עבודה זו נתמכה על ידי הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס R35GM124868 ועל ידי אוניברסיטת דיוק.

1. הגדרת פריסת ויישור
<ol>
	<li>התקנה של collimation של עירור מעקב בלייזר<ol>
		<li>מוספית הלייזר אל השולחן אופטי בעזרת הר הבית בנוי. ההר הוא צלחת אלומיניום פשוטה עם הרכבה חורים בראש לייזר לבין הטבלה אופטי. הלייזר צריך להיות מחובר היטב להר מתכת יציבות, פליטת חום. לעבודה זו, השתמש 488 ננומטר לייזר מצב מוצק לתאורת (איור 1), למרות שניתן לבחור את אורך הגל כדי שיתאימו fluorophore מסוים או התנסה. גורם קריטי היא אורך הגל של הלייזר מתאים את טווח עבודה 2D-EOD, אשר נקבעת בעיקר על ידי ללוחית הגל בין deflectors שני (איור 1: W2). 488 ננומטר לייזר יכולים להלהיב ביעילות את ירוק או צהוב חלבון פלואורסצנטי (GFP/YFP), אשר נפוץ תגיות פלורסנט בניסויים תא חי.</li>
		<li>להתאים את גובה קרן הלייזר ואת הכיוון באמצעות זוג מראות מבודד (איור 1: מ'). לוודא קרן הלייזר הוא מקביל הטבלה אופטי וכוונן אותו לגובה המתאים. הערה: הגובה צריך להיבחר מבוסס על פלטפורמת מיקרוסקופ. הגובה הזה צריך להישמר כל מראות עוקבות בשימוש פרוטוקול זה, למרות שזה לא יצוינו במפורש.</li>
		<li>Collimate את הקורה עם זוג עדשות (איור 1: L1 ו- L2). אורכי מוקד של עדשות צריך להיבחר בקפידה כדי להימנע לייזר במקום להיות ייחתך על ידי הצמצם של 2D-EOD. מסיכה מתבטא על ידי שינוי הצורה קרן לייזר לאחר שחצה 2D-EOD. איכות collimation כאן חשוב מאוד כי סטיות להיות מוגבר על ידי עדשות עוקבות, כל סטייה יחריף את הביצועים הטיה 2D-EOD. באופן אידיאלי, collimate את הקרן על ידי התמקדות הקורה לנקודה בגובה לפחות 20 מ' משם.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>מקום הקדמוניות (איור 1: PH) בגודל המתאים על המוקד של העדשה collimation הראשון (איור 1: L1).<ol>
		<li>לבחור pinhole בגודל מתאים. גודל חריר יכולה להיבחר לפי החישוב הבא: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> איפה λ הוא אורך הגל של הלייזר, f הוא אורך המוקד של העדשה הראשונה ו- D הוא הקוטר קרן קלט.</li>
		<li>לטעון את חריר על הבמה תרגום 3D כך זה יכול להיות ממוקם בדיוק על המוקד של העדשה collimation הראשון.</li>
		<li>להתאים את מיקום חריר. הצב מד כוח לייזר לאחר חריר ולהתאים את העמדה חריר XYZ כדי למקסם את המדידה של מד הכוח. אם נוצרת טבעת עקיפה, לחסום אותו עם קשתית הממוקמים לפני 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>התקנה של Glan-תומפסון מקטב<ol>
		<li>לשים את מקטב Glan-תומפסון (איור 1: GP) לאחר העדשה collimation השני (איור 1: L2) כדי לנקות את קיטוב של קרן לייזר. לסובב את מקטב למצוא שידור מרבי עם מד הכוח.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>התקנה של EODs<ol>
		<li>השתמש 2 EODs (איור 1: EOD1 &#38; EOD2) כדי להסיט את הלייזר בכיוונים X ו- Y. הגדל את השידור לייזר על-ידי התאמת yaw, זפת, גובה כל EOD.</li>
		<li>יישר את EODs שני ביחס אחד לשני באמצעות הסמן יישור המסופקים על ידי היצרן בצד כל מטה הטיה.</li>
