עבודה זו ממומנת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט EB-R01 ו R01 008,836 HL083895 (הן LEN). אנחנו יכולים להודות דריל סמית&#39;, נפח הזכוכית אוניברסיטת לביצוע bioreactors למחקר שלנו.

דוד לחץ להרכיב את צינור החיטוי של מערכת הזרימה ורכיבים bioreactor (bioreactor עצמו את המכסה פקק סיליקון) הורה כמו באיור 1 ואיור 2. צינור האכלה יש מחבר זכר בצד אחד וסוף לפתוח בצד השני. שלושה קטעים קצרים צינורות מוכנסים דרך כובע סיליקון לחילופי הגזים. 1. תפירה PGA Mesh <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור PGA רשת אל 1.1cm x ~ גיליון 8cm (תלוי בגודל bioreactor). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות סיליקון נקי (קוטר פנימי 3mm) עם מים מזוקקים (dH20) ואוויר יבש לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 6.0 תפר Dexon לתפור PGA רשת סביב צינור סיליקון נקי מתחיל עם שלושה קשרים כירורגי ואחריו תפרים יחיד. </li></ol> 2. PGA פיגומים טיפול פני השטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים PGA פיגומים ב 1M NaOH עבור 1-2min ולהקליט את זמן הטיפול ולהשתמש באותו הזמן עבור כל פיגומים PGA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף PGA פיגומים באמבטיות dH2O 2 דקות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פט PGA פיגומים יבש עם מטבל Kimwipes בין כל DH 2 אמבטיות O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש PGA פיגומים מתחת למכסה המנוע בתרבית רקמה לייבוש באוויר במשך 15 דקות עם מפוח על. </li></ol> 3. דקרון נשק תפירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תפר Prolene 4.0 לתפור חתיכות קטנות של האזיקים דקרון (1cm) על צד של הרשת PGA עם חפיפה של 2-3mm. הערה: להיזהר לא לנקב בצינור סיליקון (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תפר אותו לתפור שלושה תפרים סביב הקצה החופשי של האזיקים דקרון. הקפד להשאיר מספיק התפרים בקצוות ללא תפר Prolene לצעד 5.1 (איור 3). </li></ol> 4. האסיפה של bioreactor (יום לפני תחילתה של תרבות bioreactor) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים רשת תפור צינורות סיליקון, מכשירי ניתוח, ואת חוט דק באמבטיה אתנול 70% עבור 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את שקיות החיטוי המכיל את bioreactor ו להטביע אותו באמבטיה אתנול 70% לפחות 30 דקות לפני הרכבת. הקפידו לשטוף את bioreactor ביסודיות עם אתנול. חשיפה של כל הרכיבים bioreactor אתנול 70% הוא צעד נוסף עיקור. צעד זה גם מסיר רעלן פנימי, אשר לא הוסר על ידי מעוקר והיא מזיקה לתאי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך צינורות סיליקון דרך הצד נשק באמצעות תיל דק למשוך את זה עד הסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח bioreactor מתוך האמבטיה אתנול (לשמור על רשת שקוע אתנול). תקן הפיגום PGA בתוך bioreactor על ידי הידוק האזיקים דקרון על השפתיים זכוכית מתרחבים על ידי הידוק וקשירת את התפרים Prolene (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צד אחד של נשק בצד bioreactor למחברים דרך צינורות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך הצד השני של צינורות סיליקון עם מתח מספיק להכניס את שאר שני מחברי לתוך צינורות סיליקון. תחזיקי צינורות סיליקון בחוזקה בעת הוספת מחברים! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחדש bioreactor לאמבטיה לשטוף עם אתנול אתנול על ידי משיכתו בעדינות מחברים מתוך הנשק בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פליפ bioreactor מעל ולאפשר להשרות למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bioreactor פליפ בצד ימין למעלה להשרות במשך 10 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את כל אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת שלוש מנות גדולות פטרי (10 ס&quot;מ) בסדרה ו bioreactor מקום בצלחת מרכז להחזיק אתנול עודף נטף הקצוות של הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש bioreactor ו PGA רשת עם מים רקמות התרבות באמצעות פיפטה 5 מ&quot;ל או 10 מ&quot;ל. גם רקמת סומק התרבות מים לתוך צינור סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לנקז את כל המים העודפים לתוך בצלחות פטרי משני צדי bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bioreactor יבש לילה ברדס עם מפוח ולכבות UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערות נוספות: לוודא בר ומערבבים סטרילי הוא bioreactor. הקפד לא &quot;לרחף&quot; מעל bioreactor מרגע זה והלאה, כדי למנוע זיהום. חותכים את שפע של רצועות parafilm ולספוג אותם באמבטיה קטנה אתנול 70% (גדול צלחת פטרי עובד היטב). </li></ol> 5. יום 1: הגדרת bioreactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי סטרילית על פתיחת bioreactor כל להגן על פיגום בתוך PGA של מזהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מערכת זרימת bioreactor כמצוין באיור 4 ו parafilm כל המפרקים חיבור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו מחברי הראשון עם מגבונים אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נמל זריקה בזרוע, השלישי בשימוש של bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות סוס ים ועניבה מקצה הכחול של דילול מלוחים כמפורט קרוב לצומת-Y האפשרי. משוך מהדק הצינור במקום כדי להבטיח שאין להעביר נוזל לחלק זה של הצינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את שקית העירוי, &amp; לצרף צינורות סוס ים (אדום) אל הקצה המרוחק של שקית העירוי. הקפד לנגב נמל הכניסה עם אלכוהול לנגב הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף סוס ים בצד אחד של מערכת זרימה (דרך צינור סוף לבן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 3 כיווני שסתום לתוך מערכת הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מתמר הלחץ &amp; להתחבר שסתום משולשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הקצה השני של מתמר לחץ לפתיחת באמצע בתיק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחברbioreactor למערכת לזרום דרך צומת ה-Y. השתמש במזרק 60ml להוסיף 350ml של 1% fungizone (5 מ&quot;ל לערבב עם fungizone 495ml של PBS) כדי שקית העירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסחוט שקית העירוי כדי לשטוף את המערכת זורם על ידי התאמת זין לעצור כדי לאפשר זרימה של PBS. הערה: לבדוק בתוך bioreactor כדי להבטיח שאין דליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות 8 x10 6 SMCs (על אחת ומחוברות T75) ב 1.25ml של בינוניים זרע על כל scafffold PGA. ודא ההשעיה התא כבר אחיד טפטף על צומת-PGA רשת דקרון, כמו גם על הצד התחתון של PGA רשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב שפת bioreactor עם אלכוהול לנגב באמצעות סיבוב bioreactor לצדדים להימנע מרחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה סיליקון פקק ההרכבה (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל שקית החיטוי חזרה בזהירות, כדי לוודא שלא לחשוף את החלק התחתון של המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נמל הזרקה אל צינורית האכלה על המחבר הגברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף PTFE 0.20 מסננים מיקרומטר אחד משלושת נמלי האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהרו שלא לחשוף / לגעת בתחתית המכסה תוך כדי התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Parafilm הנמל ההזרקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מכסה פקק סיליקון לתוך bioreactor זכוכית לוודא כי צינור האכלה בתוך bioreactor לא לגעת PGA פיגומים seeded. Parafilm מסביב למכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום bioreactor עם מערכת הזרימה בתוך האינקובטור (על צידו) וסובב את bioreactor כל 5 דקות במשך 25-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את תא bioreactor עם 400ml התקשורת 4-10 התרבות שלנו כפי שמתואר (טבלה 1). בינוני זה תרבות &quot;אופטימיזציה&quot; של העורקים חזירי מהונדסים. </li></ol> 6. יום 6-7: הפעלת המשאבה, ועל האכלה ראשון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הפיגומים seeded סטטי ללא pulsatile כל שאיבה דרך צינור סיליקון עבור 6-7 ימים. אין צורך בשינוי בינוני או תוספי ויטמין C במהלך תקופה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאין דליפה של PBS או מסתלסל של צינורות מערכת הזרימה לפני הפעלת המשאבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה של מערכת הזרימה ולוודא להתאים להגדרה המשאבה, כך הלחץ קורא 270/-30mmHg כ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלחצים שיא יומי בכל תרבות לשמר את הלחץ על 270/-30mmHg. מתמר לחץ יכול להיות מחובר למחשב כדי לקרוא לפקח על לחץ. </li></ol> ראשית