この作品は、健康グラントR01 EB - 008836とR01 HL083895（LENの両方）の国民の協会によって資金を供給される。我々は研究のためのバイオリアクターを作るためにダリルスミス、大学のガラス吹き工を、感謝することができます。

オートクレーブ図1及び図2に指示フローシステムとバイオリアクターの成分（バイオリアクター自体とシリコンストッパーの蓋）のためのチューブを組み立て、オートクレーブ。栄養チューブは、一端にオスコネクタと反対側の開放端を持っています。 3つのショートチューブセグメントはガス交換のためのシリコンキャップを通して挿入されています。 1。縫製PGAメッシュ<ol><li> 1.1センチメートルX〜8cmのシート（バイオリアクターのサイズに依存）にPGAメッシュを切る。 </li><li>蒸留水（・ Alarm_D）および使用する前に、乾いた空気ときれいなシリコンチューブ（3ミリメートル内径）。 </li><li>シングルステッチに続く3つの手術のノット​​で始まるクリーンなシリコンチューブの周りにPGAメッシュを縫うためにDexon 6.0縫合糸を使用してください。 </li></ol> 2。 PGA足場表面処理<ol><li> 1 - 2分、処理時間を記録し、すべてのPGA足場に同じ時間を使うための1MのNaOHのディップPGA足場。 </li><li> 2分間3回dH2O風呂でPGA足場をすすぐ。 </li><li>パットPGAはのdH 2 Oバスの各ディップの間にキムワイプで乾燥した足場。 </li><li>組織培養フードの下で乾燥したPGAは、足場上に送風機で15分間風乾する。 </li></ol> 3。ミシンダクロンアーム<ol><li> 2〜3ミリメートルのオーバーラップのPGAメッシュの各端にダクロンの袖口（1CM）の小片を縫うためにProlene 4.0の縫合糸を使用してください。注：ない穿刺のシリコンチューブ（図3）に注意してください。 </li><li>ダクロンの袖口の自由端3周ステッチを縫うために、同じ糸を使用してください。ステップ5.1のProlene縫合（図3）の自由端で十分な縫合糸を残していることを確認します。 </li></ol> 4。バイオリアクターのアセンブリ（バイオリアクターの培養開始前日） <ol><li>縫製メッシュとシリコンチューブ、手術器具、20〜30分間70％エタノール浴中の細い線を浸す。 </li><li>前の組み立てに少なくとも30分間70％エタノール浴中のバイオリアクターと浸し、それを含むオートクレーブ袋を開きます。エタノールで徹底的にバイオリアクターをフラッシュすることを確認してください。 70％エタノールへのすべてのバイオリアクターのコンポーネントの曝露は、加算の滅菌工程です。このステップでは、オートクレーブで除去されていないエンドトキシンを、削除して、血管細胞に有害です。 </li><li>それを介してプルに細いワイヤーを使用して、サイ​​ドのアームを介してシリコンチューブを引き出します。 </li><li> （エタノールに浸けメッシュを保つ）エタノール浴からバイオリアクターを取る。 Prolene縫合（図3）締めと上下連結して、フレアガラスの唇上のダクロンの袖口を締め込んで、バイオリアクター内のPGA足場を修正。 </li><li>シリコンチューブを介してコネクタにバイオリアクターのサイドアームの片側を接続します。 </li><li>十分なテンションでシリコンチューブの反対側を引っ張るとシリコンチューブに残りの二つのコネクタを挿入します。コネクタを挿入するときにしっかりとシリコンチューブにホールド！ </li><li>再び挿入のエタノール浴にバイオリアクターと静かにサイドアームのコネクタを引き抜き、エタノールで洗い流してください。 </li><li>バイオリアクターを裏返し、10分間浸すことができます。 </li><li>フリップバイオリアクターは、右サイドアップしてさらに10分間浸す。 </li><li>すべてのエタノールを排出します。 </li><li>チューブの端部から滴下過剰のエタノールを保持するために中央の皿の中でシリーズと場所バイオリアクターに3つの大きなペトリ皿を（10cm）に設定します。 </li><li> 5ミリリットルまたは10mlのピペットを用いて組織培養水をバイオリアクターとPGAメッシュをフラッシュします。シリコンチューブにもフラッシュの組織培養水。 </li><li>徹底的にバイオリアクターのいずれかの側にペトリ皿にすべての余分な水を抜く。 </li><li>上に送風機付きフードとUVのOFFで一晩乾燥したバイオリアクター。 </li><li>追加メモ：滅菌攪拌棒がバイオリアクターになっていることを確認。汚染を避けるために、前方にこの点から、バイオリアクターの上に&quot;置く&quot;にしないようにしてください。パラフィルムのストリップの多くをカットし、小70％エタノールのバス（大型のペトリ皿がうまくいく）でそれらを浸す。 </li></ol> 5。 1日目：バイオリアクターのセットアップ<ol><li>汚染物質からPGA足場の内側を保護するため、各バイオリアクターの開口部に滅菌ペトリ皿を置きます。 </li><li>図4およびパラフィルム、すべての接続の関節に示すようにバイオリアクターへのフローシステムを組み立てます。 <ol><li>アルコール綿で最初のコネクタを拭きます。 </li><li>バイオリアクターの第三の、未使用の腕に注入口を取り付けます。 </li><li>セイウチのチューブを外し、できるだけY -ジャンクショ​​ンの近くに設定された生理食塩水希釈の青い端を結紮する。チューブのこの部分には液体の転送のないことを確認するために設けられている、チューブクランプを引いて</li><li> IVの袋を取り外し、及びIVの袋の遠端にセイウチのチューブ（赤）を接続します。アルコールが最初にワイプで挿入口を拭くようにしてください。 </li><li>フローシステムの一方の側（白端チューブを介して）にセイウチを取り付けます。 </li><li>フローシステムに3方活栓を挿入します。 </li><li>圧力トランスデューサを取り外します＆三方活栓に接続します。 </li><li>袋の中央の開口部に圧力変換器のもう一方の端を取り付けます。 </li></ol></li><li>接続Y -ジャンクショ​​ンを経由して流れのシステムへのバイオリアクター。 IVの袋に1％fungizone（PBSの495ミリリットルとミックス5ミリリットルのfungizone）の350ミリリットルを追加するには、60ミリリットル注射器を使用してください。 </li><li> PBSの流れを可能にするためにストップコックを調整して流れるシステムをフラッシュするためにIVの袋を絞る。注：そこに漏れていることを確認しないためにバイオリアクターの中身をチェック。 </li><li>各PGA scafffold上に培地と種子の1.25ミリリットルで再懸8 × 10 6平滑筋細胞（約コンフルエントT75）。細胞懸濁液が均一にPGAメッシュの底面側にだけでなく、PGAメッシュダクロンのジャンクショ​​ン上に滴下されていることを確認します。 </li><li>アルコールは、バイオリアクターは、横向きにホバリングを避けるために回転を経由してワイプでバイオリアクターのリムを拭いてください。 </li><li>シリコンストッパーの蓋のアセンブリ（図2） <ol><li>オートクレーブ袋ピールバック慎重に、蓋の底部を露出しないようにして作る。 </li><li>オスコネクタで栄養チューブに注入口を取り付けます。 </li><li> three空気ポートのそれぞれにPTFE 0.20μmのフィルターを取り付けます。 </li><li>このプロセス中に公開する/蓋の底面に触れないように注意してください。 </li><li>パラフィルム注入口。 </li></ol></li><li>ガラスのバイオリアクターにシリコンストッパーの蓋を挿入し、バイオリアクター内の栄養チューブがシードPGAの足場に接触しないことを確認してください。蓋の周りパラフィルム。 </li><li>インキュベーター内部の流れのシステム（その側）とバイオリアクターを配置し、バイオリアクターの25〜30分が5分おきに回転させる。 </li><li>で説明されているように私たちの40から10培養培地の400ミリリットル（表1）とバイオリアクターチャンバーを埋める。この培地は、ブタ工学動脈のために&quot;最適化&quot;されています。 </li></ol> 6。日6-7：ポンプをオンにし、まず食べさせる<ol><li> 6-7日のためのシリコンチューブを介してポンピングどんな拍動することなく、静的に生成済の足場を拡大。この時間の間に培地交換やビタミンCの補充は必要ありません。 </li><li>ポンプの電源を入れる前にPBSまたはフローシステムのチューブのよじれの漏れがないことを確認してください。 </li><li>フローシステムのポンプの電源をオンにし、圧力が約270/-30mmHg読み取るようにポンプの設定を調整することを確認してください。 </li><li>レコード文化を通じて日々プレッシャーと270/-30mmHgの圧力を維持する。圧力トランスデューサーは、圧力を読んで、監視するコンピュータに接続することができます。 </li></ol>最初の給餌<ol start="5"><li>培地交換や培地廃棄物廃位両方の目的のために蓋を餌に注入ポート＆PTFEフィルターを組み立てます。 </li><li>ポンプにしっかりと栄養チューブを置き、餌蓋にバイオリアクターのポート、もう一方の端を供給する一方の端を差し込みます。エタノールのワイプで注入ポートを拭いていることを確認してください。 </li><li>培地の200ミリリットルを汲み出すために双方向のMasterflexポンプを使用してください。その後、バイオリアクターに戻って新鮮な培地の200ミリリットルをポンプするための新しい栄養チューブを使用してください。常にバイオリアクターに戻って培地をポンプ場合は特に、非常に遅い速度で始まります。 </li><li>培地とサプリメントのアスコルビン酸の2x/weekを変更します。アスコルビン酸を追加するには、培地の25ミリリットルを取り出し、組織のボンネットに置いて置くために30ミリリットル注射器を使用してください。 PBS 5mlのでアスコルビン酸の25mgを溶解し、0.22μmフィルターを通してそれをフィルタリングする。