Ce travail est financé par les Instituts nationaux de la santé de subvention R01 EB-008 836 et R01 HL083895 (à la fois à LEN). Nous pourrions remercier Daryl Smith, le souffleur de verre de l&#39;Université, pour rendre les bioréacteurs pour notre recherche.

Autoclave Assemblez les tubes et autoclaver pour le système de flux et de composants bioréacteur (bioréacteur lui-même et le couvercle bouchon en silicone), comme indiqué dans la Figure 1 et Figure 2. Alimentation par sonde a un connecteur mâle à une extrémité et une extrémité ouverte de l&#39;autre côté. Trois segments de tube court sont insérés à travers un bouchon de silicone pour les échanges gazeux. 1. Couture PGA Mesh <ol><li> Couper PGA maille à 1.1cm x 8cm feuille de ~ (dépendant de la taille bioréacteur). </li><li> Tube en silicone pur (3mm de diamètre intérieur) avec de l&#39;eau distillée (dH20) et l&#39;air sec avant utilisation. </li><li> Utilisez Dexon 6.0 de suture à coudre PGA maillage autour du tube en silicone propre à partir de trois nœuds chirurgicale suivie de points de suture simple. </li></ol> 2. PGA Échafaudages Traitement de surface <ol><li> Trempez échafaudages de la PGA en NaOH 1M pour le 1-2min et d&#39;enregistrer les temps de traitement et d&#39;utilisation en même temps pour tous les échafaudages de la PGA. </li><li> Rincez échafaudages de la PGA en bains dH2O pendant 2 minutes 3 fois. </li><li> Pat PGA échafaudages sec avec Kimwipes entre chaque plongeon dans les bains dH O 2. </li><li> Dry PGA échafaudages sous le capot de culture de tissus à l&#39;air sec pendant 15 minutes avec soufflerie sur. </li></ol> 3. Bras de Dacron à coudre <ol><li> Utilisez Prolène 4.0 de suture à coudre des petits morceaux de manchettes en Dacron (1cm) sur chaque extrémité de la maille PGA avec un chevauchement de 2-3mm. Remarque: veillez à ne pas perforer tube en silicone (figure 3). </li><li> Utilisez la suture même à coudre trois points de suture autour de l&#39;extrémité libre de manchettes en Dacron. Assurez-vous de laisser assez de points de suture à l&#39;extrémité libre de suture Prolène pour l&#39;étape 5.1 (figure 3). </li></ol> 4. Assemblée des bioréacteurs (jour avant le début de la culture bioréacteur) <ol><li> Tremper mailles cousues et silicone, instruments chirurgicaux, et un mince fil de fer dans un bain d&#39;éthanol à 70% pour les 20-30 minutes. </li><li> Ouvrez le sachet autoclave contenant le bioréacteur et l&#39;immerger dans le bain d&#39;éthanol 70% pendant au moins 30 minutes avant l&#39;assemblage. Assurez-vous de rincer soigneusement le bioréacteur avec de l&#39;éthanol. L&#39;exposition de toutes les composantes de bioréacteur pour 70% d&#39;éthanol est une étape de stérilisation plus. Cette étape supprime également l&#39;endotoxine, qui n&#39;est pas éliminé par autoclavage et est nocive pour les cellules vasculaires. </li><li> Tirez tube en silicone à l&#39;aide de bras secondaires mince fil de fer pour le tirer à travers. </li><li> Prenez bioréacteur de bain d&#39;éthanol (garder treillis immergé dans l&#39;éthanol). Fixer l&#39;échafaud PGA à l&#39;intérieur du bioréacteur par fixation poignets Dacron sur les lèvres de verre évasé en serrant et attacher le fils de suture Prolène (figure 3). </li><li> Connectez un côté du bras latéraux bioréacteur pour connecteurs via un tube de silicone. </li><li> Tirez l&#39;autre côté du tube en silicone avec assez de tension et insérez les deux autres connecteurs dans le tuyau en silicone. Accrochez-vous à tube en silicone serré lors de l&#39;insertion des connecteurs! </li><li> Bioréacteur Réinsérer dans le bain d&#39;éthanol et rincer avec de l&#39;éthanol en tirant doucement sur les connecteurs hors des bras secondaires. </li><li> Retourner bioréacteur et de permettre une plus tremper pendant 10 minutes. </li><li> Bioréacteur Retournez à l&#39;endroit et laisser tremper pendant 10 minutes supplémentaires. </li><li> Égoutter tout l&#39;éthanol. </li><li> Mettre en place trois grandes boîtes de Pétri (10 cm) en série et bioréacteur place dans le plat central pour maintenir le dégoutté excès d&#39;éthanol à partir des extrémités des tubes. </li><li> Rincer bioréacteur et PGA filet avec de l&#39;eau de culture tissulaire en utilisant une pipette 5ml ou 10ml. Aussi l&#39;eau affleurant la culture de tissus dans un tube de silicone. </li><li> Bien égoutter l&#39;excédent d&#39;eau dans des boîtes de Pétri de chaque côté du bioréacteur. </li><li> Bioréacteur à sec durant la nuit dans la hotte avec ventilateur ON et OFF UV. </li><li> Notes supplémentaires: assurez-agitateur stérile est en bioréacteur. Veillez à ne pas &quot;planer&quot; sur