המחברים מבקשים להודות Zoiray טכנולוגיות בע&quot;מ, שותף שיתוף חסות ומסחור, על תמיכתה.

1. הכנת התשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל שכבות סיליקון SiO 2 מצעים עם עצמי adsorbing copoly (DMA-NAS-MAPS): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה קופולימר, המבנה הכימי, ואת תהליך ציפוי מתפרסמים: G. Pirri, פ Damin, מ Chiari, א Bontempi, LE Depero. אפיון ציפוי adsorbed פולימריים עבור שקופיות DNA microarray זכוכית. אנאלי. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקיצור, להכין פתרון פולימר ידי הוספת 100 מ&quot;ג של פולימר 5 מ&quot;ל מים (די) deionized ולהוסיף 5 מ&quot;ל של אמוניום סולפט 40% שומן רווי ((NH 4) 2SO 4) פתרון להגיע הריכוז הסופי של 0.92 מ &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבבי לצלול בתמיסה למשך 30 דקות על שייקר ולאחר מכן לשטוף היטב במים DI. יבש ביסודיות עם ארגון / N 2 גז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבבי אופים בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות פולימר מצופה מצעים / שבבי בסביבה יבשה (ייבוש ואקום) לתקופה של עד 3 חודשים עד איתור הליך בדיקה. </li></ol> 2. הכנת מערך בדיקה: נוגדנים, אנטיגנים, ss / dsDNA, RNA וכו &#39; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל בדיקה (ים) הריכוז המתאים המאגר הרצוי. צעד זה יכול להיות להשתנות במידה ניכרת, אבל ניסוי טיפוסי מנצל אנטיגן או IgG בריכוז של 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(טווח של 0.1 -1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) ב-pH 7.4 ≈. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום פתרונות 96 - או 384 גם צלחת (או צלחת מקור סטנדרטי עבור הצופה בשימוש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת פרמטרים תצפית עבור מערך מודפס הרצוי: לקבוע את הפרמטרים אכון מתאים השטח פתרונות בשימוש (לשכון פעמים, מהירויות גישה וכו &#39;). לקבוע את מספר משכפל של כל תנאי לכל הרשת, פריסת הרשת, מספר רשתות לשכפל, ואת המיקום הרצוי תצפית על השבב. מצעים המקום ואת צלחת מקור במקומות המתאימים, ודא בקבוקי פסולת אספקת מוכנים, ומתחילים לרוץ ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תצפית הוא סיים מצעים מקום בסביבת לחות גבוהה הלילה (4-18 שעות) כדי לאפשר תהליך immobilization ואת שחרור משרות כדי להמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מצעים: למקם אותם את הפתרונות הבאים במשך שלוש דקות במשך שלושה שוטף נפרדים: PBS עם Tween 0.1% (PBST), PBS, ו deionized סוף סוף (DI) מים. בהתאם לסוג הניסוי (רטוב לעומת יבש), לייבש את שבב ביסודיות עם גז ארגון ולהתחיל הדגירה או למקם את שבב בתא תזרים ולהרכיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל הנותרים NHS קבוצות על פני השטח קופולימר על ידי השריית שבבי בתמיסה 50 מ&quot;מ של ethanolamine עם pH 7.4 המותאמת במשך 30 דקות תוך כדי בצלחת שייקר. המתחם העיקרי אמין המכילים כגון hydroxylamine או טריס יכול לשמש גם, כל עוד הפתרון מוכן בטוח לשימוש עם חלבונים. לשטוף ביסודיות את הפתרון באמצעות שחרור משרות PBS מים אז די. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונלי (תלוי בכימיה את פני השטח להיות מועסק): משטח בלוק באמצעות פתרון של BSA, קזאין, או חלב rehydrated במשך 30 דקות. עבור כימיה של פני השטח הנוכחי פולימריות כי אנו משתמשים, אנחנו לא לבצע שלב זה כמו עמוד השדרה פולימר פעולות כדי למנוע הלא ספציפית מחייב חלבון. </li></ol> 3. נתונים נוהל רכישה דגירה: פורמט Endpoint <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון יעד של עניין למאגר הרצוי. הנה, זה יהיה פתרון של הריכוז המתאים של Anti-BSA ב PBS (לשעבר: להפוך 1-10 מ&quot;ל של 10 ng / mL פתרון של Anti-BSA ב PBS). כמו כן, ודא שיש כמות שווה של המאגר (ללא מטרה) עבור הדגירה הביקורת השלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מראה סיליקון לסרוק לנרמול כל הנתונים שנאספו לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את מערך בדיקה מוכן עם מערכת IRIS לפני שלב הדגירה כדי לקבוע את גובה אופטי הראשונית (מסה) במקום אחד. זה יאפשר ניתוח נכון של שינויים המונית על פני השטח, כלומר את רמת מחייב, לאחר דגירה. הנה כמה פרמטרים יותאם עבור הניסוי הנוכחי, כגון זמן חשיפה, שדה הראיה, תוך התמקדות משגשגת, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול שבב (ים) בתמיסה מוכנה שעה 1 על צלחת שייקר. זמן הדגירה יכול להשתנות במידה ניכרת בהתאם לרמת של התססה, ריכוז היעד להתגלות, מאפייני התחבורה של התא זרימה (אם מצב בזמן אמת איתור נמצא בשימוש), את הזיקות של זוג יעד-החללית, וכו &#39; . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לחזור על התהליך המתואר בשלב לשטוף 2.5) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את מערך בדיקה אותו באמצעות מערכת IRIS ולקבל שלאחר הדגירה תמונות להשוואה לפני הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבור שלבי הדגירה שונה אם יש צורך, למשל בפורמט כריך assay שבו נוגדן משני נמצא בשימוש. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את התמונות שנאספו עבור כל סריקה IRIS (רצף של תמונות אינטנסיביות), באמצעות תוכנה שפותחה במעבדה הפרוהדוצ&#39;ה דימוי של מערך בדיקה המכיל מידע עובי אופטי. ניתוח איכותי ומהיר של הכריכה יכול להתבצע על ידי הפחתת (רשום) שלאחר מראש דגירה תמונות. עקידת יופיעו כשינוי עוצמת באותם מקומות שבהם נצפו שינויים המונית. לניתוח כמותי, לקבוע צפיפות המסה של כל נקודה לעומת הרקע ידי ממוצעים מידע עובי אופטי עבור כל פיקסל בתוך נקודה ו חיצוני annulus של המקום ולעשות השוואה ישירה של שני האזורים הללו. </li></ol> 5. נציג תוצאות: איור 1 מציג דוגמה סכמטית את המצע שכבתית Si-IRIS SiO 2 הבחין עם מגוון נוגדנים נציג. האנסמבל כל נוגדן הוא הבחין לשכפל עם סגוליות עבור epitope שונה המיקוד חלבונים שונים. שני וירוסים שונים, כל חלבון נגיפי מיוצגים מטרות למשל. נוגדנים שליטה שלילי תלוי assay וניתן הלא ספציפית ו / או וירוס ספציפי. איור 2 מראה את הכריכה של אלבומין בסרום אדם (HSA) נוגדנים ספציפיים למערך של הבחין HSA ו הארנב IgG (שליטה) כתמים. כפי שניתן לראות כאן, לאחר הולם וקביעת האופטי עוביים של תמונות לפני ואחרי, דגירה, התמונה את ההבדל עבור מערך מחייב ניתן ליצור איכותית להעריך מחייב. ניתוח כמותי מגלה כי 2.05 ו - 0.13 ננומטר מתכוון לשנות את גובה אופטי נצפתה עבור HSA ו IgG ארנבת נקודות, בהתאמה, עבור ריכוז אנטי HSA דגירה של 500 ng / mL. איור 3 מראה מדידה IRIS התלות פרווה חלבון מחייב ריכוז חלבון באורך dsDNA oligomer. הגרף למעלה מראה מוחלט מדידות גובה אופטי הראשוני משותק בדיקה לגבהים oligomer שלאחר הדגירה מחייב פרווה. הגדלת הריכוזים של פרווה (50, 100, 200 ננומטר) הביא מחייב עלה ל בדיקות דנ&quot;א. אורכו של oligomers גם משפיע מחייב פרווה עם רצפים יותר וכתוצאה מכך מחייב יותר. הנה, ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת מן הממוצע. העלילה התחתונה מראה מחושב חלבון פרווה dimer מחייב לכל גדיל dsDNA. דימר מחייב הוגדל משמעותית בריכוז החלבון פרווה של 200 ננומטר המצביע על רמה גבוהה של הכריכה הלא ספציפית. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סכמטי של מערך דוגמה בדיקה משמש בדרך כלל בניסוי לגילוי וירוסים ספציפיים מרכיבים נגיפיים באופן multiplexed עם מערכת IRIS. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Post-הדגירה תמונה ההבדל עבור המחייב של האדם אלבומין בסרום נוגדנים ספציפיים כדי הבחין HSA שנאספו במערכת ללא תווית זו בריכוז של 500 ng / mL. צפיפות המסה ביולוגי עבור כל נקודה נקבע לפי ממוצע של מידע עובי אופטי בתוך נקודה ואז להשוות את זה עם ממוצע של annulus סביב המקום המייצג את הרקע. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. מגרש של נתונים מחייב חלבון אינטראקציות עם פרווה הבחין פעמיים תקועים oligomers עם רצף קונצנזוס ידוע מבוסס על אורך oligomer, מיקומו של רצף קונצנזוס בתוך oligomer, ואת ריכוז החלבון פרווה. מידע על הסכום המוחלט של חלבון פרווה מחויב כל רצף הבחין (למעלה) ניתן להשתמש כדי להעריך את מספר הדימרים פרווה מחויב כל סוג של oligomer (התחתון).