		<li>להחיל תבנית בדיקה הבקר של 2D-EOD לבחון את הפלט של EOD. זה יכול להיות הסיור של האביר (איור 2) דרך של FPGA המתוארים להלן או גל סינוס פשוטים הניתנים על ידי גנרטור פונקציה. עבור הביצועים הטובים ביותר, סטיה על ידי כל מטה הטיה צריך להיות מקביל כיוון X או Y אלמנט פייזו nanopositioner. כיוון זה מוכתב על ידי כיוון זוויתי deflectors על הציר שידור. כדי לסובב את כיוון סטיה מבלי להזיז את 2D-EOD, הנח מנסרה יונה לאחר 2D-EOD ליישור הצירים סטיה אלמנט פייזו nanopositioner בצירים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>התקנה של לוחית חצי-גל<ol>
		<li>מניחים צלחת חצי-גל (איור 1: W1) בין מקטב Glan-תומפסון (איור 1: GP) ו- 2D-EOD כדי ליישר את הלייזר נכנסות לשגר קיטוב עם הצירים הסטה של 2D-EOD. הצב עדשה מוקד הרבה זמן (300 מ מ) לאחר 2D-EOD ולמקם מצלמה sCMOS על המוקד לייזר. בשלב הבא, הפעל את 2D-EOD ליצירת הסיור של האביר המתוארים להלן (איור 2). סובב את לוחית חצי-גל עד הפצה לייזר אחיד מרובע נצפית על המצלמה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>התקנה של קרן expending עדשה זוג וזוג עדשה ממסר<ol>
		<li>במקום זוג עדשות (איור 1: L3 ו L4) לאחר 2D-EOD כדי להרחיב את הקורה כדי למלא את הפתח האחורי של העדשה אובייקטיבי (איור 1: OL), עוד זוג עדשות (איור 1: L5 ו L6) כדי ממסר מטוס מוקד כדי המטרה מיקרוסקופ. הקפד להשאיר מספיק מקום בין אלה שני זוגות עדשות כמו העדשה תג יותקן ביניהם בשלב מאוחר יותר.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>התקן את המסנן ודיקרואיק זוהר, מפצל קרן 10/90, מיקוד העדשה APD, המטרה עדשה, מסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית כדי להשלים את המעבר זיהוי.<ol>
		<li>התקנת את המסנן ודיקרואיק זוהר (איור 1: DC) כדי לשקף את הלייזר לעבר העדשה המטרה. יישר את הלייזר ללכת ישר דרך מרכז העדשה המטרה באמצעות שני קשתיות העין על העליון והתחתון של שפופרת בעדשה ארוכה.</li>
		<li>להתקין מפצל קרן 10/90 (איור 1: BS) על ידי איזה 10% של אור הוא בא לידי ביטוי עבור הדמיה המצלמה sCMOS (המתוארות להלן) ו 90% של כרטיסים דרך APD לצורך מעקב.</li>
		<li>יישר את APD. להתמקד הלייזר על גבי coverslip על ידי העדשה אובייקטיבי. להשתמש בהשתקפות. coverslip כדי ליישר רכיבים כל הזרם על ידי לשים את coverslip של המוקד אובייקטיבית ובדיקת האינטנסיביות של מדידה APD. לאחר המפצל קרן, להתקין את APD התמקדות העדשה (איור 1: L7) ואחריו את APD על הבמה תרגום תלת-ממד. מקם את העדשה כזה לייזר בהשתקפות. המטרה עובר דרך המרכז של העדשה.</li></ol></li></ol>ניתן למטב את המיקום APD על-ידי התאמת התנוחה התלת-ממד כדי להגדיל את העוצמה של השתקפות לייזר על coverslip. המיקום APD הוא במיקום האופטימלי כאשר מהלך של העמדה גלאי בכל כיוון פוחתת עוצמת.
		<li>התקנת מסנן פליטה של זריחה longpass (איור 1: F) לפני המפצל קרן כדי להסיר את האור המוחזר, פזורים.</li>
	
	
	<li>התקנה של העדשה תג<ol>
		<li>מקם את העדשה תג בין שני צמדי של עדשות (בין איור 1: L4 ו- L5) כפי שהוזכרו קודם, המוצגת באיור1. התאם את yaw, זפת, גובה, והמיקום לרוחב כך הקורה בניצב עובר דרך העדשה מרכז של תג.</li>
	</ol>
	</li>

2. הכנת הדוגמא.
