Name: generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model at JoVE.com

This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.

לבצע את כל הניסויים בבעלי החיים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בחי מעבדה. 1. הכנת תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תקשורת ותרבות לשורת תאי פיברובלסטים אנושית CCL-153: F-12K בינוני, 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תכנות מחדש מדיה עבור דור PiPSC: בינוני הנשר שונה של Knockout Dulbecco (DMEM) המכיל 20% החלפת סרום Knockout, 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 0.1 מ&quot;מ המינימלי בינוני (MEM) שאינו חיוני חומצות אמינו, 10 ng Essential / בסיסי פיברובלסטים Growth Factor מיליליטר 2 / פניצילין (bFGF-2) ו- 100 מיליליטר U וסטרפטומיצין. להוסיף bFGF-2 טרי בכל פעם לפני השימוש באמצעי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול לעשות בידול מדיה (DM) כדי לעורר תאי שריר חלק (SMC): α-ממ מדיה המכילה 10% FBS, גורם גדילה 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 100 U / ng פניצילין וסטרפטומיצין ו -25 מיליליטר / מיליליטר נגזר טסיות הדם(PDGF-ββ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך האנדותל בידול מדיה (EC-DM) כדי לעורר תאי אנדותל בידול (EC): צמיחת האנדותל תקשורת-2 (EGM-2) מדיה המכילה 50 ng / ml כלי דם האנדותל Growth Factor (VEGF) ו- 100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין. </li></ol> 2. Fibroblasts תכנות מחדש האנושי לתאי גזע pluripotent חלקית מושרים (PiPSC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורת תאי פיברובלסטים אנושית תרבות CCL-153 בצלוחיות מצופים פתרון ג&#39;לטין 0.04% במדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר כל 3 ימים ביחס של 1: 6. השתמש בתאים לפני המעבר 9 ליעילות אופטימלית של דור PiPSC. תאים מוכנים transfection עם הגיע 80 - confluency 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize pCAG2LMKOSimO פלסמיד polycistronic המכיל 4 גורמי תכנות מחדש גורם שעתוק 4 (Oct4) מחייב octamer, Sox2, גורם כמו-Kruppel 4 (KLF4) ו- C-MYC (pCAG-OSKM). לעכל 5 מיקרוגרם של פלסמיד עם 5 יחידות של אנזים הגבלת PvuI במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס. לטהרפלסמיד עם ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect 2 x 10 6 fibroblasts אדם עם 4 מיקרוגרם של פלסמיד pCAG-OSKM לינארית על ידי electroporation עם ערכת פיברובלסטים עור האנושיים nucleofection (NHDF) על פי הפרוטוקול של היצרן. בעדינות תאי זרע transfected על 0.04% בקבוק T25 מראש ג&#39;לטין מצופה המכיל 5 מיליליטר של תכנות מחדש Media מראש חימם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, לשנות בינוני עם תוספים של 25 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין כדי לבחור אוכלוסייה טהורה של תאי transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 4. הערה: fibroblasts אדם הפך PiPSC לאחר 4 ימים של תכנות מחדש. </li></ol> 3. בידול של PiPSC להאנדותל ותאי שריר חלק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PiPSC זרע על מנות מצופים מראש IV קולגן המכילות DM במשך 4 ימים כדי לגרום להתמיינות לSMCs. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PiPSC זרע על קולגן IV ג מנות מצופים מראשontaining אנדותל-DM במשך 6 ימים כדי לגרום להתמיינות לתאי אנדותל. שנה בינונית בכל יום אחר, עד שיום 6. </li></ol> 4. decellularized אב העורקים שתל הכנה הערה: כל הפתרונות והציוד צריכים להיות סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ולתקן את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את עצם החזה וסביב כלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל בית החזה. הסר את הלב, ריאות והוושט כדי לחשוף את אב העורקים. הוצא בעדינות את שומן פרי אב העורקים עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את אב העורקים מהקצה הקדמי עם מספריים ובעדינות להחזיק את הקצה עם מלקחיים בוטים. לנתק את אב העורקים מעמודת עמוד השדרה מאחור על ידי נתיחה בוטה. לסגור היטב את כל העורקים מסתעפים מאב העורקים על ידי קשירה עם electrocoagulator דו קוטבי וחיתוך מהקצה הרחוק של קשירה עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 5 מיליליטר לשטוף את לומן אב העורקים עם 3 מ &#39;l של תמיסת מלח המכילה של הפרין 100 U כדי למנוע היווצרות קרישי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקצה האחורי של אב העורקים לפני שהסניפים לכליות. שמירה על השלמות של אב העורקים היא מאוד חשובה במהלך ההליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של תמיסת 0.075% סולפט dodecyl נתרן (SDS) בדילול מלא בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את אב העורקים החזי ב0.075% SDS פתרון בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי על שייקר מסלולית לשעה 2 ב 150 סל&quot;ד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את אב העורקים בPBS בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי בייקר מסלולית לשעה 2 ב 150 סל&quot;ד ב RT. רענן PBS כל 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את לומן אב העורקים עם 5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור שתל אב העורקים decellularized PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li></ol> 5. Dual זריעה של PiPSC וBioreactor אוויר הערה: כל הפתרוןים וציוד צריך להיות סטרילי. לבצע את כל הפעולות בברדס בתרבית רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את זרימת bioreactor המעגל כפי שמודגם באיור 1. חבר תא דגירה, מאגר המדיה, משאבת peristaltic וקאמרית עמידה בצינורות. נפח מינימאלי של המדיום הדרוש למחזור הוא 40 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנאי מוקדם כלי decellularized עם מדיום תרבות על ידי שריה באב העורקים הבינוני DM בצלחת פטרי 10 סנטימטרים. מניחים את צלחת פטרי בייקר מסלולית עבור שעה 1 ב 50 סל&quot;ד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס צינורות ניילון אורך 1 סנטימטר (0.9 מ&quot;מ OD, מ&quot;מ ID 0.75) לשני הקצוות של כלי השיט decellularized תחת מיקרוסקופ. לקשור את הכלי וצינורות עם 8-0 תפרי משי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שתל אב העורקים decellularized בתא הדגירה על ידי חיבור צינורות ניילון עם יציאות כניסה ויציאה (1/32 &quot;צינורות) מקיר התא. לשמור על תא דגירה עם 5mls של מדיום בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize PiPSC על ידי הוספה מראש התחממתיטריפסין כדי לכסות את המנה התרבות ונער בעדינות את הצלחת 10 פעמים. מחק את טריפסין ולהשאיר את הצלחת בחממה במשך 2-3 דקות. הוסף בינוני תרבות המחוממת מראש בצלחת ומערבבים בינוניים עם התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מספר תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה שני aliquots של השעיות תא המכילות 5 x 10 5 תאים כל אחד במשך 5 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר aspirating supernatant לחלוטין, resuspend גלולה 1 של כדורי תא פיפס ב -50 μl של DM. להזריק השעיה תא זה ללומן כלי decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, resuspend תא גלולה פיפס האחר בMatrigel של 100 μl. בזהירות פיפטה את התערובת על שתל אב העורקים decellularized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה במשך 10 - 15 דקות עד שהתערובת הופכת למדינה כמו ג&#39;ל ובאופן שווה עוטף את פני השטח החיצוניים הכלי. למלא את תא הדגירה עם DM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל bioreactor הגדרה ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. באופן ידני לסובב את שתל decellularized 90 ° סביב ציר האורך כל חצי שעה בשעה 2 הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תרבות סטטית עבור 12 שעות כדי לאפשר הידבקות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק DM באמצעות לומן על ידי משאבת peristaltic לגרום להתמיינות תאי שריר חלק. התחל קצב זרימה ראשוני בשעה 5 מיליליטר / דקה ועלייה בשלבים עד 20 מיליליטר / דקה מעל 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קצב זרימה הבינוני במחזור של 20 מיליליטר / דקה למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את הזרימה בינונית ולהעביר את bioreactor יציאה של החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-זרע לומן של השתל עם PiPSC. Trypsinize, לספור ו צנטריפוגות 1 x 10 6 PiPSC כמו בשלבים 5.5-5.6. Resuspend התאים 50 μl של EGM-2 בינוניים מכיל 50 ng / ml VEGF. להזריק את תערובת התאים לתוך לומן של השתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום בתא הדגירה וכל מחזור לEGM-2 בינוניות מכיל 50 מיליליטר VEGF / ng לגרום להתמיינות אנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את bioreactor שוב את הגדרת החממת דואר. באופן ידני לסובב את השתל 90 ° כל 30 דקות בשעה 2 הראשונה ולאחר מכן לשמור על תרבות סטטית עבור 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל במחזור הזרימה בין 5 מיליליטר / דקה ועלייה בשלבים ל -35 מיליליטר / דקה. שמור את קצב הזרימה ב 35 מיליליטר / דקה במשך 5 ימים. שינוי במחזור והתא בינוני בכל יום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את השתל המהונדס להשתלה נוספת לעכבר. </li></ol> 6. הארכת כפול זרע PiPSC השתל לתוך עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCID השימוש NOD.CB17-Prkdc / עכברי זכרי NcrCrl כמקבלי שתל כלי. תמיד להבטיח שהעכברים כ -10 שבועות, שוקלים בערך 25 - 35 גרם, ונמצאים במצבים בריאותיים טובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר נמען על ידי מתן שילוב של Hypnorm (25 מ&quot;ג / קילוגרם) וHypnovel (25 מ&quot;ג / קילוגרם) intraperitoneally. החל משחת עיני וזלין על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לאשר הרדמה יעילה על ידי הבטחה שיש לי עכברים שרירים רגועים ונושמים בהתמדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את העכבר במצב שכיבה עם צווארה המגולח ומורחב. לנהל סולפט אטרופין (1.7 מ&quot;ג / קילוגרם) בשילוב עם חומרי ההרדמה על מנת להבטיח כי בדרכי הנשימה העכבר נשארה ברורות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חתך קו האמצע מהלסת התחתונה לעצם החזה של העכבר. תחת מיקרוסקופ לנתח עם 5 להגברה של פי 10, להרים את בלוטות רוק תקין רוחבית ולהסיר את השרירים cleidomastoid זכות לחשוף את עורק התרדמה המשותף תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר רקמות המצורפות לגייס את עורק התרדמה המשותף הימני