<ol>
	<li>&#214;zkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications.">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li><li>&#214;zkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches.">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li><li>&#214;zkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed,+high-throughput,+label-free,+and+dynamic+biosensing+platform.">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li><li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., &#214;zkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging.">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפלטפורמה IRIS היא מערכת פשוטה ומהירה לשימוש לאיסוף תפוקה גבוהה הנתונים המחייבים בפורמט microarray. עד קוולנטית משתק שונה בדיקות תפקודי חלבון או דנ&quot;א על ​​משטח, אנטיגנים יעד / סמנים ביולוגיים / וכו &#39;. ניתן ללכוד מן הפתרון, כמו immunoassay. מדידה של האינטראקציות הללו על תנאי בדיקה נקודת הסיום או בזמן אמת פורמט עם מערכת IRIS מאפשרת למידע רגיש מאוד כמותי להיות שנאספו במשך כל האינטראקציה. הניסוי נציג מפורט כאן הוא רק דוגמה אחת של סוגי אינטראקציות כי ניתן ללמוד עם טכניקה זו. איתור של גורמי שעתוק, אנטיגנים נגיפיים, ווירוסים כל הודגמה בעבר מייצג רק כמה דוגמאות של סוגי ניתוחים כי IRIS יכול לטפל בקלות.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות הסיליקון עם 500 ננומטר של דו תחמוצת הצורן תרמית מבוגר, עמק הסיליקון Microelectronics, סדר מותאם אישית <li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבקת אמוניום סולפט, סיגמא אולדריץ חתול. # A5132 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) להתרכז מוכן 10X, חתול פישר סיינטיפיק. # BP665-1 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים אנושיים סרום אלבומין (Anti-HSA), סיגמא אולדריץ חתול. # A0433 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> האדם בסרום אלבומין (HSA), סיגמא אולדריץ חתול. # A9511 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארגון או חנקן הגז (גבוהה במיוחד טוהר), חתול Airgas. # # AR UHP300 או NI UHP300 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי, 60 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ, חתול פישר סיינטיפיק. # 0875713A <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Scienceware ® ואקום ייבוש, סיגמא אולדריץ חתול. # Z119016 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge צינורות, חתול פישר סיינטיפיק. # 05-408-120 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> 96, גם צלחות, מחייב התא נמוכה, Nalgene חתול Nunc הבינלאומי. # 145399 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> BioOdyssey הקליגרף MiniArrayer, Bio-Rad <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tween-20, סיגמא אולדריץ # P1379 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ethanolamine, סיגמא אולדריץ # 398136 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hydroxylamine, חתול Thermo Scientific. # 26103 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> רב תכליתיים הכתף, Thermo Scientific (Barnstead בינלאומי), מודל # 2314, חתול. # 2314Q <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Retiga מצלמה 2000R, חתול QImaging. # 01-RET-2000R-FM-12 <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקור תאורה AcuLED, PerkinElmer, סדר מותאם אישית <li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבים אופטיים (עדשות, מטרות, פתחים, מסילות, הודעות וכו &#39;), Thorlabs </ol>

biomolecular detection employing the interferometric reflectance imaging sensor (iris)