<ol>
	<li>הכנה חלקיקים קבוע<ol>
		<li>לדלל 190 חרוזים פלורסנט nm ל ~ 5 × 108 חרוזים/מ"ל ב- PBS. להוסיף 400 פתרון חרוזים µL עלו על coverslip הר על המחזיק לדוגמה של השלב פיזואלקטריים (הנפח של חרוזים יהיה תלוי בעל מדגם; הקוטר של התא בעל הדגימה המשמש כאן הוא 18 מ מ). עבור החרוזים המשמש כאן, PBS גורמת החלקיקים להפקיד על coverslip.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנה חלקיק נע חינם<ol>
		<li>לדלל 110 חרוזים פלורסנט nm ל ~ 5 × 108 חרוזים/mL במים DI. להוסיף 400 פתרון חרוזים µL אל coverslip והר אל בעל מדגם של השלב פיזואלקטריים.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. למטב מעקב פרמטרים
<ol>
	<li>סריקה סרוק חלקיקים קבוע<ol>
		<li>שים מדגם חלקיקים קבוע על המיקרוסקופ.</li>
		<li>הפעל את לייזר, בקר micropositioner, אלמנט פייזו nanopositioner בקר, בקר עדשה תג, ו EOD בקר. שימו לב כי הצו לא קריטי. להפעיל את nanopositioner piezo לולאה סגורה.</li>
		<li>סריקה סרוק את הדגימה ב XYZ באמצעות תוכנית מותאמת אישית הסריקה התוכנה (איור S3, התוכנה זמינה על פי בקשה מן המחברים), אשר נוהג 2D-EOD בסיור של אביר (איור 2), אוספת ספירות ממשטרת אלבוקרקי, מניע את piezo nanopositioner, ומבצעת חישוב מיקום (איור S2). גודל צעד הוא 40 ננומטר ואת טווח סריקה זה 2 מיקרומטר.<ol>
			<li>כדי למקם את coverslip על המוקד של המטרה, להסיר את המסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית ולהשתמש ההשתקפות של הלייזר מ coverslip כדי למקסם את עוצמת האות כ פונקציה של מיקום Z micropositioner. לאחר הנחת המדגם על המטוס מוקד, במקום לחזור למסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית.</li>
			<li>פתח את התוכנית סריקה. הגדר את טווח סריקה ואת גודל צעד על-ידי הקלדת המספר ב 'התחל', 'סיום', ו 'שלב'. תחילה הגדר טווח סריקה גדול וגודל צעד כדי לאתר חלקיק (למשל, 10 x 10 מיקרומטר טווח עם 200 ננומטר שלב גודל). לאחר מציאת החלקיק, לכווץ את טווח סריקה ולא להקטין את גודל הצעד (למשל, 2 x 2 מיקרומטר טווח עם 100 גודל צעד ננומטר). לחץ על לחצן 'סריקה' כדי לבצע סריקה סריקה תלת-ממד כדי למצוא את המוקד פלורסנט.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>תג עדשה הגדרות (ראה גם איור 3)<ol>
		<li>לחץ על התוכנה הבקרה של העדשה תג. לחץ על 'התחבר', 'הפעל' ברצף.</li>
		<li>כדי לשנות את שלב הפלט של האותות על ההדק, זה הכרחי לשנות את מצב הגורם המפעיל פלט. ראשית לשנות את המצב של 'RGB' 'Multiplane', אז תשני אותה בחזרה. עכשיו השלב יכול להיות שונה (איור 3b).</li>
