עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט EB-R01 ו R01 008,836 HL083895 (הן LEN). אנחנו יכולים להודות דריל סמית&#39;, נפח הזכוכית אוניברסיטת לביצוע bioreactors למחקר שלנו.

דוד לחץ להרכיב את צינור החיטוי של מערכת הזרימה ורכיבים bioreactor (bioreactor עצמו את המכסה פקק סיליקון) הורה כמו באיור 1 ואיור 2. צינור האכלה יש מחבר זכר בצד אחד וסוף לפתוח בצד השני. שלושה קטעים קצרים צינורות מוכנסים דרך כובע סיליקון לחילופי הגזים. 1. תפירה PGA Mesh <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור PGA רשת אל 1.1cm x ~ גיליון 8cm (תלוי בגודל bioreactor). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות סיליקון נקי (קוטר פנימי 3mm) עם מים מזוקקים (dH20) ואוויר יבש לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 6.0 תפר Dexon לתפור PGA רשת סביב צינור סיליקון נקי מתחיל עם שלושה קשרים כירורגי ואחריו תפרים יחיד. </li></ol> 2. PGA פיגומים טיפול פני השטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים PGA פיגומים ב 1M NaOH עבור 1-2min ולהקליט את זמן הטיפול ולהשתמש באותו הזמן עבור כל פיגומים PGA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף PGA פיגומים באמבטיות dH2O 2 דקות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פט PGA פיגומים יבש עם מטבל Kimwipes בין כל DH 2 אמבטיות O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש PGA פיגומים מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה לייבוש באוויר במשך 15 דקות עם מפוח על. </li></ol> 3. דקרון נשק תפירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תפר Prolene 4.0 לתפור חתיכות קטנות של האזיקים דקרון (1cm) על צד של הרשת PGA עם חפיפה של 2-3mm. הערה: להיזהר לא לנקב בצינור סיליקון (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תפר אותו לתפור שלושה תפרים סביב הקצה החופשי של האזיקים דקרון. הקפד להשאיר מספיק התפרים בקצוות ללא תפר Prolene לצעד 5.1 (איור 3). </li></ol> 4. האסיפה של bioreactor (יום לפני תחילתה של תרבות bioreactor) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים רשת תפור צינורות סיליקון, מכשירי ניתוח, ואת חוט דק באמבטיה אתנול 70% עבור 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שקיות החיטוי המכיל את bioreactor ו להטביע אותו באמבטיה אתנול 70% לפחות 30 דקות לפני הרכבת. הקפידו לשטוף את bioreactor ביסודיות עם אתנול. חשיפה של כל הרכיבים bioreactor אתנול 70% הוא צעד נוסף עיקור. צעד זה גם מסיר רעלן פנימי, אשר לא הוסר על ידי מעוקר והיא מזיקה לתאי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך צינורות סיליקון דרך הצד נשק באמצעות תיל דק למשוך את זה עד הסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח bioreactor מתוך האמבטיה אתנול (לשמור על רשת שקוע אתנול). תקן הפיגום PGA בתוך bioreactor על ידי הידוק האזיקים דקרון על השפתיים זכוכית מתרחבים על ידי הידוק וקשירת את התפרים Prolene (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צד אחד של נשק בצד bioreactor למחברים דרך צינורות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך הצד השני של צינורות סיליקון עם מתח מספיק להכניס את שאר שני מחברי לתוך צינורות סיליקון. תחזיקי צינורות סיליקון בחוזקה בעת הוספת מחברים! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחדש bioreactor לאמבטיה לשטוף עם אתנול אתנול על ידי משיכתו בעדינות מחברים מתוך הנשק בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליפ bioreactor מעל ולאפשר להשרות למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bioreactor פליפ בצד ימין למעלה להשרות במשך 10 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את כל אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שלוש מנות גדולות פטרי (10 ס&quot;מ) בסדרה ו bioreactor מקום בצלחת מרכז להחזיק אתנול עודף נטף הקצוות של הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש bioreactor ו PGA רשת עם מים רקמות התרבות באמצעות פיפטה 5 מ&quot;ל או 10 מ&quot;ל. גם רקמת סומק התרבות מים לתוך צינור סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לנקז את כל המים העודפים לתוך בצלחות פטרי משני צדי bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bioreactor יבש לילה ברדס עם מפוח ולכבות UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערות נוספות: לוודא בר ומערבבים סטרילי הוא bioreactor. הקפד לא &quot;לרחף&quot; מעל bioreactor מרגע זה והלאה, כדי למנוע זיהום. חותכים את שפע של רצועות parafilm ולספוג אותם באמבטיה קטנה אתנול 70% (גדול צלחת פטרי עובד היטב). </li></ol> 5. יום 1: הגדרת bioreactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי סטרילית על פתיחת bioreactor כל להגן על פיגום בתוך PGA של מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מערכת זרימת bioreactor כמצוין באיור 4 ו parafilm כל המפרקים חיבור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו מחברי הראשון עם מגבונים אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נמל זריקה בזרוע, השלישי בשימוש של bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות סוס ים ועניבה מקצה הכחול של דילול מלוחים כמפורט קרוב לצומת-Y האפשרי. משוך מהדק הצינור במקום כדי להבטיח שאין להעביר נוזל לחלק זה של הצינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שקית העירוי, &amp; לצרף צינורות סוס ים (אדום) אל הקצה המרוחק של שקית העירוי. הקפד לנגב נמל הכניסה עם אלכוהול לנגב הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף סוס ים בצד אחד של מערכת זרימה (דרך צינור סוף לבן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 3 כיווני שסתום לתוך מערכת הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מתמר הלחץ &amp; להתחבר שסתום משולשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הקצה השני של מתמר לחץ לפתיחת באמצע בתיק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחברbioreactor למערכת לזרום דרך צומת ה-Y. השתמש במזרק 60ml להוסיף 350ml של 1% fungizone (5 מ&quot;ל לערבב עם fungizone 495ml של PBS) כדי שקית העירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסחוט שקית העירוי כדי לשטוף את המערכת זורם על ידי התאמת זין לעצור כדי לאפשר זרימה של PBS. הערה: לבדוק בתוך bioreactor כדי להבטיח שאין דליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות 8 x10 6 SMCs (על אחת ומחוברות T75) ב 1.25ml של בינוניים זרע על כל scafffold PGA. ודא ההשעיה התא כבר אחיד טפטף על צומת-PGA רשת דקרון, כמו גם על הצד התחתון של PGA רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב שפת bioreactor עם אלכוהול לנגב באמצעות סיבוב bioreactor לצדדים להימנע מרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה סיליקון פקק ההרכבה (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל שקית החיטוי חזרה בזהירות, כדי לוודא שלא לחשוף את החלק התחתון של המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נמל הזרקה אל צינורית האכלה על המחבר הגברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף PTFE 0.20 מסננים מיקרומטר אחד משלושת נמלי האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהרו שלא לחשוף / לגעת בתחתית המכסה תוך כדי התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm הנמל ההזרקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מכסה פקק סיליקון לתוך bioreactor זכוכית לוודא כי צינור האכלה בתוך bioreactor לא לגעת PGA פיגומים seeded. Parafilm מסביב למכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום bioreactor עם מערכת הזרימה בתוך האינקובטור (על צידו) וסובב את bioreactor כל 5 דקות במשך 25-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את תא bioreactor עם 400ml התקשורת 4-10 התרבות שלנו כפי שמתואר (טבלה 1). בינוני זה תרבות &quot;אופטימיזציה&quot; של העורקים חזירי מהונדסים. </li></ol> 6. יום 6-7: הפעלת המשאבה, ועל האכלה ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הפיגומים seeded סטטי ללא pulsatile כל שאיבה דרך צינור סיליקון עבור 6-7 ימים. אין צורך בשינוי בינוני או תוספי ויטמין C במהלך תקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאין דליפה של PBS או מסתלסל של צינורות מערכת הזרימה לפני הפעלת המשאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה של מערכת הזרימה ולוודא להתאים להגדרה המשאבה, כך הלחץ קורא 270/-30mmHg כ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלחצים שיא יומי בכל תרבות לשמר את הלחץ על 270/-30mmHg. מתמר לחץ יכול להיות מחובר למחשב כדי לקרוא לפקח על לחץ. </li></ol> ראשית האכלה <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב הזרקת הנמל &amp; PTFE לסנן על האכלה מכסים לשינוי הן המדיום למטרות בזבוז בינוני deposal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את צינור ההאכלה בתוקף על המשאבה ולהכניס קצה אחד האכלה נמל bioreactor ואת הקצה השני מכסה האכלה. הקפד לנגב את יציאות הזרקה עם מגבונים אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משאבה כפול כיוונית Masterflex לשאוב מתוך 200 מ&quot;ל של מדיום. ואז להשתמש צינור האכלה חדש לשאוב 200 מ&quot;ל של מדיום חדש בחזרה bioreactor. תמיד להתחיל עם מהירות איטית מאוד, במיוחד כאשר שאיבה בחזרה בינוני עד bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית אסקורבית תוספת 2x/week חומצה. כדי להוסיף חומצה אסקורבית, להשתמש מזרק 30 מ&quot;ל להוציא 25ml של המדיום ולמקם אותו בצד בשכונה רקמות. להמיס 25 מ&quot;ג של חומצה אסקורבית ב 5 מ&quot;ל של PBS ולסנן אותה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. ראשית להזריק חומצה אסקורבית סטרילי לתוך צינור האכלה ולהוסיף גב בינוני 25ml הוציאו קודם לכן. המתכון בינוני ניתנת בטבלה 1. </li></ol> 7. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. צינורות ומחברים להרכבה מערכת זרימת מוצגת לעיל. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. פקק סיליקון הרכבה המכסה מוצגת לעיל. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. שרטוטים של ההרכבה bioreactor מוצגים לעיל. בתוך האזיקים דקרון bioreactor מהודקים אל זרועות זכוכית עם קשרים תפר כחול. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. מערכת זרימה מחוברים צינורות bioreactor מוצגת לעיל. L/S18 צינורות יהיה נשאבים על ידי משאבה Masterflex ובכך המניע את הזרימה. מתמר הלחץ יהיה למדוד את הלחץ לפני הכניסה bioreactor על הזרם העליון. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. תמונה של כלי הנדסה שנקטפו. כלי הנדסי ייראה אטום ולהשיג עובי דופן של כ 250μm אחרי התרבות 8 שבועות בתנאים pulsatile. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. Haematoxylin ו Eosin מוכתם חתכים של כלי הנדסה. A ו-B הם 8 שבועות לא פעמו וכלי פעמו, בהתאמה.C ו-D-4 שבוע כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. L מציין את הצד luminal הכלים. שורת קשקשים הוא 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="איור 7"/> איור 7. כתמים של Trichrome מאסון עבור קולגן (כחול) עבור חתכים של כלי הנדסה. A ו-B הם 8 שבועות כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. C ו-D-4 שבוע כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. שים לב כלי 4 שבועות פעמו מראה קולגן יותר ממקבילו שאינו פעמו. החצים הלבנים הצבע שנותרו שברי PGA ב הכלים. שורת קשקשים הוא 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="איור 8"/> איור 8. מכתים Immunochemistry של סמנים SMC בעורקים מהונדסים שור. שריר חלק α-אקטין, calponin-1, וחלק שרירים שרירן שרשרת כבדה (SMMHC) הם מוקדם, ביניים, ומאוחר סמנים כויץ SMC, בהתאמה. עד סוף שנת התרבות של 12 שבועות, התאים כלי הקיר להביע SM-α אקטין כמויות מתונות של Calponin-1 ו SMMHC. שורת קשקשים הוא 20μm. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> DMEM (DME / נמוך שונה) </td><td> 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> FBS (העובר שור נסיוב) חום מומת </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES 1.0 M </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ויטמין C (מומס PBS או DMEM) </td><td> 25 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> פרולין / גליצין / אלאנין 25 mg/25 mg/10 מ&quot;ג (מומס 5 מ&quot;ל של PBS) </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> CuSO 4 1.5 מיקרוגרם (מומס in1 מ&quot;ל PBS) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> פניצילין G ב 10,000 יחידות / מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> PDGF-BB (טסיות הנגזרות גורם הגדילה-BB) בשעה 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (גורם בסיסי הצמיחה פיברובלסטים) בשעה 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> טבלה 1. רכיבים של המדיום &quot;4-10&quot; מוצגים בטבלה לעיל. למעט PDGF-BB ו bFGF, כל הרכיבים האחרים הם להיות מסונן דרך מסנן 0.2μm לפני השימוש.

