This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. פיתוח העובר Zygotic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומר צמחי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Medicago truncatula סוג בר Jemalong או isogenic הקרוב, מאוד מחדש generable גנוטיפ Jemalong 2HA 13 (המכונה 2HA) בחממה עם photoperiod 14 שעות ו / 19 ° טמפרטורת יום / לילה C 23 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס פני השטח של קליפת הזרע (עם מחט G 23) לפני זריעת הזרע כך המים שהורשו להיכנס לזרע ולספוג במים למשך הלילה. להוסיף מספיק מים כדי לכסות את הזרע באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרוע זרעים 3 בכל סיר בקוטר 15 סנטימטר (כולל של 10 סירים) בתערובת שתילה (חול, פרלייט, קויר-כבול הגס (1: 1) בתוספת 5 גרם של תקן Osmocote מדויק:: 1 דשן שחרור איטי) והעברה ל חממה. שמור השתיל הבריא לאחר נביטה ולכן יש צמח 1 לסיר ולהקיף ידי סבכה למפעל נובע לטפס. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרמילי קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תרמילים מwסוג הכשרת היישוב Jemalong או 2HA להשיג שלבי עובר המוקדם המתאימים כמתואר 9 ראשון. הערה: שלבי התרמיל השונים מוצגים באיור 1 ושלבי עובר המקביל מוצגים באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השלבים השונים בתרמיל הקציר באמצעות קריטריונים לפי טבלת 1. מדוד את הזמן שחלף מהשלב 6 כדי לעזור שלבים נפרדים 6 ו -7 (טבלה 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח ביציות מתרמילים ובדיקת שלב העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד ביציות מתרמילים באמצעות מלקחיים עדינים לבד או מיקרוסקופ לנתח סטריאו ומלקחיים בהתאם לצורך. אם נדרש שלב העובר ניתן לבדוק במהירות באמצעות מיקרוסקופ מתחם סטנדרטי (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן שונה הפתרון של Hoyer מכיל 7.5 גרם מסטיק ערבי, 100 כלורל גרם, 5 מיליליטר גליצרול, 60 מיליליטר deionized מים מזוקקים. ממיסים על ידי ערבוב במשך 3-5 שעות או לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך יותר לחדדמיקרוסקופיה ד לנקות את הביציות גזור ב15,16 הפתרון של Hoyer שונה. בזהירות להרים את הביציות ללא פגע ומקום בנפח קטן של הפתרון של Hoyer (מספיק כדי לכסות את הביצית) בטמפרטורת חדר עד ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה דגימות עם התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה. ללכוד תמונות iwth מצלמה דיגיטלי 9 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ביציות אחידות ביותר מאזור התרמיל המרכזי ולצבור את המספר הנדרש. דוגמא מוצגת באיור 3 א. לאסוף את הביציות על קרח ולאחסן בטמפרטורה הנדרשת (חומצות -80 ° C לגרעין) לניתוח נוסף. הערה: לפרטים על ניתוח סעיפים היסטולוגית, מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים, וכלאה באתר אנא ראה ניירות 8,9. </li></ol></li></ol> 2. פיתוח העובר סומטי במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מ &#39; לא זן truncatulaכובע הוא מסוגל ליצור בקלות עובר בתרבות. לפרוטוקול זה לexplants העלה להשתמש בצמחי 2HA 13,17 שישנים 2-4 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח עלונים מעלו trifoliate האחרון כמעט הרחיבו באופן מלא של גזע מתארך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העלים trifoliate על מגבת נייר לחה בסיר תרבות כדי למנוע התייבשות. הערה: לאחר העלים trifoliate נקצרים הם צריכים להיות מנוצלים עם עיכוב מינימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מדיום התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים באגר (0.8% w: V) ב9 סנטימטרים צלחות פטרי. הערה: 10 P4: 4: 1: 5 בינוניים מורכב של מדיום בסיס P4 18 בתוספת 10 חומצת 1 מיקרומטר-naphthaleneacetic (NAA), 4 מיקרומטר 6-benzylaminopurine (BAP), 1 מיקרומטר חומצת abscisic (ABA) ו -5 מיקרומטר gibberellic חומצה (GA). השימוש בGA + ABA מאיץ היווצרות עובר וגורם לעליות מהותיות במספר עובר 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את מדיום בסיס P4 בL 1; בהיקף של מלחים גדול (לעשות calciuמ &#39;עד בנפרד), מלחי קטין וויטמינים (לוח 3), ברזל chelated (לפצות בנפרד), casamino חומצות (hydrolyzate קזאין), 30 גרם סוכרוז, 8 אגר ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות מניות חנות של מלחים גדול, סידן, חומצות casamino, מלחים ויטמינים וקטין ב -20 מעלות צלזיוס aliquots המתאים. אחסן ברזל chelated ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את ברזל chelated (200x) על ידי המסת 7.44 גרם של Na 2 EDTA • 2H 2 O בכ 900 מיליליטר של מים מזוקקים deionized תוך ערבוב, ואז להביא את הפתרון ל98-99 מעלות צלזיוס תוך הוספת 1.853 גרם של 4 FeSO • 7H 2 א &#39; לבסוף לעשות עד 1 ליטר כאשר המרכיבים מומסים. חנות בענבר צבעונית בקבוקים ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכיבים את מדיום בסיס P4 עם פתרונות המניות כבטבלה 4. ההורמונים במדיום הם 10 