le bioréacteur à partir de ce moment, pour éviter toute contamination. Coupez les nombreuses bandes parafilm et les faire tremper dans un bain d&#39;éthanol à 70% de petite taille (grande boîte de Pétri fonctionne bien). </li></ol> 5. Jour 1: Configuration bioréacteur <ol><li> Placez une boîte de Pétri stérile sur l&#39;ouverture de chaque bioréacteur pour protéger l&#39;intérieur PGA échafaudage de contaminants. </li><li> Assemblez système d&#39;écoulement d&#39;bioréacteur, comme indiqué dans la figure 4 et parafilm tous les joints de raccordement. <ol><li> Essuyez les connecteurs d&#39;abord avec des lingettes alcoolisées. </li><li> Fixer le port d&#39;injection à la troisième, le bras inutilisée de bioréacteur. </li><li> Retirez le morse et le tube attacher extrémité bleue de dilution saline définir comme proche de jonction en Y que possible. Tirez bride du tube en place afin de s&#39;assurer qu&#39;aucun transfert de liquide dans cette partie du tube </li><li> Retirer le sac IV, &amp; joignez tube morse (rouge) à la fin de loin sac IV. Veillez à essuyer le port d&#39;insertion avec tampon imbibé d&#39;alcool d&#39;abord. </li><li> Fixez le morse d&#39;un côté du système d&#39;écoulement (par l&#39;intermédiaire du tube extrémité blanche). </li><li> Insérez robinet 3 voies dans le système d&#39;écoulement. </li><li> Enlever le capteur de pression et se connecter à robinet à trois voies. </li><li> Fixez l&#39;autre extrémité du capteur de pression à l&#39;ouverture du milieu dans sac. </li></ol></li><li> Connectez-le bioréacteur pour le système d&#39;écoulement via la jonction en Y. Utiliser une seringue de 60 ml d&#39;ajouter 350ml d&#39;une fungizone% (5ml fungizone mélanger avec 495ml de PBS) au sac IV. </li><li> Pressez sac IV pour rincer le système qui coule en ajustant les robinets d&#39;arrêt pour permettre l&#39;écoulement de PBS. Remarque: vérifiez l&#39;intérieur de bioréacteur pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;ya pas de fuite. </li><li> Re-suspendre 8 x10 6 SMC (environ un confluentes T75) dans 1,25 ml de milieu et de semences sur chaque scafffold PGA. Assurez-vous que la suspension cellulaire a été uniformément goutte à goutte sur la PGA maille en Dacron de jonction ainsi que sur le côté bas de la PGA maillage. </li><li> Essuyer le bord du bioréacteur avec tampon imbibé d&#39;alcool par le biais de rotation dans le bioréacteur côté éviter de planer. </li><li> Assemblée silicone couvercle bouchon (Figure 2) <ol><li> Eplucher sac autoclave retour soin, en veillant à ne pas exposer fond du couvercle. </li><li> Fixer le port d&#39;injection pour tube d&#39;alimentation au niveau du connecteur mâle. </li><li> Attacher les filtres en PTFE 0,20 um à chacun des trois ports de l&#39;air. </li><li> Soyez prudent de ne pas exposer / toucher le fond du couvercle pendant ce processus. </li><li> Parafilm le port d&#39;injection. </li></ol></li><li> Insérer le couvercle bouchon en silicone en bioréacteur de verre et assurez-vous que le tube d&#39;alimentation à l&#39;intérieur du bioréacteur ne touche pas les échafaudages ensemencés PGA. Parafilm autour du couvercle. </li><li> Placez bioréacteur avec le système d&#39;écoulement à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur (sur le côté) et faire tourner le bioréacteur toutes les 5 minutes pendant 25-30 minutes. </li><li> Remplir la chambre bioréacteur avec 400ml de nos milieux de culture de 40 à 10 comme décrit dans (tableau 1). Ce milieu de culture est &quot;optimisé&quot; pour les artères porcines ingénierie. </li></ol> 6. Jour 6-7: Mise en marche de la pompe, et la première alimentation <ol><li> Cultivez les échafaudages ensemencés statiquement sans pulsatile pompage à travers le tube de silicone pour 6-7 jours. Il n&#39;est pas nécessaire pour le changement de milieu ou de supplémentation en vitamine C pendant ce temps. </li><li> Assurez-vous qu&#39;il n&#39;ya aucune fuite de PBS ou de plier des tuyaux du système de débit avant de tourner sur la pompe. </li><li> Tournez sur la pompe du système d&#39;écoulement et veillez à ajuster le réglage de la pompe pour que la pression d&#39;environ 270/-30mmHg lit. </li><li> Pressions enregistrement quotidien à travers la culture et de maintenir la pression à 270/-30mmHg. Capteur de pression peuvent être connectés à un ordinateur pour lire et contrôler la pression. </li></ol> Première tétée <ol start="5"><li> Assemblez port d&#39;injection et filtre PTFE sur l&#39;alimentation des couvercles pour les deux changement de milieu et de fins déchets de moyenne deposal. </li><li> Placer le tube d&#39;alimentation fermement sur la pompe et insérez un bout à l&#39;alimentation du port du bioréacteur et l&#39;autre extrémité sur le couvercle d&#39;alimentation. Assurez-vous d&#39;essuyer les ports d&#39;injection avec des lingettes éthanol. </li><li> Utiliser une pompe double-directionnel Masterflex pour pomper 200ml de milieu. Ensuite, utilisez un tube d&#39;alimentation de nouvelles à la pompe 200ml de milieu frais de retour dans le bioréacteur. Toujours commencer avec une vitesse très lente, en particulier lors du pompage de retour à moyen et à le bioréacteur. </li><li> Changement moyen et 2x/semaine l&#39;acide ascorbique complément. Pour ajouter l&#39;acide ascorbique, l&#39;utilisation d&#39;une seringue 30ml de sortir 25ml de milieu et de le mettre de côté dans la hotte du tissu. Dissoudre 25 mg d&#39;acide ascorbique dans 5ml de PBS et de le filtrer à travers un filtre de 0,22 um. D&#39;abord injecter de l&#39;acide ascorbique stérile dans le tube d&#39;alimentation et de rajouter le support 25ml prises plus tôt. La recette moyenne est donnée dans le tableau 1. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Les tuyaux et raccords pour le montage du système d&#39;écoulement est indiqué ci-dessus. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. L&#39;assemblage couvercle en silicone bouchon est indiqué ci-dessus. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Schémas d&#39;assemblage bioréacteur sont présentés ci-dessus. A l&#39;intérieur du bioréacteur Dacron poignets sont fixés sur les bras de verre avec les nœuds de suture bleu. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Système d&#39;écoulement raccordé à un tuyau et de bioréacteur est indiqué ci-dessus. L/S18 tube sera pompée par une pompe Masterflex et ainsi conduire le courant. Le capteur de pression mesure la pression avant d&#39;entrer dans le bioréacteur au cours supérieur. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. Image du navire conçu récoltés. Vaisseaux Conçu apparaîtra à être opaque et d&#39;atteindre une épaisseur de paroi d&#39;environ 250μm après 8 semaines de culture dans des conditions pulsatile. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Hématoxyline-éosine teinté sections de navires d&#39;ingénierie. A et B sont de 8 semaines non pulsé et pulsé vaisseaux, respectivement.C et D sont de 4 semaines des navires non pulsé et pulsé, respectivement. L indique le côté luminal des vaisseaux. La barre d&#39;échelles est 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Figure 7"/> Figure 7. Taches trichrome de Masson pour le collagène (en bleu) pour les sections de navires d&#39;ingénierie. A et B sont de 8 semaines vaisseaux non pulsé et pulsé, respectivement. C et D sont de 4 semaines des navires non pulsé et pulsé, respectivement. Notez que le navire de 4 semaines pulsé montre plus de collagène que son homologue non pulsé. Les flèches blanches point à fragments restants PGA dans les vaisseaux. La barre d&#39;échelles est 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Figure 8"/> Figure 8. Coloration immunochimie des marqueurs chez les bovins SMC artères ingénierie. Musculaires lisses α-actine, calponine-1, et les muscles lisses chaînes lourdes de myosine (SMMHC) sont précoces, intermédiaires, et à la fin SMC marqueurs contractiles, respectivement. À la fin de 12 semaines de culture, les cellules de la paroi des vaisseaux expresse SM α-actine et des quantités modérées de calponine-1 et SMMHC. La barre d&#39;échelles est 20μm. <table border="1"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Montant </td></tr><tr><td> DMEM (DME / basse modifiés) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (sérum de veau fœtal) inactivé par la chaleur </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> HEPES 1,0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> Vitamine C (dissous dans du PBS ou du DMEM) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glycine / alanine 25 mg/25 mg/10 mg (dissous dans 5ml de PBS) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CUSO4 1,5 ug (dissous en 1 ml de PBS) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> La pénicilline G à 10 000 unités / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> PDGF-BB (platelet-derived growth factor-BB) à 10ng/ml </td><td> 5 ug </td></tr><tr><td> bFGF (basic fibroblast growth factor) à 10ng/ml </td><td> 5 ug </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Composantes de &quot;40-10&quot; moyennes sont indiquées dans le tableau ci-dessus. À l&#39;exception de PDGF-BB et le bFGF, tous les autres composants doivent être filtrés à travers un filtre 0,2 um avant utilisation.

