המחקר שלנו הוא נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית של, NIH National Eye Institute.

כל ציוד ריאגנטים בהם נעשה שימוש הם עקרים. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (ACUC) בשעה ניי / NIH (פרוטוקול המחקר בבעלי חיים ניי-570), וכן בוצעו על פי הנחיות NIH והתקנות. 1. Baseline תיוג מדרדר לתאי הגנגליון של הרשתית (RGCs) ביום 1 מטרת הליך זה היא תווית לתאי הגנגליון ברשתית retrogradely ידי הזרקת צבע נותב עצביים לתוך colliculus מעולה של עכברים שלושה ימים לפני הפציעה עצב הראייה למחוץ. לצבוע יילקחו retrogradely על ידי התאים הגנגליון ברשתית ומספק סמן את RGCs חיים (איור 1). גישה זו מניבה תיוג לשחזור של RGCs קיימא עם וריאציה מעט 1-5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים את העכבר. נקו את השיער בחלק העליון של הראש. מניחים את העכבר במנגנון stereotaxic קטן. Oinment מגן מוחל על שתי העיניים. לחטא את עור הראש שלוש פעמים באמצעות iodophor ו לשפשף באלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך בעור לחשוף את הגולגולת, ולשמור אותו יבש ונקי באמצעות מי חמצן 3%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי לציון גבחת. לקדוח חור מעל colliculus הממונה על 2.9 מ&quot;מ מאחורי גבחת ו 0.5 מ&quot;מ לרוחב קו האמצע של כל האונה 7. במהלך הקידוח, להחיל מלוחים לאתר שבו הוא קדח חור כדי למנוע פגיעה חום משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכשיר מדידה stereotaxic ומזרק המילטון, להזריק העצבית FluoroGold נותב צבען (1 μl של 3% ב Fluorochrome מלוחים) לאט לאט לתוך colliculus מעולה של האונה כל בעומק של 1.6 מ&quot;מ ממשטח הגרמי של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את האתר החתך. תן הזרקה תת עורית של עצירות על שיכוך כאבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העכבר לאזור חם ויבש ולנטר אותו עד שהוא מסוגל לשמור על יציבה זקופה, ולהחזיר אותו בכלוב בבית שלה. במשך שלושת הימים הראשונים לאחר הניתוח תיוג, משככי כאבים מערכתית (למשל, עצירות) וכן משחה אנטיביוטית מקומית ניתנים פעמיים ביום את העכבר הוא פיקוח הדוק. </li></ol> 2. עצב הראייה קראש פגיעה באותו יום 4 בהליך זה, אנו תחול פגיעה למחוץ את עצב הראייה לגרום נזק ראשוני של אקסונים (איור 2), אשר יוביל למוות הדרגתי של התאים הגנגליון ברשתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לאחר היישום נותב צבע, העכבר נמצא בהרדמה עמוקה. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לחמית העין אחד הוא חרות על כ בעמדה 4 לפנות באמצעות מספריים האביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיט בעדינות את השרירים מסלולית ולשים אותם בצד. לחשוף את עצב הראייה לבן ביציאה מן העולם את העין. קח בזהירות רבה לא כל נזק כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג צולבות פעולה מלקחיים, להחיל פציעה למחוץ את עצב הראייה על כ - 2 מ&quot;מ מפני גלגל העין במשך כ 3 שניות. קח בזהירות רבה שלא לפגוע בעורק עיניים כדי לגרום לדימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הפגיעה למעוך, החתך הוא sutured. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני העכבר מתאושש מההרדמה, לתת הזרקה תת עורית של עצירות של שיכוך כאבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העכבר לאזור חם ויבש ולנטר אותו, עד שהוא מסוגל לשמור על יציבה זקופה ולהחזיר אותו בכלוב בבית שלה. במשך שלושת הימים הראשונים לאחר ההליך פגיעה למעוך, משככי כאבים מערכתית (למשל, עצירות) וכן משחה אנטיביוטית מקומית ניתנים פעמיים ביום את העכבר הוא פיקוח הדוק. </li></ol> 3. קציר רשתיות ולנתח הישרדות RGC ביום 11 מטרת הליך זה היא לקצור retinaeto לנתח הישרדות תא גנגליון ברשתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו יום 11 (יום 7 אחרי ONC), העכבר הוא מורדמים על ידי עירוי CO 2 ו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיניים הן enucleated בעזרת זוג מלקחיים על ידי הפעלת לחץ על מסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העיניים הן פתרון קבוע paraformaldehyde 4% למשך שעתיים לרחוץ PBS שלוש פעמים. לנתח את הרשתית. ההליך של דיסקציה הרשתית כבר פורסם בעבר ב 2010 על ידי יופיטר על ידי Gustmann, S. et al. 6, ולכן לא יהיה המתואר כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות של התאים ששרדו הגנגליון ברשתית נלקחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באזורים מוגדרים של הרשתית, ועל הרשתית צפיפות תא גנגליון ניתן לספור. התוצאה נציג את הקרינה שכותרתו בתאי הגנגליון ברשתית עם או בלי פגיעה עצב הראייה למחוץ מוצג באיור 3. </li></ol> 4. נציג תוצאות: כדי לנתח הגנגליון ברשתית תאים והישרדות, שבעה ימים לאחר פציעה עצב הראייה למעוך, רשתיות נבצרו קבועה, שטוח ועלה. תמונות הרשתית נלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בהשוואה r הרגיל וללא כל פגעetina (משמאל, רגיל), מספר RGCs קיימא (ירוק, שכותרתו retrogradely על ידי צבע עצביים נותב FluoroGold מוזרק לתוך colliculus מעולה) הוא נמוך משמעותית רשתיות עם פציעה למחוץ עצב הראייה (ימין, ONC) (איור 3) . <img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Baseline מדרדר תיוג של תאים הגנגליון ברשתית כדי לספור את התאים קיימא הגנגליון ברשתית בנקודות זמן שונות לאחר פציעה עצב הראייה למחוץ, התאים הגנגליון ברשתית מסומנים retrogradely באמצעות הזרקת עצביים נותב צבע (הצבע הירוק) לתוך colliculus מעולה בשלושת הימים המוח לפני עצב הראייה ( אדום) למחוץ פציעה. מאז האקסונים של התאים הגנגליון ברשתית מתגוררים colliculus מעולה, לצבוע נותב יהיה תפוס על ידי RGCs retrogradely ומספק סמן את RGCs חיים. <img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. עצב הראייה למחוץ פציעה על מנת לנתח את המצב של הישרדות הגנגליון ברשתית התא, פגיעה למחוץ מוחל על עצב הראייה (אדום) כדי לגרום נזק ראשוני של אקסונים. זה יוביל למוות הדרגתי של התאים הגנגליון ברשתית. שלושה ימים לאחר הזרקת צבע (ירוק) נותב, העכבר הוא מורדם. לחמית העין הוא חרות. להסיט את השרירים מסלולית ולשים אותם בצד. לחשוף את עצב הראייה ביציאה מן העולם את העין. החלת פציעה למחוץ את עצב הראייה על כ - 2 מ&quot;מ מפני גלגל העין במשך כ 3 שניות בעזרת זוג צולבות פעולה מלקחיים. <img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Fluorescence שכותרתו הגנגליון ברשתית תאים עם או בלי פגיעה עצב הראייה למחוץ כדי לנתח הגנגליון ברשתית תאים והישרדות, שבעה ימים לאחר פציעה עצב הראייה למעוך, רשתיות נבצרו קבועה, שטוח ועלה. תמונות הרשתית נלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בהשוואה הרשתית רגיל ללא פגע (משמאל, רגיל), מספר RGCs קיימא (ירוק, שכותרתו retrogradely ידי העצבית FluoroGold נותב צבע המוזרק colliculus מעולה) היה נמוך משמעותית רשתיות עם פציעה למחוץ עצב הראייה (ימין, ONC ) (תרשים 3). בר קנה מידה: 50 מיקרומטר