		<li>הגדר שלב הפלט להיות 0 °, 90 ° ו- 270 מעלות. בעוד כל שלושה שלבי אשר מכסים את שלב החלל יכול לשמש, שלושת אלה מצויים לעבוד טוב מדעית (איור 3 c).</li>
		<li>בחר את הגדרת תדירות 68,500 Hz.</li>
		<li>את התדר האופטימלי זה לעתים קרובות צורך לשנות את טווח החיפוש תדר. לחץ על 'מתקדם', 'הגדרה'. שינוי ' מקס. Freq(Hz)' של העמודה 0 מ 70,000 הרץ 71,500 Hz. זה יכול להיות מותאם כדי שיהיה טווח תדר מתאים. לחץ על 'שמירת כיול', 'יציאה כיול' (דמות תלת-ממד).</li>
		<li>כדי להפוך את הכיול החדש יעיל, לעבור את התהודה בתדר אחר (לדוגמה, 189,150 Hz), ואחר כך הוא החליף בחזרה אל ההגדרה תדירות 68,500 Hz (איור 3e).</li>
		<li>לשנות את משרעת בהדרגה ל- 35%. לחץ על 'תנעלו תהודה'. לאחר התדירות נעול, לחץ על 'נעילת תהודה' (איור 3e). העדשה תג הוא מוכן להשתמש עכשיו.</li>
		<li>כדי לכייל, לשנות את הפרמטרים המשמשים הערכת לעשות את המיקום המשוער שווה למצב אמיתי, כפי שמוצג באיור 4e, פ קלט את טווח סריקה של x, y, z ולאחר מכן לחץ על 'סריקה' כפתור כדי לסרוק את הדגימה ב XYZ כדי להזיז חלקיק נע במקום לייזר. המיקום של החלקיק בעת דרך המוקד לייזר צריכים להסכים עם העמדה המשוערת של חלקיקים נקבע על ידי הלולאה הערכת מיקום (איור S1). הקשר בין מיקום משוער והמיקום אמיתי (איור 4 d) יכול להיות מופק תמונות מיקום משוער (איור 4f). אם אינך מסכים העמדות, התאם את הערכים של לייזר עמדה (ck) בשימוש הלולאה הערכת מיקום (איור S1).</li>
		<li>ליישר תג עדשה<ol>
			<li>כאשר הבקר עדשה תג מבוטל, הרסטר נסרקים חלקיקים תמונות (המתוארות להלן) נלקח לפני התקנת עדשה תג, לאחר התקנת עדשה תג צריך להיראות זהים. לאחר מכן, לבצע מחסנית פלורסנט חלקיקים Z סריקה על-ידי הזזת המטרה עם nanopositioner z כדי לכוונן את המיקום ואת זווית עדשה תג (איור 4). לכוון את המיקום של העדשה תג עד שיש לא להיסחף של תמונות של חלקיקים במישור XY לאורך בכיוון Z, אשר מושגת כאשר אין שינוי במצב XY של החלקיק כפונקציה של העמדה Z (איור 4 d). מערכת האיתור הוא מוכן לשימוש לאחר יישור של העדשה תג.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>התקנה של מצלמה sCMOS עבור ניטור חלקיקים<ol>
		<li>התקנת מצלמה sCMOS לדמיין חלקיקי בזמן שהם עוקבים. התקן את sCMOS רק לאחר כל הרכיבים של מערכת מעקב התקנה של אופטימיזציה.</li></ol></li></ol>לטעון מדגם קבוע חלקיקים פלורסנט אל המיקרוסקופ ולהפעיל את התוכנית מעקב כדי לנעול מחלקיק אחד באמצעי האחסון מוקד אובייקטיבית. לאחר מכן, התקן 100 מ מ אורך מוקד העדשה (איור 1: L8) ו- sCMOS. להתאים את המיקום sCMOS כך התמונה של החלקיק הוא מרוכז לנקודה הקטנים והחכמים.