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La qualité des navires d&#39;ingénierie est en grande partie dicté par la qualité des CML utilisés en culture de tissus. Les aspects critiques du phénotype SMC comprennent la morphologie contractiles, le nombre de passages bas, et la capacité de proliférer à l&#39;intérieur du bioréacteur. Nous recommandons que le nombre de passage pas être supérieure à P3 au moment de l&#39;ensemencement des cellules sur l&#39;échafaud polymère. Par ailleurs, il est crucial de vérifier que les sources sont libres SMC m...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif / Matériel </th><th> Fournisseur </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> FBS (sérum de veau fœtal) inactivé par la chaleur </td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-base </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Pénicilline G </td><td> Sigma </td><td> PENNA </td></tr><tr><td> Cuivre (II) sulfate </td><td> Sigma </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> Sigma </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-alanine </td><td> Sigma </td><td> A7469-25G </td></tr><tr><td> L-proline </td><td> Sigma </td><td> P5607-25G </td></tr><tr><td> Acide ascorbique </td><td> Sigma </td><td> A4544-25G </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td></tr><tr><td> Bouchon en silicone </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex tubes L / S </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06508-16, 06508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex Pompe </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Coiffe en Dacron </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA senti </td><td> Concordia </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1.5 métriques Surgipro II de suture </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0.7 de suture Dexon métriques </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm des filtres en PTFE </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> Three Way robinet </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> Capteur de pression </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> Sacs IV </td><td> Baxter </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> Jeu de dilution Saline </td><td> Flèche </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> Tube silicone </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor

Beaucoup d&#39;efforts ont été consacrés à développer et faire progresser la méthodologie pour régénérer fonctionnelle de petit diamètre artériel contourne. Dans le milieu physiologique, à la fois une stimulation mécanique et chimique sont nécessaires pour maintenir le bon développement et la fonctionnalité de 1,2 vaisseaux artériels. Systèmes de culture bioréacteur développé par notre groupe sont conçus pour soutenir la régénération navire dans une contrôlée avec précision chimio-mécanique imitant celle de l&#39;environnement des navires indigènes. Notre assemblée bioréacteur et les procédures de maintenance sont assez simples et hautement reproductibles 3,4. Les cellules musculaires lisses (SMC) sont ensemencées sur un acide glycolique tubulaire (PGA) maillage qui est enfilé sur tube en silicone conforme et cultivées dans le bioréacteur avec ou sans stimulation pulsatile pendant 12 semaines. Il ya quatre principaux attributs qui distinguent notre bioréacteur de certains prédécesseurs. 1) Contrairement aux systèmes de culture de l&#39;autre qui simulent seulement la biochimie des vaisseaux sanguins environnants natale, notre bioréacteur crée également un environnement physiologique pulsatile en appliquant cyclique contrainte radiale pour les navires dans la culture. 2) Plusieurs bateaux conçus peuvent être cultivées simultanément sous différentes conditions mécaniques dans un environnement chimique contrôlé. 3) Le bioréacteur permet une couche mono de cellules endothéliales (CE) pour être facilement appliqué sur la face luminale des vaisseaux conçus pour l&#39;implantation des modèles animaux. 4) Notre bioréacteur peut également conçu des récipients de culture avec la taille de diamètre différent variait de 1 à 3 mm, économisant l&#39;effort d&#39;adapter chaque bioréacteur individuelles pour s&#39;adapter à une taille de diamètre spécifique. Les bateaux conçus en culture dans notre bioréacteur ressemblent vaisseaux sanguins natif histologiquement à un certain degré. Les cellules dans les parois des vaisseaux matures expriment des marqueurs SMC contractiles tels que les muscles lisses de la chaîne de myosine lourde (SMMHC) 3. Une quantité importante de collagène est déposé dans la matrice extracellulaire, qui est responsable de la résistance mécanique finale des vaisseaux conçus 5. L&#39;analyse biochimique indique également que la teneur en collagène des vaisseaux d&#39;ingénierie est comparable à celui des artères natives 6. Surtout, le bioréacteur a constamment régénérée pulsatile navires qui présentent des propriétés mécaniques qui permettent des expériences implantation réussie dans des modèles animaux 3,7. De plus, ce bioréacteur peut encore être modifié pour permettre en temps réel d&#39;évaluation et de suivi du remodelage du collagène au cours du temps, de manière non invasive, en utilisant un microscope optique non-linéaire (NLOM) 8. Pour conclure, ce bioréacteur doit servir une excellente plateforme pour l&#39;étude des mécanismes fondamentaux qui régulent la régénération de la fonctionnelle de petit diamètre des greffons vasculaires.

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Notre groupe a développé un système de culture bioréacteur qui imite les contraintes pulsatiles physiologiques du système cardiovasculaire pour régénérer implantables petit diamètre des greffons vasculaires.

Greffes d&#39;ingénierie biologique vasculaire basé sur l&#39;aide d&#39;un bioréacteur pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

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Bioengineering

16.9K vues.  Yale University. Notre groupe a développé un système de culture bioréacteur qui imite les contraintes pulsatiles physiologiques du système cardiovasculaire pour régénérer implantables petit diamètre des greffons vasculaires.

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Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Conception d&#39;un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l&#39;ingénierie tissulaire

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

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Bio-ingénierie

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Fonctionnement d&#39;un bioréacteur de laboratoire

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Construction et caractérisation d&#39;un pli bioréacteur roman Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

La culture de cellules de mammifères en utilisant un système pneumatique bioréacteur à usage unique

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Technique chirurgicale pour l&#39;implantation de l&#39;ingénierie tissulaire vasculaires greffes et suivantes<em&gt; In Vivo</em&gt; Surveillance

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Un bioréacteur pour Novel Haute Culture de la densité des communautés microbiennes diverses

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l&#39;image

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.