מהקצה הדיסטלי לקראת הסוף הפרוקסימלי. ולקשור את החלק האמצעי של עורק התרדמה המשותף פעמיים עם תפר משי 8-0 ולנתח בין שני הקשרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר דרך שרוול עשוי מצינור ניילון autoclavable בכל קצה ספינה ולתקן כל קצה עם מהדק microhemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עניבת תפר בקצה אחד ולהחיל ירידה של הפרין (100 U / ml). מייד לאחר מכן, להפוך את הקצה הדיסטלי של העורק דואר כדי לכסות את כל גוף השרוול ולתקן את הספינה ההפוכה עם תפר 8-0 משי לשרוול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך לחלק האחר של העורק. עורק סומק עם תמיסת מלח כדי להסיר קרישי דם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתל שתל כלי decellularized בין שני קצוות של עורק התרדמה על-ידי החלקת קצות כלי decellularized של מעל אזיקי העורק ולתקן את זה עם 8-0 תפרי משי. הסר מלחציים כלי דם משני מסתיים לפני הערכת הפעימה של השתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את בלוטת רוק הזכות חזרה למקומו המקורי. סגור את העור על המיקום כירורגית עם תפר שהופסק באמצעות תפר 6-0 polyglactin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן עקבי לשמור סימנים חיוניים של עכבר לאחר ההליך הושלם, עד שיתחדש תודעה. להקריב את עכברי נמען באמצעות שתלי נקע וכלי קציר צוואר רחם או hr 24 או 3 שבועות מאוחר יותר לניתוח נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery:+Past,+Present,+and+Future.">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li><li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits.">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li><li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+insight:+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice.">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li><li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+blood+vessel.">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li><li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate.">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li><li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+(hMSCs).">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis.">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34++progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK/ERK+and+BMP4+signaling+pathways.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li><li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li><li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels.">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li><li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts.">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li><li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts.">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li><li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs.">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+control+vascular+stem/progenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-&#945;-mediated+nuclear+factor-&#954;B+activation.">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-&#945;-mediated nuclear factor-&#954;B activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li><li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirolimus+stimulates+vascular+stem/progenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor/extracellular+signal-regulated+kinase/&#946;-catenin+signaling+pathway.">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/&#946;-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li><li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+matrices:+State+of+the+art.">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li><li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts.">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).</li><li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit.">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li><li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells.">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li><li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts.">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells.">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li><li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model.">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li><li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves.">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li><li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment.">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li><li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine.">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li><li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells:+a+proof-of-concept+study.">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li></ol>