מיקרומטר NAA, 4 BAP מיקרומטר, ABA 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר GA (ראה טבלת טבלה 4 וחומרים ספציפיים). הוסף את NAAוBAP לפני מעוקר ולהוסיף ABA וGA לאחר המעוקר וקירור לכ -55 מעלות צלזיוס, באמצעות עיקור מסנן עם 0.22 מיקרומטר סינון מצורף מזרק. מערבבים היטב על ידי מתערבל עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את התקשורת לpH 5.8 עם 1 M KOH לפני מעוקר. החיטוי בC ° 121 במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המעוקר להוסיף ABA המסנן מעוקר וGA, ויוצקים כ 25 מיליליטר של תקשורת ל9 סנטימטרים צלחות פטרי סטרילי בזרימה למינרית או ארון Biohazard. מגניב ולתת את אגר קבע עם המכסה. ואז לשים על המכסה ולוודא שאין עיבוי על המכסה. תווית כנדרש ולאחסן ב 4 ° C (בקופסא קרטון כדי למנוע עיבוי מכסה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיקור של רקמת העלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבוד בזרימה למינרית עיקור UV או ארון Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום משאיר לרשת הכדור של infuser אביב תה autoclaved בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את infuser תה המכיל את העלים ב -70% (v: v) אתנול ברחוב ללאסיר ture למשך 30 שניות. הערה: לכל השלבים בהליך זה משתמשים 250 מיליליטר בורג סירי תרבות פוליקרבונט כובע שautoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים ולאחר מכן להעביר ולטבול את רקמת עלה 1: 8 (v: v) אקונומיקה מדוללת (כלור 0.5%) במשך 10 דקות. מערבולת בעדינות מהעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את אקונומיקה ולהעביר את infuser התה בסיר תרבות המכיל מים מזוקקים deionized סטרילית. מערבולת בעדינות וניקוז מים עודפים. חזור עוד פעם אחת עם סיר תרבות טרי של מים מזוקקים deionized סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר עלים מinfuser התה עם מלקחיים סטריליות לסיר תרבות טרי של מים מזוקקים deionized סטרילית. ברגים בכובע סטרילי ולשטוף על ידי היפוך ומתערבל. השאר עלים צפים על המים סטריליים עד מוכן להכין explants. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה וציפוי Explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות סטרילי, לקצץ עלונים מעוקרים בודדים מהקצה עם אזמל, וחתך את המלבן שנותר לשניים או thrEE explants המלבני (8-10 x 3-5 מ&quot;מ) עם אמצע הווריד במרכזו של כל explant (איור 5 א). הערה: הגודל של explant הוא די חשוב בייזום שפשף הראשון. לבצע את החיתוך על עפעפי סטרילי ממכלי מזון לקחת משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 6 explants במדיום התרבות-הגדילו את אגר ב9 מנות קוטר סנטימטר פטרי (איור 5). צלחת בצד abaxial explants למטה כדי לשמור על אוריינטצית עלה רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את צלחות פטרי עם Parafilm (איור 5 ג) נמתחו סביב הצלחת. הרקמה מוכנה לדגירה עכשיו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות בחושך על 28 מעלות צלזיוס בטמפרטורה מבוקרת חדר או ארון צמיחה לאורך כל תקופת התרבות. הערה: explants ייזום dedifferentiation, לעבור חלוקת תא, התפשטות (היווצרות יבלת) ועובר (בידול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת expla ההבחנהNTS לאחר 3 שבועות למדיום חדש. בתת-תרבות זו להעביר את כל explant בעזרת מרית סטרילי נירוסטה ומלקחיים, בזרימה למינרית או ארון Biohazard. כשפשפתי מתרחש והיבלת חורגת מהגודל של אחד הגדול באיור 5 ג, להעביר 50% מהיבלת בודדת כאשר subculturing למדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לעוברים הראשונים בכ -4 שבועות. אמנם יש מידה מסוימת של תיאום, לאסוף שלבי עובר שונים על תקופת דגירה 4-8 שבוע (איור 6 א &#39;, ב&#39;). לאסוף תחת מיקרוסקופ לנתח ותהליך על פי מטרות ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת-תרבות כל 3 שבועות ולהסיר עובר מעת לעת, כך שexplants ימשיך לייצר עוברים במשך 3 חודשים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes.">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation.">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li><li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling.">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs.">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li><li>Birnbaum, K. D., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+across+kingdoms:+regeneration+in+plants+and+animals.">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li><li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues.">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li><li>Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+seeds+and+embryos+of+Medicago+truncatula+cultured+in+vitro.">Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro.</a> Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).</li><li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