<ol>
	<li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis.">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li><li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion.">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li><li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+porcine+arteries:+Effects+of+scaffold+modification.">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li><li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts.">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li><li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries.">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li><li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valent&#237;n, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors,+Intravital+Imaging,+and+Biomechanical+Modeling.">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li><li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li><li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs.">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+engineered+from+human+cells.">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li><li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

איכות כלי מהונדסים הוא חלק גדול מוכתבת על ידי איכות של SMCs שימוש בתרבית רקמה. היבטים קריטיים של פנוטיפ SMC כוללים מורפולוגיה כויץ, מספר מעבר נמוך, ואת היכולת להתרבות בתוך bioreactor. אנו ממליצים על מספר למעבר להיות לא יותר מ P3 בזמן זריעת תאים על גבי פיגום פולימרי. יתר על כן, חש?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / חומרים </th><th> ספק </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> FBS (עוברית שור סרום) חום מומת </td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-בסיסי </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td> סיגמא </td><td> PENNA </td></tr><tr><td> (II) נחושת סולפט </td><td> סיגמא </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> סיגמא </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-אלאנין </td><td> סיגמא </td><td> A7469-25 גרם </td></tr><tr><td> L-פרולין </td><td> סיגמא </td><td> P5607-25 גרם </td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא </td><td> A4544-25 גרם </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H3375-100 גרם </td></tr><tr><td> סיליקון מעצור </td><td> קול, בן הזוג </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex צינורות L / S </td><td> קול, בן הזוג </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex משאבה </td><td> קול, בן הזוג </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> דקרון השרוול </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA הרגיש </td><td> קונקורדיה </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1.5 מטרי Surgipro השני תפר </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0.7 Dexon מטרי תפר </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE מסננים </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> שלושה Way Stop-הזין </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> לחץ מתמר </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV שקיות </td><td> בקסטר </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> דילול מלוחים להגדיר </td><td> חץ </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> צינורות סיליקון </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

מאמץ רב הוקדשה להתפתח ולהתקדם את המתודולוגיה להתחדש פונקציונלי בקוטר קטן עורקים עוקף. בסביבה פיזיולוגיים, הן גירוי מכני כימי נדרשים לשמור על פיתוח פונקציונליות נכונה של 1,2 כלי העורקים. מערכות bioreactor תרבות שפותחה על ידי הקבוצה שלנו נועדו לתמוך התחדשות כלי בתוך סביבה הכימותרפיה מכני מבוקר דווקא מחקה כי כלי הילידים. הרכבה bioreactor שלנו ונהלים תחזוקה הם פשוטים למדי הדיר מאוד 3,4. לתאי שריר חלק (SMCs) הם זורעים על חומצה polyglycolic רשת צינורי (PGA) כי הוא מושחל על צינורות סיליקון תואם תרבותי bioreactor עם או בלי גירוי pulsatile עד 12 שבועות. ישנם ארבעה מאפיינים עיקריים המבדילים bioreactor שלנו כמה מקודמיו. 1) בניגוד למערכות אחרות, כי תרבות לדמות רק ביוכימיים המקיף של כלי דם מקומיים, bioreactor שלנו גם יוצר סביבה pulsatile פיזיולוגיים ידי יישום זן רדיאלי מחזורית לכלי בתרבות. 2) כלי מהונדסים מרובים יכול להיות מתורבת בו זמנית בתנאים מכניים שונים בסביבה כימית מבוקרת. 3) bioreactor מאפשר שכבה מונו של בתאי האנדותל (EC) להיות מצופה בקלות על הצד luminal כלי מהונדסים עבור מודלים השתלה מהחי. 4) bioreactor שלנו יכולים גם כלי תרבות מהונדסים עם גודל קוטר שונה נע בין 1 מ&quot;מ עד 3 מ&quot;מ, שמירת מאמץ כדי להתאים לכל bioreactor הפרט להתאים גודל קוטר מסוים. כלי הנדסה בתרבית bioreactor שלנו להידמות כלי הדם יליד בהיסטולוגיה במידה מסוימת. התאים בדפנות כלי להביע בוגרת סמנים SMC כגון התכווצות שרירים שרשרת חלקה שרירן כבד (SMMHC) 3. כמות ניכרת של קולגן מופקד בתוך המטריצה ​​תאיים, אשר אחראי על חוזק מכני האולטימטיבי של כלי הנדסה 5. אנליזה ביוכימית גם מציין כי תוכן קולגן של כלי הנדסה דומה לזו של העורקים יליד 6. חשוב לציין כי bioreactor pulsatile יש כלי מחדש באופן עקבי כי התערוכה תכונות מכאניות המאפשרות השתלת ניסויים מוצלחים בבעלי חיים 3,7. בנוסף, bioreactor זה יכול להיות שונה יותר, כדי לאפשר בזמן אמת הערכה ומעקב של שיפוץ קולגן לאורך זמן, הלא פולשני, באמצעות מיקרוסקופ אופטי שאינו ליניארי (NLOM) 8. לסיכום, bioreactor זה אמור לשמש פלטפורמה מצוינת ללמוד את המנגנונים הבסיסיים המווסתים את התחדשות של בקוטר קטן שתלי תפקודי כלי הדם.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor at JoVE.com