	
	

4. מעקב בזמן אמת 3D אחר בחופשיות לשדר חלקיקים
<ol>
	<li>לשים ועשר ננומטר חינם הלאה חלקיקים לדוגמה המיקרוסקופ.</li>
	<li>הפעל לייזר, בקר מיקרו-positioner, אלמנט פייזו nanopositioner בקר, בקר עדשה תג ו EOD בקר. הפעל את nanopositioner piezo בלולאה פתוחה. להגדיר את התוכנה עדשה תג לפי שלב 3.2.</li>
	<li>לפתוח ולהפעיל את תוכנת מעקב (זמין על פי בקשה מן המחברים). להגדיר את המיקום שערוך פרמטרים לערכים שלהם ממוטבת, אשר נמצאו בסעיף 3.</li>
	<li>כדי למקם את coverslip על המוקד של המטרה, להסיר את המסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית ולהשתמש ההשתקפות של הלייזר מ coverslip כדי למקסם את עוצמת האות כ פונקציה של מיקום Z micropositioner. לאחר מציאת את coverslip, להגדיל את מיקום המוקד מיקרומטר 15 למקד את הלייזר הרחק את coverslip, בתוך תמיסת. המקום בחזרה את המסנן פליטת קרינה פלואורסצנטית.</li>
	<li>הגדר את קבועי שליטה נפרד. ניתן להגדיר את קבועי שליטה החל מ- ערך נמוך והגברת לאט עד ניתן לראות תנודות נתוני המיקום של החלקיק. פעם אחת הם נצפו תנודות, הגדר הקבועים שליטה 80% של הערך גורם תנודות. ערכים אופייניים יהיה סביב 0.012 לרווח XY' נפרד' 0.004 עבור זי 'נפרד רווח'.</li>
	<li>לקבוע את ספי מעקב ב- ' 'סף מסלול' ' 'המסלול מינימום' ולהתחיל את הניסוי מעקב על ידי לחיצה על 'חיפוש' ולעקוב ' אוטומטי '. הסף עבור מעקב אחר סיום מוגדר מעט גבוה יותר מאשר רמת רקע, הסף עבור מפעילה מעקב על שתי פעמים גבוה יותר מאשר את הרקע. . הנה, הסף עבור מפעילה מעקב 3 kHz והוא הסף לסיום המסלול 1.5 קילו-הרץ.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells.">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+(STED).">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li><li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell.">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles.">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems:+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy.">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).</li><li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+sizing+of+nanoparticles+using+three-dimensional+single-particle+tracking.">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li><li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles.">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li><li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+three+dimensional+tracking+of+a+single+nanoparticle+with+concurrent+spectroscopic+readouts.">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).</li><li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved,+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions.">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li><li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells.">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li><li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots.">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope.">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Characterization+of+the+Conformation+Fluctuations+of+Freely+Diffusing+DNA:+Beyond+Rouse+and+Zimm.">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li><li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

למרות סוגים רבים של חלקיק בודד 3D מעקב אחר שיטות שהתגלו בשנים האחרונות, חזקים מעקב בזמן אמת אחר דיפוזיה תלת-ממד במהירות גבוהה במחירים ספירה נמוכה פוטון עם הגדרת פשוטה הוא עדיין אתגר, אשר מגביל את תחולת ביולוגית חשובה בעיות. השיטה 3D-DyPLoT המתוארת בעלון זה מטפל פרוטוקול האתגרים הללו במספר דרכים...

הופעתה של טכניקות הדמיה מתקדמות פתח חלון כדי לראות יותר מפורט מבנה התופעות הסלולר, כל הדרך עד לשלב מולקולארי. שיטות כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)1,2,3, לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ (דקל)4,5,6,7 מובנה תאורה מיקרוסקופ (SIM)8,9,10,11, מגורה פליטה דלדול מיקרוסקופ (STED)12,13, 14 הגיעו רחוק מעבר למגבלת עקיפה כדי לספק פירוט חסרת תקדים לתוך המבנה והתפקוד של תאים חיים. עם זאת, הבנה מלאה של מערכות אלה איך להתנהג דורש מידע דינאמי, כמו גם מידע מבנית. השיטות סופר רזולוציה המפורטים לעיל כוללות פשרה בין רזולוציה מרחבית רזולוציה טמפורלית, הגבלת הדיוק טמפורלית שבה פתור תהליכים דינאמיים. שיטה אשר מספק דיוק מרחבית גבוהה והן רזולוציה טמפורלית היא RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. כאן, אנו לצייר הבחנה בין תלת-ממד מסורתי-SPT30 מסורתית RT-3D-SPT. 3D-SPT פשוט דורש זמן שורה של נתוני תמונה תלת-ממדית (אשר ניתן לרכוש גם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ epifluorescence בהתחשב התצורה הנכונה). ב- 3D-SPT מסורתיים, נקבעות את הקואורדינטות של החלקיק לאחר איסוף נתונים על ידי איתור החלקיק בכל אוסף תמונות ו שרשור את מיקומי אחסון רצופים כדי ליצור מסלול. לשיטות אלה, ברזולוציה הטמפורלית האולטימטיבי נקבעת לפי הקצב הדמיה הנפחי. עבור מיקרוסקופ קונפוקלי, זו בקלות בהיקף של שניות ועד עשרות שניות. על שיטות epifluorescence, שבו הנתיב אופטי הוא מניפולציה כך למידע המיקום צירית ניתן לחלץ, הפתרון זמני מוגבל בזמן חשיפה או readout המצלמה. שיטות אלה פלורסנטי מוגבלים בטווח שדרכן ניתן לאסוף מידע צירית, למרות התקדמות אחרונים בשלב המטוס פורייה מסכות עיצוב, אופטיקה אדפטיבית היא הרחבת טווחים אלה מיקרומטר 10 או31,עוד32 , 33 , 34.