אי לנו אינטרסים כלכליים סותרים.

הפרוטוקול הנוכחי מצביע על צליל אסטרטגיה, מהירה, פשוטה, יעילה ושחזור שבו יכולים להיות שנוצרו כלי רקמה מהונדסות תפקודיים באמצעות PiPSC מfibroblasts האנושי. טכניקה זו מהווה כלי רב ערך לרפואת רגנרטיבית, הנדסת רקמות וטיפול בתאים שעלולים להיות מטופל ספציפי בעתיד הקרוב. שלבים קריט...

הבנייה של צינורות כלי דם היא אסטרטגיה בסיסית לתיקון כירורגי של כלי נפגעו ונפצעו כתוצאה ממחל לב וכלי דם. עד כה, חומרי שתל המשמשים בניתוחים כוללים ביולוגית פולימרים סינטטיים (polytetrafluoroethylene [טפלון], polytetrafluoroethylene המורחב [ePTFE; גור-Tex] או terephthalate פוליאתילן [דקרון]), allografts, רקמת אוטולוגי (קרום הלב או וריד saphenous) וxenografts 1. בעוד שתלי מלאכותיים (למשל, גורטקס ודקרון) הם נפוצים ביותר, חומרים אלה עלולים לגרום לסיבוכים לטווח קצר וארוך רבים הכוללים היצרות, בתצהיר סידן, thrombo-אמבוליזציה וזיהומים. למרות שמטופלים עם שתלים ביולוגיים נוכחי עם ירידה באירועי thrombo-תסחיפים, הם עדיין נתקלים במגבלות כגון אי ספיקה משנית שתל ועמידות מקוצרת בשל הסתיידות השפלה 2. לכן, למרות שיפור המשמעותי בt כירורגיתechniques במשך השנים, החוקרים וקלינאים עדיין עמוס עם הצורך בזיהוי הצינור האידיאלי למחלות לב וכלי דם. לאחרונה, תחום המחקר של הנדסת רקמות כלי דם יצר מושג שבו תאים משולבים פיגומים מתכלים, במטרה ליצור סביבת biomimetic שמגלמת כלי פונקציונלי להשתלה מוצלחת 1. ביסודו, הצלחתו של בונה כלי הדם תלויה בשלושה מרכיבים חיוניים; תאים המרכיבים את הפיגום, כלומר, שכבה פנימית של תאי האנדותל ושכבת תאי שריר חלק, פיגום המכיל המטריצה ​​תאית המתאימה כדי לספק תכונות מכאניות דומות לכלי הדם המקומיים, ואיתות המולקולרית / סלולרית שנדרש לייזום / ויסות תיקון. patency שתל לטווח ארוך ופיתוח מתמשך של הניאו-רקמות תלויים מאוד בזריעת תאים יעילה של פיגומים, הereby טיוח ההחלטה של ​​סוג תא חשיבות קריטית. מספר דיווחים להדגים את השימוש באנדותל הבוגר ותאי שריר חלק ממקורות שונים לפתח צינורות בקוטר קטן 3-6. למרות מבטיח, חוסר כלי אוטולוגי מספיק כדי להשיג אנדותל הבוגר ותאי שריר חלק יישארו נטל ניכר. לאחרונה, תאי גזע ממקורות שונים שנוצלו עבור יישומי הנדסת רקמות וכלי דם. תאים אכן, תאי גזע pluripotent מגוון של סוגי תאי גזע כוללים תאי גזע עובריים 7, מושרה (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, נגזר מח עצם mononuclear 12, בתאי גזע mesenchymal 13, ותאי האנדותל וקיר כלי למבוגרים -derived תאי גזע אנטיגן-1 (SCA-1) + תאי גזע / אב 14,15 כולם הודגמו להיות מסוגל בידול לתאי האנדותל או פונקציונלי או שריר חלק בתגובה לתקשורת מוגדרת ותנאי תרבות. יתר על כן, יכולת התחדשות עצמית בלתי מוגבלת של תאי הגזע להפוך אותם מועמדים טובים יותר בניגוד לאנדותל הבוגר ותאי שריר חלק שיכול רק לחלק למספר מוגבל של פעמים לפני שעברו למעצר צמיחה והזדקנות. הבחירה של חומר פיגום כדי ליצור כלי רקמות מהונדס מוצלחות להשתלה תלויה במספר גורמים כגון biocompatibility, תכונות ביו-מכאניות, ושיעור ההתכלות. ביסודו, חומרים המשמשים ליצור פיגומים לשתלים צריכים להיות מתכלה ולא הר תגובות חיסוני נמען מיותר. בנוסף, הוא חייב להקיף נקבוביות מתאים ומייקרו עבור קובץ מצורף תא והישרדות שלאחר מכן. עד כה, החומרים הנפוצים ביותר בשימוש לפיגומים בהנדסת רקמות וכלי דם כוללים פולימרים של חומצות polyglycolic, חומצת polylactic, וε-caprolactone פולי 16. לאחרונה, יש לי חומרים ביולוגיים decellularizedגם יושם בהצלחה מסוימת. מספר מעבדות הראו כי זריעה אנושית decellularized, כלבים או כלי החזיריים עם תאי אוטולוגי סיפקה שתל ביולוגי שהתנגד קרישה והיפרפלזיה intimal 17-19. אסטרטגיות אחרות בהנדסת רקמות וכלי דם כוללות שתלים תאיים כלי דם המבוססים על חלבוני מטריצה ​​למשל, זריעת תאים בג&#39;ל הפיברין 13 וגיליונות תא יצירה ללא תמיכת פיגום 20, 21. הפרוטוקול הנוכחי מדגים את הבידול של PiPSC האנושי לאנדותל הפונקציונלי ותאי שריר חלק, הדור של bioreactor המורכב מפיגום כלי decellularized נמל תאי כלי דם נגזר PiPSC פונקציונליים, והשתלה של כלי הרקמה מהונדסות לכשל חיסוני משולב חמור (SCID עכברים). PiPSC הוא סוג תא אופטימלי לשימוש עבור הנדסת רקמות של שתלי כלי משום שתאים אלה לא יוצרים גידולים בעכברים או להעלות אתי ותגובות allo-חיסונית. יתר על כן, יש לנו הראינו כי האסטרטגיה ליצירת פיפס-אנדותל תאים ופיפס חלק תאי שריר היא יעילה והשחזור 10,11. לאחר מכן, מתכננים כלי decellularized לזריעה של תאי כלי דם נגזר PiPSC לחקות באופן הדוק חלבוני מטריצה ​​שקיים בתוך כלי ילידים, וכך לשפר את יעילות השתלה והישרדות. יתר על כן, decellularization של כלי לפני זריעת PiPSC מונע ההתרחשות של תגובות דלקתיות רכובים על ידי סוגי תאים חיסוניים כגון מקרופאגים. יותר מכך, פרוטוקול זה לא רק מייצג מתודולוגיה כדי ליצור מבטיח צינורות כלי דם לתרגום לבני אדם, אלא גם מספק אמצעי רב ערך של לימוד והבנת המנגנונים המולקולריים השולטים בהתחדשות רקמת כלי דם באמצעות מודלים עכבר.

<table><tbody><tr><td>Human Fibroblasts CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Prenatal human embryonic fibroblasts</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (Kaighn&#039;s Modification of Ham&#039;s F-12 Medium)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF</td><td>R&amp;amp;D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Solution 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PvuI Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nucelofection Kit (NHDF Kit)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Cold light illumination for stereo microscopy</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7&amp;nbsp;</td><td>Jepson Bolton&#039;s, Janke&amp;amp;Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Pump Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S large cartridges for pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&amp;nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Tubing goes through the peristaltic pump</td></tr><tr><td>0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adapter connect above two types of tubings</td></tr><tr><td>1/32&quot; Tubing, ID 0.01&quot; (250&amp;micro;m) Material: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing</td></tr><tr><td>One-Piece Fittings&amp;nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fix the above tubings through the incubation chamber wall</td></tr><tr><td>Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm)&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>Tubings insert into two ends of the aorta graft</td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdc&lt;sup&gt;scid&lt;/sup&gt;/NcrCrl mouse</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 8-0&amp;nbsp; silk</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgesic for use in mice</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Induction of anaesthesia</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Tubing</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff</td></tr><tr><td>Electrocoagulator</td><td>Martin&amp;nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligation of artery branches on aorta</td></tr><tr><td>Bipolar micro hemostat forceps</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fixation of vessel ends</td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;amp;T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini applier&amp;nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Micro hemostats clips</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and grafting of tissue-engineered vessels in a mouse model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

הדור המוצלח של PiPSC אושר 4 ימים לאחר nucleofecting fibroblasts אדם עם פלסמיד pCAG2LMKOSimO ינארית ביצוע 4 גורמי שעתוק, Oct4, Sox2, KLF4 וc-MYC (OSKM). PiPSC מוצג פנוטיפ ניכר מובהק בהשוואה לfibroblasts (איור 2 א) והביע גורמי תכנות מחדש 4 בmRNA (איור 2) וחלבון רמות (איור 2 ג) 10. היעילות ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model at JoVE.com

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K Views.  King's College London BHF Centre.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר שתלי כלי רקמה מהונדסת, כי הם פונקציונליים להשתלה לעכברים על ידי זריעה כפולה תאי גזע pluripotent מושרה באופן חלקי (PiPSC) - נגזר תאי שריר חלק וPiPSC - תאי האנדותל נגזרו על bioreactor פיגום כלי decellularized. 

Video: Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

השתלת אב עורקים בעכברי orthotopic לחקר מחלת כלי דם

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Medicine

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

מודלים עכבר לטרשת עורקים שתל

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

טכניקה כירורגית להשתלה של רקמות שתלי כלי דם מהונדסים ולאחר<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Murine Cervical Heart Transplantation Model Using a Modified Cuff Technique

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are available to perform mechanistic in vivo studies. While heart transplantation models using a suture technique were first successfully developed in rats, the translation into an equally widespread used murine equivalent was never achieved due the technical complexity of the microsurgical procedure. In contrast, non-suture cuff techniques, also developed initially in rats, were successfully adapted for use in mice1-3. This technique for revascularization involves two major steps I) everting the recipient vessel over a polyethylene cuff; II) pulling the donor vessel over the formerly everted recipient vessel and holding it in place with a circumferential tie. This ensures a continuity of the endothelial layer, short operating time and very high patency rates4.
Using this technique for vascular anastomosis we performed more than 1,000 cervical heart transplants with an overall success rate of 95%. For arterial inflow the common carotid artery and the proximal aortic arch were anastomosed resulting in a retrograde perfusion of the transplanted heart. For venous drainage the pulmonary artery of the graft was anastomosed with the external jugular vein of the recipient5.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

The murine cervical heart transplantation model is well suited for immunological as well as ischemia reperfusion injury studies. We modified the procedure using a non-suture cuff technique and performed more than 1,000 successful transplants with this approach.
Herein, we provide additional details of this technique to supplement the video.

עכברי צוואר הרחם לב השתלת דגם שימוש בטכניקת חפתים השתנה

Mouse models are of special interest in research since a wide variety of monoclonal antibodies and commercially defined inbred and knockout strains are ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Scaling של שתלי כלי דם שהונדס בשיטות מדריכי 3D מודפס ואת שיטת נחת הטבעת

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

Microsurgical דגם חדשני לHeterotopic, כמקשה אחת בחזה קיר, קורנית, ולב השתלה בעכברים

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

בטכניקה שרוול במודל של עכברים של אבי העורקים השתלת - סרט הדרכה

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Mouse Heterotopic Cervical Cardiac Transplantation Utilizing Vascular Cuffs

Murine models of cardiac transplantation are frequently utilized to study ischemia-reperfusion injury, innate and adaptive immune responses after transplantation, and the impact of immunomodulatory therapies on graft rejection. Heterotopic cervical heart transplantation in mice was first described in 1991 using sutured anastomoses and subsequently modified to include cuff techniques. This modification allowed for improved success rates, and since then, there have been multiple reports that have proposed further technical improvements. However, translation into more widespread utilization remains limited due to the technical difficulty associated with graft anastomoses, which requires precision to achieve adequate length and caliber of the cuffs to avoid vascular anastomotic twisting or excessive tension, which can result in damage to the graft. The present protocol describes a modified technique for performing heterotopic cervical cardiac transplantation in mice which involves cuff placement on the recipient's common carotid artery and the donor's pulmonary artery in alignment with the direction of the blood flow.

Mouse cardiac transplantation models represent valuable research tools for studying transplantation immunology. The present protocol details mouse heterotopic cervical cardiac transplantation that involves the placement of cuffs on the recipient's common carotid artery and the donor's pulmonary artery trunk to allow for laminar blood flow.

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video