הפרוטוקולים שתוארו הם יחסית ישר קדימה ולאפשר חקירה של עובר קטניות עם כל התא העכשווי וטכניקות מולקולריות. אנו מכירים בכך שיש יתרונות וחסרונות של שני in vivo ובגישות חוץ גופית. שני לאפשר יותר דגש על עובר מוקדם בהשוואה לתרבות של זרעים בשלים 19. <p class="jove_content" style="...

קטניות הן המשפחה השלישית בגודלה של צמחים גבוהים עם כ -20,000 מינים ומשפחת בלאגאמינוסא (או Fabaceae) הם שני לדגנים באזור שנקטפו וייצור כולל 1. סויה היא היבול טיפח השלישי בגודלה. קטניות דגנים מספקות כשליש מחלבון תזונתי ושליש משמן צמחי למאכל אדם 2. קטניות עם קיבולת תיקונם N 2 גם לתרום למערכות חקלאיות ברות קיימא. Truncatula Medicago, כמו סויה, חלבון חנויות ונפט בפסיגים של הזרעים והוא מודל קטניות גנטי והגנומי עם משאבים גנטיים והגנומי רבים 3,4. בעוד מ &#39; truncatula אפשר התקדמות בהבנת הסימביוזה הקטניות-rhizobium 4 זה כבר מועסק יותר ויותר ללמוד ביולוגיה זרע קטניות 5-7 ועובר 8,9. עובר ארבידופסיס נחקר בהרחבה 10,11 אבל זה אניללא קטניות sa ואת הפרטים של עובר אינן זהות לMedicago 8,10. עובר Zygotic במ &#39; יש truncatula תכונות מעניינות, עם היפופיזה ייחודית רב-תאית, suspensor endoployploid ותא העברת בסיס 8. עובר סומטי (SE) משמש בדרך כלל לחידוש צמחים 12. במודל הקטניות מ &#39; truncatula, קו זרע Jemalong 2HA (2HA) פותח מההורה Jemalong יש שיעור גבוה של עובר גופני 13. לאחרונה מספר העוברים שיוצרו כבר עלה באופן מהותי על ידי הוספת שתי חומצת gibberellic (GA) וחומצת abscisic (ABA) למדיום הוותיק 14. במקרה זה GA ומעשה ABA בסינרגיה, שהוא יוצא דופן בהתחשב בכך שGA וABA בדרך כלל לפעול באיבת 14. העוברים המופקים מיבלת לפתח על פני השטח המאפשר לשלב של עובר להיות בקלות נקבע visually ונקטף בקלות. לאחר ליד קווי isogenic שembryogenic (2HA) ולא embryogenic (Jemalong) מאפשרת החקירה של עובר גופני ושיש שני in vivo ובמערכות מבחנה מספקת אפשרויות ניסויים שונות. הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים של התפתחות עובר היא חיונית לזרע הבנה והתפתחות צמח. בקטניות, כמו בdicotyledons האחר, זה הפסיגים של העובר שלאחסן את המוצרים המשמשים לתזונת אדם. עובר מוקדם כרוך חלוקת תא מהירה, ודפוסי עובר נכונים. בכ 8 ימים לאחר ההפריה, מ &#39; עובר truncatula מגיע שלבים מוקדמים טבורית. אפיון מורפולוגי לא הצביע בדיוק על ידי ימים לאחר הפריה בתנאי חממה. לפיכך, גישה סטנדרטית יעילה כדי לציין את השלב של עוברים מתפתחים היא רבת ערך בלימוד regul הגנטיני של עובר zygotic המוקדם. במאמר זה, אנו מספקים שני פרוטוקולים סטנדרטיים לאסוף עוברים מתפתחים למחקרים ביולוגיים של עובר במודל הקטניות מ &#39; truncatula. הראשון הוא לאסוף עוברי zygotic ידי שיוך מורפולוגיה עובר ותרמיל ואילו השני הוא עובר גופני באמצעות explants עלה culturing לספק מספרי עובר גדולים לגשת בקלות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >P4 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Major salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minor salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitamins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Bacto agar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plant hormones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Abscisic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Benzylaminopurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3274</td>
			<td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gibberellic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7645</td>
			<td>Dissolve in small amount of ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZFLIII</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiophot</td>
			<td>Or similar, with suitable optics</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam HRc</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilising leaves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>75.9922.519</td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

עובר מוקדם החל מהזיגוטה תא בודדת עובר דרך חלוקת תאים מהירה והמורפוגנזה, ומאופיין מורפולוגית בשלבים טרום-כדורי, כדורי, לב, טורפדו וטבורית. פיתוח מתקדם זה הוא תחת הרגולציה ההדוקה של רשת מולקולרית מורכבת. קציר עוברים מוקדם מספיק בשלב דומה של פיתוח הוא חיוני לחקירת הוויסות התאית ומולקולרית של עובר מוקדם. זה לא פשוט מאז עובר מוקדם עובר המורפוגנזה מהירה בזמן קצר לדוגמא 8 ימים לMedicago truncatula להגיע שלב טבורית המוקדם. כאן, אנו מתייחסים לנושא בשתי גישות. הראשון קובע זיקה בין התפתחות עובר ומורפולוגיה תרמיל בסיוע מצביע על השלב של עובר zygotic. זה מבוסס בעיקר על מספר ספירלות תרמיל והפיתוח של עמוד השדרה. דרך חלופית כדי להשלים את in vivo שלtudies הוא באמצעות explants עלה culturing לייצר עוברים גופניים. הבינוני כולל שילוב הורמון יוצא דופן - אוקסין (חומצת 1-naphthaleneacetic), ציטוקינין (6-benzylaminopurine), חומצת abscisic וחומצת gibberellic. ניתן להבחין בשלבים השונים הצומחים מתוך היבלת ללא נתיחה.

למבני תרמיל zygotic עובר שונה המתאימים לשלבי עובר השונים מוצגים באיור 1 א - F ואילו שלבי העובר השונים מוצגים באיור 2 א - F. על ידי בחירת תרמילים באותו השלב, דגימות של ביציות שניתן להשיג אחיד למדי (איור 3 א). על ידי שימוש בעובר RT-qPCR ג...

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.8K Views.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Video: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והפצת RNA In-situ בתוך עובר דרוזופילה מוקדם

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

בידוד של תאי גזע מזנכימליים של רקמת שומן חולדה לצורך התמיינות לתאים המייצרים אינסולין

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

פנים אל פנים הכנה לכרית אנדוקרדיאלית לניתוח מורפוגנזה מישורית בעוברי עכברים

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...