה ממשיכים לגדול ולפתח אחד או יותר יורה טרנספורמציה putatively בשישה עד שמונה שבועות לאחר תחילת השינוי. יעילות הטרנספורמציה נעה בין 10% ל-30% עבור מתפוצי רקמות מסניפים בוגרים ל-65%-75% עבור מתפוצצי רקמות מסניפים צעירים הגדלים במהירות.
יורה מהוותי ניתן להכפיל באמצעות התפשטות במבחנה, אשר מעורר עשרות יורה בתוך חודש. יורה אלה יכולים להיות ממוקמים על מדיום השתרשות כי יגרום היווצרות השורש בעוד כשבועיים ולתניב צמחים שיכולים לשמש לניסויים. בעת התחלת ניסוי טרנספורמציה יציב, חשוב לבחור ענפים בריאים כחומר מקור.
קווים מהווים של Parasponia T0 מופץ במבחנה. לכן, זה חיוני כדי ביסודיות גנוטיפ Parasponia קווים מהומשים. הקמת Parasponia כמודל ניסיוני מאפשרת ניתוח השוואתי בין שני שושלת נודלס הקשורים מרחוק, פרספוניה וקטניות.
זה יכול לזהות רשתות גנטיות שימור שבבסיס סימביוזת קנה הנשימה. Parasponia יכול להיות גם מודל בעל ערך ללמוד נושאי מחקר אחרים כגון היווצרות עץ, התפתחות של פרחים ביסקסואלים, או biosynthesis של מטבוליטים משניים ספציפיים Cannabaceae.