最初の栄養チューブに無菌のアスコルビン酸を注入し、それ以前の取り出し25ミリリットル培地を再度追加します。培地レシピを表1に示されている。 </li></ol> 7。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。フローシステムのアセンブリのためのチューブとコネクタを上に示します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。シリコンストッパーの蓋のアセンブリを上に示します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。バイオリアクターアセンブリの回路図は、上記示されています。バイオリアクターのダクロンの袖口が青縫合の結び目を持つガラスの腕に固定されている内側。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。チューブとバイオリアクターに接続されているフローシステムは、上記の通りです。L/S18チューブがMasterflexポンプで汲み上げ、したがって流れを駆動されます。圧力トランスデューサは、上流でのバイオリアクターに入る前に圧力を測定します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。収穫された人工血管の画像。エンジニア船舶が不透明であることが表示され、拍動性の条件下で8週間の培養後、約250μmの壁の厚さを実現します。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。人工血管のヘマトキシリンおよびエオシン染色したクロスセクションでは、。とBはそれぞれ、容器の8週間の非パルスとパルスです。CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 Lは、血管の内腔側を示している。スケールバーは100μmのです。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="図7"/> 図7。人工血管の断面のためのコラーゲン（青）のためのマッソントリクローム染色。AとBはそれぞれ、8週間の非パルスとパルスの船舶です。 CとDは、4週間非パルスとパルスの船舶、それぞれです。 4週間のパルス船舶がその非パルスのものよりコラーゲンを示していることに注意してください。白い矢印は血管内の残りのPGAのフラグメントを指す。スケールバーは100μmのです。 <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="図8"/> 図8。ウシ人工動脈におけるSMCのマーカーの免疫染色。平滑筋α-アクチン、カルポニン- 1、および平滑筋ミオシン重鎖（SMMHC）はそれぞれ、、初期の中間、そして後半SMC収縮マーカーです。 12週間の文化の終わりまでに、容器内の細胞壁に発現するSMα-アクチンとカルポニン- 1とSMMHCの適量。スケールバーは20μmのです。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 量は </td></tr><tr><td> DMEM（DME /低に変更） </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td> FBS（ウシ胎児血清）熱不活性化</td><td> 100ミリリットル</td></tr><tr><td> HEPES、1.0 M </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ビタミンC（PBSまたはDMEMに溶解） </td><td> 25mgの</td></tr><tr><td>プロリン/グリシン/アラニン25 mg/25 mg/10ミリグラム（PBS 5mlの溶解） </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>のCuSO 4は1.5μg（PBSのIN1 mlを溶解） </td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン10,000台で、G / mlの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 10ng/mlでのPDGF - BB（血小板由来成長因子- BB） </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> 10ng/mlでのbFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子） </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> 表1。 &quot;40〜10&quot;培地の成分は、上記の表に示します。PDGF - BBとbFGFの例外を除き、他のすべてのコンポーネントは使用前に0.2μmのフィルターでろ過することです。