לעומת זאת, RT-3D-SPT אין לסמוך על רכישת ערימה תמונה תלת-ממדית, מציאת חלקיקים לאחר מעשה. במקום זאת, מידע בזמן אמת מיקום מופק באמצעות גלאי בנקודה אחת, משוב מוחל באופן יעיל "נעל" החלקיק באמצעי האחסון המוקד של העדשה המטרה באמצעות שלב פיזואלקטריים מהיר. פעולה זו מאפשרת מדידה רציפה של המיקום של החלקיק מוגבל רק על-ידי כמה פוטונים ניתן לאסוף. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת חקירה ספקטרלי של החלקיק כפי שהוא נע על פני טווחים ארוכים. RT-3D-SPT בתוקף עבודות דומה מלכודת נטולת כוח אופטי עבור ננו אובייקטים, שבו החלקיק הוא ברציפות ובחן, למדוד בזמן אמת ללא צורך כוחות גדולים לייזר או אופטי כוחות. בהתחשב בכך RT-3D-SPT מספק אמצעי לחקירה מתמשכת של אובייקטים המתפשט במהירות (עד 20 מיקרומטר /s2)25,29 בתלת מימד-פוטון נמוך ספירת המחירים20,29, 35, הוא אמור לספק חלון לתוך מהיר או ארעי תהליכים ביולוגיים כגון תובלת המטענים תאיים, איגוד קולטן ליגנד הדינמיקות חוץ-תאי של virions יחיד. עם זאת, בשלב זה, היישום של RT-3D-SPT הוגבלה על קומץ קבוצות הפועלים לקידום טכנולוגיה זו.
מכשול אחד היא המורכבות של הפריסה האופטי הנדרש על-ידי שיטות RT-3D-SPT, אשר הן מגוונות. עבור רוב שיטות, המשוב אופטי מסופק על ידי שלב פיזואלקטריים. כמו חלקיקים גורם קטן התנועות ב X, Y או Z, המפרט של גלאי בנקודה אחת הם המרה לפונקציות שגיאה והאכילה ב במהירות גבוהה nanopositioner פיזואלקטריים, אשר פונים מהלכים הדגימה כדי לנטרל ביעילות התנועה של החלקיק, נועלים אותו במקום יחסית העדשה אובייקטיבי. כדי למדוד תנועות לפי מיקום קטן ב- X, Y ו- Z, או מספר גלאים (4 או 5 בהתאם ליישום)15,18,21 או כתמים עירור מרובים (2-4, יכול להיות מיושם התחתונה אשר אם הנעילה מגבר משמש כדי לחלץ את X ו Y מיקום באמצעות סיבוב של לייזר ספוט)25,28 מוחלים. החפיפה של כתמים מרובים פליטה וזיהוי להקשות ליישר ולשמור את המערכות.
במסמך זה, אנו מציגים שיטה מהירה מטרה נעולה 3D-SPT עם עיצוב אופטי פשוטה בשם 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT משתמש של 2D-EOD של תג עדשה36,37,38 להעביר באופן דינמי כתם הלייזר ממוקדת דרך נפח מוקד אובייקטיבית בקצב גבוה (50 קילוהרץ XY, 70 קילו-הרץ Z). שילוב של מיקום המוקד לייזר ואת זמן ההגעה של פוטון מאפשר המיקום התלת-ממדיים של החלקיק ואפשר להשיג במהירות אפילו במחירים ספירה נמוכה פוטון. 2D-EOD כונני המוקד לייזר של אביר סיור דפוס39 עם ריבוע בגודל של 1 x 1 מיקרומטר במישור X-Y, העדשה תג מעביר את המוקד לייזר לכיוון צירית עם מגוון של 2-4 מיקרומטר. מיקום החלקיק 3D מתקבל על מיקום אופטימיזציה שערוך אלגוריתם29,40 ב- 3D. השליטה של תלת-ממד דינמי נע לייזר ספוט, הפוטון סופר מן המפולת פוטודיודה (APD), חישוב מיקום החלקיק בזמן אמת, הבמה פיזואלקטריים משוב, הקלטה נתונים מבוצעים על מערך לתכנות שער שדה (FPGA).ב פרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבנות מיקרוסקופ 3D-DyPLoT שלב אחר שלב, כולל יישור אופטי, כיול עם חלקיקים קבוע, סוף סוף חופשי חלקיקים מעקב. בתור הדגמה, 110 nm חרוזים פלורסנט שהיו תחת מעקב ללא הרף במים דקות בכל פעם.
השיטה המתוארת במסמך זה הוא הבחירה האידיאלית עבור כל יישום שבו הצורך לפקח באופן רציף בדיקה פלורסנט מהיר-המעבר ברמות האור נמוכה, כולל וירוסים, חלקיקים של שלפוחית כגון endosomes. בניגוד לשיטות הקודמות, יש רק עירור יחיד, מסלול זיהוי יחיד, ביצוע יישור ותחזוקה פשוטה. יתר על כן, האזור זיהוי גדולה מאפשרת את המיקרוסקופ לאסוף בקלות במהירות לשדר חלקיקים, בעוד היכולת לעקוב אחר ברמות אות נמוכה (עד 10 קילו-הרץ) עושה בשיטה זו אידיאלי עבור יישומים תאורה29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1075">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">2D Electro-optic Deflector&#160;</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">M310A</td>
			<td style="width:541px;">2 required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Power supply for EOD</td>
			<td style="width:145px;">ConOptics</td>
			<td style="width:160px;">412</td>
			<td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">TAG&#160; Lens</td>
			<td style="width:145px;">TAG Optics</td>
			<td style="width:160px;">TAG 2.0</td>
			<td>Used to deflect laser along axial direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">XY piezoelectric nanopositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-PDQ275HS</td>
			<td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Z piezoelectric nanoposiitoner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">Nano-OP65HS</td>
			<td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Micropositioner</td>
			<td style="width:145px;">MadCity Labs</td>
			<td style="width:160px;">MicroDrive</td>
			<td>Used to coarsely position sample and evaluate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Objective Lens</td>
			<td style="width:145px;">Zeiss</td>
			<td style="width:160px;">PlanApo</td>
			<td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:145px;">PCO</td>
			<td style="width:160px;">pco.edge 4.2</td>
			<td>Used to monitor the particle&#39;s position</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">APD</td>
			<td style="width:145px;">Excelitas</td>
			<td style="width:160px;">SPCM-ARQH-15</td>
			<td>Lower dark counts beneficial</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Field programmable gate array</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">NI-7852r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Software</td>
			<td style="width:145px;">National Instruments</td>
			<td style="width:160px;">LabVIEW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Tracking excitation laser</td>
			<td style="width:145px;">JDSU</td>
			<td style="width:160px;">FCD488-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-150-A-ML</td>
			<td>L1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Pinhole</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">P75S</td>
			<td>PH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Glan-Thompson Polarizer</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">GTH5-A</td>
			<td>GT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Half-wave plate</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">WPH05M-488</td>
			<td>WP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-75-A-ML</td>
			<td>L3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-250-A-ML</td>
			<td>L4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Lens</td>
			<td style="width:145px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:160px;">AC254-200-A-ML</td>
			<td>L6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Dichroic Mirror</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">ZT405/488/561/640rpc</td>
			<td>DC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Fluorescence Emission Filter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">D535/40m</td>
			<td>F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">10/90 beamsplitter</td>
			<td style="width:145px;">Chroma</td>
			<td style="width:160px;">21012</td>
			<td>BS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">190 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/9942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">110 nm fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Bangs laboratories</td>
			<td>FC02F/10617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Powermeter</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">CMOS</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">DCC1545M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Iris</td>
			<td style="width:145px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:160px;">SM1D12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td style="width:145px;">Mad City Labs</td>
			<td style="width:160px;">RM21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

בזמן אמת חלקיק יחיד תלת מימדי מעקב (RT-3D-SPT) יש פוטנציאל לשפוך אור על תהליכים מהירים, 3D במערכות סלולריות. למרות שיטות RT-3D-SPT שונות יש כבר העלו בשנים האחרונות, מעקב אחר במהירות גבוהה 3D לשדר חלקיקים במחירים נמוכים פוטון הרוזן נשאר אתגר. יתר על כן, RT-3D-SPT setups הם בדרך כלל מורכבת וקשה ליישם, הגבלת שלהם יישום נרחב לבעיות ביולוגי. פרוטוקול זה מציג מערכת RT-3D-SPT בשם 3D דינמי פוטון לוקליזציה מעקב (3D-DyPLoT), אשר ניתן לעקוב אחר חלקיקים עם המתפשט במהירות גבוהה (עד 20 /s2מיקרומטר) במחירים ספירת פוטון נמוך (עד 10 קילו-הרץ). 3D-DyPLoT מעסיקה מטה הטיה אלקטרו-אופטיים 2D (2D-EOD), עדשה tunable אקוסטית הדרגתי (תג) בכונן יחיד ממוקד בלייזר במקום באופן דינמי ב- 3D. בשילוב עם אלגוריתם להערכת מיקום אופטימיזציה, 3D-DyPLoT יכול להינעל חלקיקים יחיד עם מהירות גבוהה ודיוק גבוהה לוקליזציה. בשל עירור יחיד והפריסה יחיד איתור נתיב, 3D-DyPLoT הוא קל להגדיר ועמיד. פרוטוקול זה דן כיצד לבנות 3D-DyPLoT צעד אחר צעד. ראשית, מתואר הפריסה אופטי. בשלב הבא, המערכת מכויל, אופטימיזציה על ידי סריקה לסריקת חרוז פלורסנט nm 190 עם nanopositioner פיזואלקטריים. לבסוף, להפגין יכולת זיהוי 3D בזמן אמת, 110 nm חרוזים פלורסנט מתבצע במים.

החלקיקים קבוע סריקה (איור 4), בחופשיות באמצעי 110 nm פלורסנט חלקיקים מעקב (איור 5) בוצעו בעקבות בפרוטוקול לעיל. חלקיק הסריקה בוצעה על-ידי הזזת והפוטונים nanopositioner ו- bin פיזואלקטריים בזמן בו זמנית חישוב של החלקיק מוערך בעמדה בכל נקודה הסריקה. התמו?...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

פרוטוקול זה פרטים הקמה ותפעול של מיקרוסקופ מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד מסוגל מעקב הננומטרי פלורסנט רגשים במהירויות גבוהות המפזרת, המחירים ספירה נמוכה פוטון.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  Duke University. פרוטוקול זה פרטים הקמה ותפעול של מיקרוסקופ מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד מסוגל מעקב הננומטרי פלורסנט רגשים במהירויות גבוהות המפזרת, המחירים ספירה נמוכה פוטון.

Video: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

באתרו מיקרוסקופיה לקביעת בזמן אמת של מורפולוגיה תא חד בBioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

ייצור מצופים Nafion, מופחתת גראפן תחמוצת/Polyaniline Chemiresistive חיישן על צג ה-pH בזמן אמת במהלך התסיסה מיקרוביאלי

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...