האכלה <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב הזרקת הנמל &amp; PTFE לסנן על האכלה מכסים לשינוי הן המדיום למטרות בזבוז בינוני deposal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את צינור ההאכלה בתוקף על המשאבה ולהכניס קצה אחד האכלה נמל bioreactor ואת הקצה השני מכסה האכלה. הקפד לנגב את יציאות הזרקה עם מגבונים אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משאבה כפול כיוונית Masterflex לשאוב מתוך 200 מ&quot;ל של מדיום. ואז להשתמש צינור האכלה חדש לשאוב 200 מ&quot;ל של מדיום חדש בחזרה bioreactor. תמיד להתחיל עם מהירות איטית מאוד, במיוחד כאשר שאיבה בחזרה בינוני עד bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית אסקורבית תוספת 2x/week חומצה. כדי להוסיף חומצה אסקורבית, להשתמש מזרק 30 מ&quot;ל להוציא 25ml של המדיום ולמקם אותו בצד בשכונה רקמות. להמיס 25 מ&quot;ג של חומצה אסקורבית ב 5 מ&quot;ל של PBS ולסנן אותה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. ראשית להזריק חומצה אסקורבית סטרילי לתוך צינור האכלה ולהוסיף גב בינוני 25ml הוציאו קודם לכן. המתכון בינוני ניתנת בטבלה 1. </li></ol> 7. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. צינורות ומחברים להרכבה מערכת זרימת מוצגת לעיל. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. פקק סיליקון הרכבה המכסה מוצגת לעיל. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. שרטוטים של ההרכבה bioreactor מוצגים לעיל. בתוך האזיקים דקרון bioreactor מהודקים אל זרועות זכוכית עם קשרים תפר כחול. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. מערכת זרימה מחוברים צינורות bioreactor מוצגת לעיל. L/S18 צינורות יהיה נשאבים על ידי משאבה Masterflex ובכך המניע את הזרימה. מתמר הלחץ יהיה למדוד את הלחץ לפני הכניסה bioreactor על הזרם העליון. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. תמונה של כלי הנדסה שנקטפו. כלי הנדסי ייראה אטום ולהשיג עובי דופן של כ 250μm אחרי התרבות 8 שבועות בתנאים pulsatile. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. Haematoxylin ו Eosin מוכתם חתכים של כלי הנדסה. A ו-B הם 8 שבועות לא פעמו וכלי פעמו, בהתאמה.C ו-D-4 שבוע כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. L מציין את הצד luminal הכלים. שורת קשקשים הוא 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="איור 7"/> איור 7. כתמים של Trichrome מאסון עבור קולגן (כחול) עבור חתכים של כלי הנדסה. A ו-B הם 8 שבועות כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. C ו-D-4 שבוע כלי שאינו פעמו פעמו, בהתאמה. שים לב כלי 4 שבועות פעמו מראה קולגן יותר ממקבילו שאינו פעמו. החצים הלבנים הצבע שנותרו שברי PGA ב הכלים. שורת קשקשים הוא 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="איור 8"/> איור 8. מכתים Immunochemistry של סמנים SMC בעורקים מהונדסים שור. שריר חלק α-אקטין, calponin-1, וחלק שרירים שרירן שרשרת כבדה (SMMHC) הם מוקדם, ביניים, ומאוחר סמנים כויץ SMC, בהתאמה. עד סוף שנת התרבות של 12 שבועות, התאים כלי הקיר להביע SM-α אקטין כמויות מתונות של Calponin-1 ו SMMHC. שורת קשקשים הוא 20μm. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> DMEM (DME / נמוך שונה) </td><td> 500 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> FBS (העובר שור נסיוב) חום מומת </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES 1.0 M </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ויטמין C (מומס PBS או DMEM) </td><td> 25 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> פרולין / גליצין / אלאנין 25 mg/25 mg/10 מ&quot;ג (מומס 5 מ&quot;ל של PBS) </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> CuSO 4 1.5 מיקרוגרם (מומס in1 מ&quot;ל PBS) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> פניצילין G ב 10,000 יחידות / מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> PDGF-BB (טסיות הנגזרות גורם הגדילה-BB) בשעה 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> bFGF (גורם בסיסי הצמיחה פיברובלסטים) בשעה 10ng/ml </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> טבלה 1. רכיבים של המדיום &quot;4-10&quot; מוצגים בטבלה לעיל. למעט PDGF-BB ו bFGF, כל הרכיבים האחרים הם להיות מסונן דרך מסנן 0.2μm לפני השימוש.

<ol>
	<li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis.">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li><li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion.">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li><li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+porcine+arteries:+Effects+of+scaffold+modification.">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li><li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts.">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li><li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries.">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li><li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valent&#237;n, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors,+Intravital+Imaging,+and+Biomechanical+Modeling.">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li><li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li><li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs.">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+engineered+from+human+cells.">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li><li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

איכות כלי מהונדסים הוא חלק גדול מוכתבת על ידי איכות של SMCs שימוש בתרבית רקמה. היבטים קריטיים של פנוטיפ SMC כוללים מורפולוגיה כויץ, מספר מעבר נמוך, ואת היכולת להתרבות בתוך bioreactor. אנו ממליצים על מספר למעבר להיות לא יותר מ P3 בזמן זריעת תאים על גבי פיגום פולימרי. יתר על כן, חש?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / חומרים </th><th> ספק </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> FBS (עוברית שור סרום) חום מומת </td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-בסיסי </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td> סיגמא </td><td> PENNA </td></tr><tr><td> (II) נחושת סולפט </td><td> סיגמא </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> סיגמא </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-אלאנין </td><td> סיגמא </td><td> A7469-25 גרם </td></tr><tr><td> L-פרולין </td><td> סיגמא </td><td> P5607-25 גרם </td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא </td><td> A4544-25 גרם </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H3375-100 גרם </td></tr><tr><td> סיליקון מעצור </td><td> קול, בן הזוג </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex צינורות L / S </td><td> קול, בן הזוג </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex משאבה </td><td> קול, בן הזוג </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> דקרון השרוול </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA הרגיש </td><td> קונקורדיה </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1.5 מטרי Surgipro השני תפר </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0.7 Dexon מטרי תפר </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE מסננים </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> שלושה Way Stop-הזין </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> לחץ מתמר </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV שקיות </td><td> בקסטר </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> דילול מלוחים להגדיר </td><td> חץ </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> צינורות סיליקון </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

מאמץ רב הוקדשה להתפתח ולהתקדם את המתודולוגיה להתחדש פונקציונלי בקוטר קטן עורקים עוקף. בסביבה פיזיולוגיים, הן גירוי מכני כימי נדרשים לשמור על פיתוח פונקציונליות נכונה של 1,2 כלי העורקים. מערכות bioreactor תרבות שפותחה על ידי הקבוצה שלנו נועדו לתמוך התחדשות כלי בתוך סביבה הכימותרפיה מכני מבוקר דווקא מחקה כי כלי הילידים. הרכבה bioreactor שלנו ונהלים תחזוקה הם פשוטים למדי הדיר מאוד 3,4. לתאי שריר חלק (SMCs) הם זורעים על חומצה polyglycolic רשת צינורי (PGA) כי הוא מושחל על צינורות סיליקון תואם תרבותי bioreactor עם או בלי גירוי pulsatile עד 12 שבועות. ישנם ארבעה מאפיינים עיקריים המבדילים bioreactor שלנו כמה מקודמיו. 1) בניגוד למערכות אחרות, כי תרבות לדמות רק ביוכימיים המקיף של כלי דם מקומיים, bioreactor שלנו גם יוצר סביבה pulsatile פיזיולוגיים ידי יישום זן רדיאלי מחזורית לכלי בתרבות. 2) כלי מהונדסים מרובים יכול להיות מתורבת בו זמנית בתנאים מכניים שונים בסביבה כימית מבוקרת. 3) bioreactor מאפשר שכבה מונו של בתאי האנדותל (EC) להיות מצופה בקלות על הצד luminal כלי מהונדסים עבור מודלים השתלה מהחי. 4) bioreactor שלנו יכולים גם כלי תרבות מהונדסים עם גודל קוטר שונה נע בין 1 מ&quot;מ עד 3 מ&quot;מ, שמירת מאמץ כדי להתאים לכל bioreactor הפרט להתאים גודל קוטר מסוים. כלי הנדסה בתרבית bioreactor שלנו להידמות כלי הדם יליד בהיסטולוגיה במידה מסוימת. התאים בדפנות כלי להביע בוגרת סמנים SMC כגון התכווצות שרירים שרשרת חלקה שרירן כבד (SMMHC) 3. כמות ניכרת של קולגן מופקד בתוך המטריצה ​​תאיים, אשר אחראי על חוזק מכני האולטימטיבי של כלי הנדסה 5. אנליזה ביוכימית גם מציין כי תוכן קולגן של כלי הנדסה דומה לזו של העורקים יליד 6. חשוב לציין כי bioreactor pulsatile יש כלי מחדש באופן עקבי כי התערוכה תכונות מכאניות המאפשרות השתלת ניסויים מוצלחים בבעלי חיים 3,7. בנוסף, bioreactor זה יכול להיות שונה יותר, כדי לאפשר בזמן אמת הערכה ומעקב של שיפוץ קולגן לאורך זמן, הלא פולשני, באמצעות מיקרוסקופ אופטי שאינו ליניארי (NLOM) 8. לסיכום, bioreactor זה אמור לשמש פלטפורמה מצוינת ללמוד את המנגנונים הבסיסיים המווסתים את התחדשות של בקוטר קטן שתלי תפקודי כלי הדם.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor at JoVE.com

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.9K Views.  Yale University. הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.

Video: Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

מבצע של Bioreactor Benchtop

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

טכניקה כירורגית להשתלה של רקמות שתלי כלי דם מהונדסים ולאחר<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Bioreactor רומן לטיפוח צפיפות גבוה של קהילות חיידקים מגוונות

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.