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	<li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis.">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li><li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion.">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li><li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+arteries+grown+in+vitro.">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li><li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+porcine+arteries:+Effects+of+scaffold+modification.">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li><li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts.">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li><li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries.">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li><li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li><li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valent&#237;n, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors,+Intravital+Imaging,+and+Biomechanical+Modeling.">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li><li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li><li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs.">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+engineered+from+human+cells.">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li><li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

人工血管の品質は、組織培養で使用されている平滑筋細胞の品質によって決まる大部分です。 SMC表現型の重要な側面は収縮形態、低継代数、およびバイオリアクターの内部に増殖する能力が含まれています。我々は、継代数がポリマー骨格に細胞播種の時にP3以下であることをお勧めします。また、SMCソースを使用する前にマイコプラズマフリーであることを確認することが重要です。我々?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/材料の名称</th><th>サプライヤー</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> FBS（ウシ胎児血清）熱不活化</td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF -基本</td><td> R＆B </td><td> 234 - FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF - BB </td><td> R＆B </td><td> 520 - BB </td></tr><tr><td> Penicilin G </td><td>シグマ</td><td>ペンナ</td></tr><tr><td>硫酸銅（II） </td><td>シグマ</td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td>シグマ</td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L -アラニン</td><td>シグマ</td><td> A7469 - 25G </td></tr><tr><td> L -プロリン</td><td>シグマ</td><td> P5607 - 25G </td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A4544 - 25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3375 - 100G </td></tr><tr><td>シリコンストッパー</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 06298〜24 </td></tr><tr><td> MasterflexチューブL / S </td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 06508〜16、06508〜18 </td></tr><tr><td> Masterflexポンプ</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 7553〜80 </td></tr><tr><td>ダクロンのカフ</td><td> MAQUET </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGAフェルト</td><td>コンコルディア</td><td> MO000877 - 01 </td></tr><tr><td> 4から0まで1.5メートルSurgipro II縫合</td><td> Syneture </td><td> VP - 557 - X </td></tr><tr><td> 6から0 0.7メトリックDexonの縫合</td><td> Syneture </td><td> 7538〜11 </td></tr><tr><td> 0.22μmのPTFEフィルター</td><td>ワットマン紙</td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td>スリーウェイストップコック</td><td>エドワーズライフサイエンス</td><td> 593WSC </td></tr><tr><td>圧力トランスデューサー</td><td>エドワーズライフサイエンス</td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IVバッグ</td><td>バクスター</td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td>生理食塩水希釈セット</td><td>矢印</td><td> W20030 </td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>サンゴバン</td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

多くの努力は、機能的な小径動脈バイパスを再生成する方法論を開発し、推進することに専念してきました。生理的環境では、両方の機械的および化学的刺激が動脈血管の1,2の適切な開発と機能性を維持することが義務付けられています。 私たちのグループによって開発されたバイオリアクター培養システムは、ネイティブの船のことを模倣する正確に制御された化学機械環境の中で血管の再生をサポートするように設計されています。私たちのバイオリアクターの組み立てとメンテナンスの手順はかなり簡単と3,4 -再現性の高いです。平滑筋細胞（平滑筋細胞）に準拠したシリコンチューブを介してスレッド化と、最大12週間までのために拍動性刺激の有無にかかわらず、バイオリアクターで培養されている管状のポリグリコール酸（PGA）のメッシュに播種されています。いくつかの前任者から私たちのバイオリアクターを区別する4つの主要な属性があります。 1）唯一のネイティブ血管の周囲の生化学をシミュレートする他の培養システムとは異なり、私たちのバイオリアクターは、また文化の容器に循環半径方向ひずみを適用することにより、生理的拍動性の環境を作成します。 2）複数の人工血管は、制御された化学物質の環境内のさまざまな機械的な条件の下で同時に培養することができる。 3）バイオリアクターは、簡単に動物の移植モデルのための人工血管の内腔側上に塗布される内皮細胞の単層（EC）が可能になります。 4）私たちのバイオリアクターは、異なる直径の大きさと文化エンジニアリング船舶は、特定の直径のサイズに合わせて個々のバイオリアクターを調整する手間が省けます、1mmから3mmまでであったができます。 私たちのバイオリアクターで培養した人工血管はある程度組織学的にネイティブの血管に似ている。血管壁の細胞は平滑筋ミオシン重鎖（SMMHC）3のような成熟したSMC収縮マーカーを発現する。コラーゲンはかなりの量の人工血管5の究極の機械的強度を担当する細胞外マトリックス内に堆積される。生化学分析はまた、人工血管のコラーゲン含有量は、ネイティブ動脈6と同等であることを示します。重要なのは、拍動性のバイオリアクターは、一貫して動物モデル3,7で成功した移植実験を許可する機械的性質を示す血管を再生成しています。さらに、このバイオリアクターは、さらに非線形光学顕微鏡（NLOM）8を使用して 、非侵襲的に、時間の経過とともにコラーゲンのリモデリングのリアルタイム評価と追跡を許可するように変更することができます。結論として、このバイオリアクターは、機能的な小口径人工血管の再生を制御する基本的なメカニズムを研究するための優れたプラットフォームとしてご利用ください。

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.9K ビュー.  Yale University. 当社グループは、植込み型小径人工血管を再生成する心臓血管系の生理的拍動性のストレスを模倣したバイオリアクター培養システムを開発しました。

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Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

生物工学

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

ベンチトップリアクターの操作

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

使い捨て空気圧バイオリアクターシステムを使用して、哺乳動物細胞の培養

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

組織工学血管移植片とその後の移植のために手術手技<em&gt;インビボ</em&gt;モニタリング

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

多様な微生物群集の高密度栽培のための新しいバイオリアクター

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Methods Article

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管