מדידה רגישה של אינטראקציות biomolecular יש להשתמש בשדות בתעשיות רבות כגון ביולוגיה בסיסית מיקרוביולוגיה, ניטור סביבתי / חקלאות / biodefense, nanobiotechnology, ועוד. עבור יישומים אבחון, מעקב (גילוי) נוכחות, היעדרות, או ביטוי נורמלי של סמנים ביולוגיים או proteomic גנומית ממוקד נמצאו בדגימות המטופל יכול לשמש כדי לקבוע גישות טיפוליות או יעילות הטיפול. בזירה מחקר, מידע על זיקות ספציפיות ו מולקולרית שימושיים מלא ואפיון מערכות תחת חקירה. רבים מן המערכות הקיימות מועסקים לקבוע ריכוזים מולקולריים או זיקות מסתמכים על השימוש בתוויות. דוגמאות של מערכות אלה כוללות immunoassays כגון assay האנזים צמוד immunosorbent (ELISA), שרשרת התגובה פולימראז (PCR) טכניקות, ג&#39;ל אלקטרופורזה מבחני, ו ספקטרומטריית מסה (MS). באופן כללי, תוויות אלו ניאון, רדיולוגי או colorimetric בטבע מחוברים באופן ישיר או עקיף למקד המולקולרי של עניין. למרות השימוש בתוויות מקובל ויש לו כמה יתרונות, יש חסרונות אשר מגרה את התפתחות ללא תווית שיטות חדשות למדידת האינטראקציות הללו. חסרונות אלה כוללים היבטים מעשיים כגון עלות assay מוגברת, מגיב תוחלת החיים ודאגות, השימושיות אחסון בטיחות, בזבוז זמן ומאמץ תיוג, ולהבדלים בין חומרים כימיים שונים עקב תהליכי תיוג או תוויות עצמם. על בסיס מחקרים מדעיים, שימוש בתוויות אלה יכולים גם להציג את הקשיים כגון חששות עם אפקטים על פונקציונליות חלבון / מבנה בשל נוכחותם של תוויות המצורפת וחוסר היכולת למדוד ישירות את האינטראקציות בזמן אמת. מוגש כאן הוא השימוש biosensor ללא תווית חדשה אופטי ניתנת microarray מחקרים, הגדיר את ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS), עבור גילוי חלבונים, DNA, החומר antigenic, פתוגנים שלם (virions) ו חומר ביולוגי אחר. המערכת IRIS הוכח שיש רגישות ודיוק גבוה, reproducibility עבור אינטראקציות שונות biomolecular [1-3]. היתרונות כוללים הדמיה זמנית יכולת, בזמן אמת יכולות המדידה הסיום, ועוד תפוקה גבוהה תכונות כגון צריכת מגיב מופחת וירידה פעמים assay. בנוסף, הפלטפורמה IRIS הוא פשוט לשימוש, דורש ציוד יקר, מנצל מבוססי סיליקון מוצק assay רכיבים שלב מה שהופך אותו תואם הרבה גישות כימיה העכשווית פני השטח. כאן, אנו מציגים את השימוש במערכת IRIS של הכנת מערכי בדיקה ומדידה של דגירה יעד מחייב ניתוח של התוצאות בפורמט נקודת קצה. מערכת מודל יהיה ללכוד היעד של נוגדנים ספציפיים אשר אלבומין בסרום אדם (HSA) על HSA-הבחינו מצעים.

Watch this Scientific Journal Video about Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS at JoVE.com

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

כמותי, תפוקה גבוהה, בזמן אמת, וכן ללא תווית זיהוי biomolecular (דנ&quot;א, חלבונים, וכו &#39;) על SiO<sub&gt; 2</sub&gt; משטחים יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקה פשוטה interferometric אשר מסתמכת על תאורת LED, רכיבים אופטיים מינימלית, מצלמה. ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS) הוא זול, פשוט לשימוש, והוא מקובל microarray פורמטים.

Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

14.5K Views.  Boston University. כמותי, תפוקה גבוהה, בזמן אמת, וכן ללא תווית זיהוי biomolecular (דנ"א, חלבונים, וכו ') על SiO 2 משטחים יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקה פשוטה interferometric אשר מסתמכת על תאורת LED, רכיבים אופטיים מינימלית, מצלמה. ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS) הוא זול, פשוט לשימוש, והו...

Video: Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

לוקליזציה וכימות יחסית של פחמן בתאים עם Multispectral הדמיה תזרים cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in unstructured environments. At the same time, new procedures and techniques have been developed to reduce the invasiveness of surgical operations. Minimally Invasive Surgery (MIS) has been successfully employed for abdominal interventions, however standard MIS procedures are mainly based on rigid or semi-rigid tools that limit the dexterity of the clinician. This paper presents a soft and high dexterous manipulator for MIS. The manipulator was inspired by the biological capabilities of the octopus arm, and is designed with a modular approach. Each module presents the same functional characteristics, thus achieving high dexterity and versatility when more modules are integrated. The paper details the design, fabrication process and the materials necessary for the development of a single unit, which is fabricated by casting silicone inside specific molds. The result consists in an elastomeric cylinder including three flexible pneumatic actuators that enable elongation and omni-directional bending of the unit. An external braided sheath improves the motion of the module. In the center of each module a granular jamming-based mechanism varies the stiffness of the structure during the tasks. Tests demonstrate that the module is able to bend up to 120&#176; and to elongate up to 66% of the initial length. The module generates a maximum force of 47 N, and its stiffness can increase up to 36%.

This paper describes the design and fabrication of a soft unit for surgical manipulators. The base module includes three flexible fluidic actuators to achieve omnidirectional bending and elongation, and a granular jamming-based mechanism to enable stiffness control. A complete mechanical characterization is also reported.

עיצוב וייצור של יחידת אלסטומרי לרובוטים מודולרי רך בכירורגיה פולשנית

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

סינתזה מיקרוגל מונחה של תחמוצת ברזל חלקיקים עבור איתור מהיר של טרשת עורקים

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

השימוש β-lactamase מבוססי ביוסנסור Conductimetric Assay לזהות אינטראקציות למערכות ביולוגיות

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab and industrial scale. However, due to its toxicity and flammability, there is a desire to avoid methanol while maintaining the high productivity of P. pastoris. Small scale bioreactor cultivations (0.5-5 L working volume) are commonly used to evaluate a strain and its protein production characteristics since microscale cultivation in deep well plates can be hardly controlled or relies on expensive equipment. Furthermore, traditional protocols for the cultivation and induction of P. pastoris were established for constitutive expression or methanol induction and so far, no reliable protocols were described to screen P. pastoris expression strains with derepressible promoters in (controlled and monitored) parallel cultivations. To simplify such initial cultivations to characterize and compare new protein production strains, we established a simple shake flask cultivation system for methanol free expression that simulates bioreactor conditions including a constant slow glycerol feed and online monitoring, thereby coming closer to the real conditions in bioreactors compared to mostly applied small scale batch cultivations. To drive recombinant protein expression in P. pastoris, the carbon source repressed promoters PDC and PDF were applied. Polymer discs with embedded carbon source, releasing a constant amount of glycerol, assured a feed rate delivering the necessary energy for maintaining the promoters active while keeping the biomass generation low.

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

This method for the first time describes reliable experimental procedures for efficient inducible methanol-free recombinant protein production in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), employing the carbon source regulated promoters PDCand PDF in small scale experiments while cultivation parameters can be monitored online, and a constant glycerol feed is applied.

ביטוי עצמאי מתנול Pichia Pastoris דה-דיכוי בטכנולוגיות

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

הדמיה אינטגרין מתח וכוח הסלולר ברזולוציה כחיוניים עם חיישן המתח אינטגרטיבית

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

הערכה של התנהגויות פוטוסינטתיים על ידי מדידות סימולטני של השתקפות עלה וניתוחים כלורופיל פלואורסצנטית

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...