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.0K Views.  Yale University. הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.

Video: Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

טכניקה כירורגית להשתלה של רקמות שתלי כלי דם מהונדסים ולאחר<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials induce an inflammatory response upon implantation, which is the driver of subsequent resorption of the material and the regeneration of new tissue. This strategy, also known as in situ tissue engineering, is pursued to obtain cardiovascular replacements such as tissue-engineered vascular grafts. Both the inflammatory and the regenerative processes are determined by the local biomechanical cues on the scaffold (i.e., stretch and shear stress). Here, we describe in detail the use of a custom-developed bioreactor that uniquely enables the decoupling of stretch and shear stress on a tubular scaffold. This allows for the systematic and standardized evaluation of the inflammatory and regenerative capacity of tubular scaffolds under the influence of well-controlled mechanical loads, which we demonstrate on the basis of a dynamic co-culture experiment using human macrophages and myofibroblasts. The key practical steps in this approach&#8212;the construction and setting up of the bioreactor, preparation of the scaffolds and cell seeding, application and maintenance of stretch and shear flow, and sample harvesting for analysis&#8212;are discussed in detail.

The goal of this protocol is to execute a dynamic co-culture of human macrophages and myofibroblasts in tubular electrospun scaffolds to investigate material-driven tissue regeneration, using a bioreactor which enables the decoupling of shear stress and cyclic stretch.

ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

Engineering

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Scaling של שתלי כלי דם שהונדס בשיטות מדריכי 3D מודפס ואת שיטת נחת הטבעת

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

ביוריאקטור חדשני מודפס בתלת-ממד לתרבית Ex Vivo של כלי דם בזילוח

Ex Vivo Perfusion Culture of Large Blood Vessels in a 3D Printed Bioreactor

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious surgical and pharmacological interventions to prevent and treat vascular disease are urgently needed. In part, the shortage of translational models limits the understanding of the cellular and molecular processes involved in vascular disease. Ex vivo perfusion culture bioreactors provide an ideal platform for the study of large animal vessels (including humans) in a controlled dynamic environment, combining the ease of in vitro culture and the complexity of the live tissue. Most bioreactors are, however, custom manufactured and therefore difficult to adopt, limiting the reproducibility of the results. This paper presents a 3D printed system that can be easily produced and applied in any biological lab, and provides a detailed protocol for its setup, enabling users&#39; operation. This innovative and reproducible ex vivo perfusion culture system enables the culture of blood vessels for up to 7 days in physiological conditions. We expect that adopting a standardized perfusion bioreactor will support a better understanding of physiological and pathological processes in large animal blood vessels and accelerate the discovery of new therapeutics.

מחבר זרקור: EasyFlow - ביוריאקטור זילוח חסכוני וניתן להתאמה לתרבית כלי דם גדולים 

This protocol presents the setup and operation of a newly developed, 3D printed bioreactor for the ex vivo culture of blood vessels in perfusion. The system is designed to be easily adopted by other users, practical, affordable, and adaptable to different experimental applications, such as basic biology and pharmacological studies.

אקס ויוו תרבית זילוח של כלי דם גדולים בביוריאקטור מודפס בתלת-ממד

Vascular disease forms the basis of most cardiovascular diseases (CVDs), which remain the primary cause of mortality and morbidity worldwide. Efficacious ...

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video