<ol>
	<li>Yoles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1+reduces+injury-induced+metabolic+deficits+and+degeneration+in+the+rat+optic+nerve.">GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve.</a> Investigative ophthalmology &#38; visual science. 33, 3586-3591 (1992).</li><li>Fisher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+for+neuroprotection+in+the+mouse+optic+nerve:+implications+for+optic+neuropathies.">Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies.</a> J Neurosci. 21, 136-142 (2001).</li><li>Levkovitch-Verbin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGC+death+in+mice+after+optic+nerve+crush+injury:+oxidative+stress+and+neuroprotection.">RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection.</a> Investigative ophthalmology &#38; visual science. 41, 4169-4174 (2000).</li><li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-B+inhibits+apoptosis+via+VEGFR-1-mediated+suppression+of+the+expression+of+BH3-only+protein+genes+in+mice+and+rats.">VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).</li><li>Tang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+effect+of+PDGF-CC+rescues+neurons+from+apoptosis+in+both+brain+and+retina+by+regulating+GSK3beta+phosphorylation.">Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).</li><li>Gustmann, S., Dunker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo-like+organotypic+murine+retinal+wholemount+culture.">In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

עצב הראייה למחוץ פציעה מודל Murine שימושי ללמוד את התהליך של מוות הישרדות RGC ו. מודל זה הוא גם משמש לעתים קרובות כדי לחקור את ההשפעות של ריאגנטים גנים שונים על אפופטוזיס הישרדות RGC ו. אחד היתרונות של המודל הזה היא כי יש רמה גבוהה של שחזור עם שינויים מינימליים. <p class="jove_conte...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ASI Instruments</td>
<td>SAS-4100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>PZMIV-BS </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scalpel handle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools </td>
<td>10003-12 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scalpel Blades #15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools </td>
<td>10015-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microdrill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools </td>
<td>18000-17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools </td>
<td>12050-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools </td>
<td>16144-13</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools </td>
<td>11252-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company </td>
<td>88400</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gauze sponges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Depot</td>
<td>674889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorochrome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>39286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alcohol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>459844</td>
<td>70%</td>
</tr>
<tr>
<td>H2O2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3410</td>
<td>3%</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

an optic nerve crush injury murine model to study retinal ganglion cell survival

פגיעה בעצב הראייה עלולה להוביל לניוון axonal, ואחריו מוות הדרגתי של תאים ברשתית הגנגליון (RGCs), שתוצאתה אובדן ראייה בלתי הפיך. דוגמאות של מחלות כאלה האדם כוללות נוירופתיה אופטית טראומטית ניוון עצב הראייה של גלאוקומה. הוא מאופיין על ידי שינויים טיפוסי בראש עצב הראייה, ניוון עצבי פרוגרסיבי אופטיים, ואובדן של תאים הגנגליון ברשתית, אם לא מבוקרת, מה שמוביל לאובדן ראייה ועיוורון. עצב הראייה למחוץ (ONC) פגיעה במודל עכבר הוא מודל חשוב מחלה ניסויית עבור נוירופתיה אופטית טראומטי, גלאוקומה, וכו &#39;במודל זה, למחוץ את הפגיעה בעצב הראייה מוביל הדרגתי אפופטוזיס בתאי הגנגליון ברשתית. מודל זה המחלה יכול לשמש כדי לחקור את התהליכים הכלליים מנגנוני מוות עצבי והישרדות, שהוא חיוני לפיתוח אמצעים טיפוליים. בנוסף, גישות תרופתי מולקולרית ניתן להשתמש במודל זה כדי לזהות ולבדוק ריאגנטים טיפולית פוטנציאל לטפל בסוגים שונים של נוירופתיה אופטית. כאן, אנו מספקים צעד אחר צעד הפגנה של (אני) תיוג Baseline מדרדר התאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ביום 1, (II) עצב הראייה למחוץ פגיעה בכל יום 4, (III) קציר רשתיות ולנתח הישרדות RGC ביום 11, ו - (IV) תוצאה נציג.

Watch this Scientific Journal Video about An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival at JoVE.com

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

פרוטוקול זה מראה כיצד retrogradely תווית בתאי הגנגליון ברשתית, וכיצד לאחר מכן לבצע פגיעה בעצב הראייה לרסק על מנת לנתח הגנגליון ברשתית בתא הישרדות אפופטוזיס. זהו מודל מחלה ניסויית עבור סוגים שונים של נוירופתיה אופטית, כולל גלאוקומה.

עצב הראייה קראש פגיעה דגם Murine לחקר הישרדות רשתית תא גנגליון

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

an-optic-nerve-crush-injury-murine-model-to-study-retinal-ganglion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

30.2K Views.  NIH. פרוטוקול זה מראה כיצד retrogradely תווית בתאי הגנגליון ברשתית, וכיצד לאחר מכן לבצע פגיעה בעצב הראייה לרסק על מנת לנתח הגנגליון ברשתית בתא הישרדות אפופטוזיס. זהו מודל מחלה ניסויית עבור סוגים שונים של נוירופתיה אופטית, כולל גלאוקומה.

Video: An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

הקלטת פוטנציאל עוררה חזותית במודל עכברוש של demyelination עצב אופטי הניסויי

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection is considered a useful and reproducible model. Compared with other optic nerve injury models used commonly for assessing secondary degeneration, e.g. complete optic nerve transection and optic nerve crush models, the partial optic nerve transection model is superior as it distinguishes primary from secondary degeneration in situ. Therefore, it serves as an excellent tool for evaluating secondary degeneration. This study describes a novel operative approach of partial optic nerve transection by directly accessing the area of the retrobulbar optic nerve through the orbital lateral wall of the eyeball. Moreover, we present a newly designed, low cost surgical instrument to assist with transection. As demonstrated by the representative results in distinguishing the boundary of primary and secondary injury areas, the new approach and instrument ensures high efficiency and stability of the model by providing adequate space for surgical operation. This in turn makes it easy to separate the meningeal sheath and ophthalmic vessels from the optic nerve before transection. An additional benefit is that this space-saving operative approach improves the investigators&#39; ability to administer drugs, carriers, or selective RGC tracers to the stump of the partially transected optic nerve, allowing the exploration of mechanisms behind secondary injury in RGCs, in a new way.

Secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. This study describes an innovative operative approach for partial optic nerve transection. The use of this space-saving operative approach extends the model's application range, and allows exploration of secondary injury mechanisms in RGCs in a new way.

חיתוך חלקי עצב הראייה אצל חולדות: מודל הקים עם גישה חדשה פעיל כדי להעריך משני ניוון של תאי גנגליון

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

Ethanol-Induced Cervical Sympathetic Ganglion Block Applications for Promoting Canine Inferior Alveolar Nerve Regeneration Using an Artificial Nerve

Polyglycolic acid collagen (PGA-C) tubes are bio-absorbable nerve tubes filled with collagen of multi-chamber structure, which consist of thin collagen films. Favorable clinical outcomes have been achieved when using these tubes for the treatment of damaged inferior alveolar nerve (IAN). A critical factor for the successful nerve regeneration using PGA-C tubes is blood supply to the surrounding tissue. Cervical sympathetic ganglion block (CSGB) creates a sympathetic blockade in the head and neck region thus increasing blood flow in the area. To ensure an adequate effect, the blockade must be administered with local anesthetics one to two times a day for several consecutive weeks; this poses a challenge when creating animal models for investigating this technique. To address this limitation, we developed an ethanol-induced CSGB in a canine model of long-term increase in blood flow in the orofacial region. We examined whether IAN regeneration via PGA-C tube implantation can be enhanced by this model. Fourteen Beagles were each implanted with a PGA-C tube across a 10-mm gap in the left IAN. The IAN is located within the mandibular canal surrounded by bone, therefore we chose piezoelectric surgery, consisting of ultrasonic waves, for bone processing, in order to minimize the risk of nerve and vessel injury. A good surgical outcome was obtained with this approach. A week after surgery, seven of these dogs were subjected to left CSGB by injection of ethanol. Ethanol-induced CSGB resulted in improved nerve regeneration, suggesting that the increased blood flow effectively promotes nerve regeneration in IAN defects. This canine model can contribute to further research on the long-term effects of CSGB.

We evaluated the effect of cervical sympathetic ganglion block on nerve repair using artificial nerve conduits. Male beagle dogs were each implanted with an artificial nerve across a 10-mm gap in the left inferior alveolar nerve; left cervical sympathetic ganglion was blocked by injecting 99.5% ethanol via lateral thoracotomy.

אתנול-Induced את צוואר הרחם גנגליון סימפטי לחסום יישומים לקידום התחדשות הכלבי עצב מכתשי נחות באמצעות עצב מלאכותי

Polyglycolic acid collagen (PGA-C) tubes are bio-absorbable nerve tubes filled with collagen of multi-chamber structure, which consist of thin collagen ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In addition, in the research field of movement disorders, sciatic crush injury has been employed to trigger a dystonia-like phenotype in genetically predisposed DYT-TOR1A rodent models of dystonia. To achieve consistent, reproducible and comparable results after a sciatic nerve crush injury, a standardized method for inducing the nerve crush is essential, in addition to a standardized phenotypical characterization. Attention must be paid not only to the specific assortment of behavioral tests, but also to the technical requirements, the correct execution and consecutive data analysis. This protocol describes in detail how to perform a sciatic nerve crush injury and provides a behavioral test battery for the assessment of motor deficits in rats that includes the open field test, the CatWalk XT gait analysis, the beam walking task, and the ladder rung walking task.

We provide a protocol for the assessment of motor behavior via a behavioral test battery in rats after sciatic nerve crush injury.

הערכה רב-גורמית של התנהגות מוטורית בחולדות לאחר פציעת ריסוק עצבית סיאטית חד-צדדית

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury are essential for translating novel therapeutic strategies from rodent models to clinical application due to their closer similarities to humans in size and anatomy. Here we describe some in vivo methods to evaluate the function and structure of the retinal ganglion cells (RGCs) and optic nerve (ON) in large animals, including visual evoked potential (VEP), pattern electroretinogram (PERG) and optical coherence tomography (OCT). Both goat and non-human primate were employed in this study. By presenting these in vivo methods step by step, we hope to increase experimental reproducibility among different labs and facilitate the usage of large animal models of optic neuropathies.

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

Here we demostrate several in vivo tests (flash visual evoked potential, pattern electroretinogram and optic coherence tomography) in goat and rhesus macaque to understand the structure and function of the optic nerve and its neurons.

ב-Vivo שיטות להערכת תפקוד ומבנה תאי גנגליון רשתית ועצבי הראייה בבעלי חיים גדולים

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury ...