מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר קטן חדשנות עסקית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIAID, 1R43AI082698-01) ו - USDA המכון הלאומי של המזון והחקלאות (NIFA, 2009-33610-20028).

1. י &#39; pestis חיסון צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak י pestis A1122 (BeiResources # NR15) תרבויות המניות על לוריא-Bertani (LB) אגר (מילר). השתמש בטכניקה סטרילית לבצע את כל י pestis מניפולציות בסוג הכיתה השנייה הקבינט. biosafety י pestis A1122 הוא רמה biosafety (מנהלת הליגה) 2 נשלל זן סוכן לבחור. היא חסרה גם את צמד 75 kb סידן נמוכה (LCR) בתגובה ארסיות פלסמיד, ואת מוקד PGM הנדרשים ארסיות. לגדל י pestis על 28 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות בטמפרטורה סטטית מבוקרת האוויר בחממה. קצב הגידול של י &#39; pestis איטי עם זמן דור של 1.25 ש 9. </li></ol> 2. Y. pestis נוזלי מדיה חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת י &#39;אחת pestis המושבה לתוך צינור סטרילי 17 x 100 מ&quot;מ תרבות המכילה 2 מ&quot;ל של מרק LB באמצעות לולאה סטרילי חיסון מתכת. בחר מושבת כי הוא אחיד בגודל, מעיד על במושבות אחרות, מופרדת בבירור משאר המושבות על הצלחת. צינור וורטקס בקצרה ולגדול תרבות ב 28 מעלות צלזיוס למשך כ 20 שעות בתוך חממה רועד (225 סל&quot;ד). </li></ol> 3. י &#39; תוצאה pestis, phage בנוסף כתב, זיהוי bioluminescent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את י &#39;בן לילה pestis 1:20 התרבות לתוך מרק LB טרי 50 מ&quot;ל בז צינור (למשל, 500 μL של תאים לתוך 9.5 מ&quot;ל של מדיום) ו לגדול ב 28 ° C עם רועד (225 סל&quot;ד). לגדול עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (600) של 0.2 הוא הגיע (כ 5 שעות). תאים ומתרחב עדיפים לגילוי מאז היכולת של הפאג כדי transduce תגובה bioluminescent קשורה לקיומה והתאמה של החיידק המארח. עם זאת, מערכת הגילוי הוכח להיות תואם עם תאים שנקטפו בכל שלבי מחזור צמיחה 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את המצע הדרוש התגובה bioluminescent על ידי הכנת 2% n-decanal פתרון. מערבבים 200 μL של n-decanal עם 9.8 מ&quot;ל של מרק LB. וורטקס בתוקף במשך 5 s. ראש luminometer microplate מזרק עם 2 מ&quot;ל של הפתרון n-decanal 2%. שנקבע מראש luminometer כדי autoinject 67 μL הפתרון decanal כדי microplate כל טוב ומיד לקרוא את המדגם עבור 10 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר aliquots 1 מ&quot;ל של LB לתוך מרק 3 צינורות תרבות. הוסף 20 μL של הפתרון phage מניות הכתב (מניות של 5 x 10 9 יחידות פלאק ויוצרים [PFU] / mL) אל צינור כל אחד; phage התקשורת דגימות לבד משמש שליטה שלילי. בהעדרו של י &#39; תאים pestis, תוספת של הפאג הכתב לא צריך לתגובה bioluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר aliquots 1 מ&quot;ל של י &#39; תרבות pestis (משלב 3.1) תוך 6 צינורות תרבות. הוסף 20 μL של המניה phage הכתב 3 של תרבויות (תרבויות מבחן). שאר 3 תרבויות לשמש מלאה שלילית של התאים לבד &quot;(autobioluminescence רקע). מערבבים תרבויות ידי vortexing בקצרה, ו -200 יבול μL מכל מדגם (בפעם 0 לקרוא) ו לוותר לתוך צלחת microtiter לבן 96-היטב. דגירה התרבות הנותרים ב 28 ° C עם רועד (225 סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את זמן 0 דגימות פליטת אור (יחידות אור יחסי, RLU) באמצעות luminometer microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 קציר μL של כל דגימה לאחר 10, 20, 30, 40, 50, ו 60 שלאחר כתב דקות phage בנוסף, ולמדוד את המדגם עבור פליטת אור. אם י תאים pestis נוכחים, phage הכתב יהיה ספציפי להיקשר אל התא, להזריק DNA שלה, ולהשתמש המארחים מכונות תעתיק ו translational לתמלל ולתרגם את הגנים כתב luxAB (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת האות ואת זמן התגובה אות הוא יחסי למספר תאים הנוכחי. בריכוזים גבוהים של תאים (10 -10 5 8 CFU / mL), גידול משמעותי לעומת RLU שולט צריך להיות ברור בתוך 20 דקות. בריכוזים נמוכים התא, (10 2 -10 4 CFU / mL), גידול משמעותי RLU צריך להיות ברור בתוך 40-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, כדי לזרז את תהליך זיהוי ללא צורך י תוצאה pestis, מושבה מהצלחת בוגר טרי עשוי להיות מעורב (על ידי vortexing) ישירות צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל עם μL 200 של מרק LB מחסה phage הכתב. מחלקים את התערובת תא / phage לבאר צלחת microtiter. דגירה את הצלחת microtiter ב 28 ° C ו לקרוא את המדגם עבור פליטת אור אחרי 60 דקות (נקודת זמן אחת בלבד). </li></ol> 4. נציג התוצאות: הפעם נציג במהלך ניסוי של הפאג הכתב בתיווך זיהוי של י &#39; pestis מתואר באיור 2. שולט שלילית של 1) phage לבד (ללא תאים), או 2) תאים בלבד (ללא phage) לספק רמות הבסיס של פליטת אור RLU של כ -20 לאורך 60 דקות incubation (רמות הבסיס הן ספציפיות luminometer). לעומת זאת, עלייה פליטת אור על דגימות הבדיקה (phage הכתב והתאים) ניכרת בכל 15 דקות אחרי כן phage. עוצמת האות צריכה לעלות בהתמדה במשך 60 דקות. Incubations לפרקי זמן ממושך (מעל 80 דקות), יביא אות כי תהיה ירידה של האות שיא בשל phage תמוגה בתיווך של התאים המארחים. תוצאות דומות מתקבלים בטמפרטורות דגירה של 37 ° C למרות הטמפרטורה האופטימלית עבור י &#39; צמיחה pestis היא 28 ° C 9. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Phage בתיווך זיהוי bioluminescent של י &#39; pestis. בזמן 0, phage הכתב והתאים היו מעורבים, מודגרות ב 28 ° C, פליטת אור (RLU) היה פיקוח לאורך זמן. גידול משמעותי RLU (* סטודנטים מבחן t, p &lt;0.05) ניכר בתוך 15 דקות.

<ol>
	<li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threats+in+bioterrorism.+I:+CDC+category+A+agents.">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li><li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , (2000).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (1999).</li><li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthrax+as+a+biological+weapon,+2002:+updated+recommendations+for+management.">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li><li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis:+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance.">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li><li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes.">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li><li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis.">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li><li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis.">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li><li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , 1-19 (2001).</li><li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage.">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li><li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella,+Salmonella,+and+Shigella.">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li><li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR.">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטה זו ממחישה את יכולתו של הפאג הכתב כדי לזהות במהירות Y. pestis מאז phage הכתב יכול transduce תגובה bioluminescent האות י &#39;תרבותי pestis תאים בתוך 20 דקות אחרי כן phage. Phage עיתונאי הוא גם מסוגל לזהות ישירות י pestis ב מטריצות קליני, ללא תנאי מוקדם של בידוד 7 הטיפוח הבאים. בהשוואה תמוגה מבחני תקן הפאג אשר בדרך כלל דורשים 48 שעות להשלמת, זה מקטין באופן משמעותי את הזמן כדי זיהוי. מחקרים קודמים הראו כי phage wild-type ΦA1122 יכול lyse כמעט כל י טבעי pestis מבודד, והוא &quot;ספציפי&quot; עבור י &#39; pestis 6,10,11, עם זאת, חלק י &#39; זנים pseudotuberculosis הוכחו להיות ΦA1122 רגישים כאשר גדל בטמפרטורות מעל 20 מעלות צלזיוס 6,10,12. הסיבה רגישות טמפרטורה רגיש ההפרש אינו ידוע, אך ככל הנראה בשל לטמפרטורה תלויי שינויים על פני שכבות תא / הרכב. לפיכך, אזהרה הפוטנציאל של מערכת זיהוי כתב phage היא האפשרות של תגובה חיוביות שגויות עם זנים מן מקרוב הקשורות מינים י pseudotuberculosis. ביצוע assay phage כתב בטמפרטורה מגבילים (20 ° C) ימנע איתות חיובי כוזב דגימות שעשויות להכיל י pseudotuberculosis. לפיכך, סגוליות יכול להיות נשלט לחלוטין בעת ​​שימוש תרבויות מבודדות גדלה בטמפרטורה מסוימת. איתור לסיכום, אבחון מהיר של י &#39; pestis חיונית תחזית חיובית מאז המגפה, המכה במיוחד דלקת ריאות, הוא כמעט תמיד קטלני אם הטיפול לא מנוהל בתוך 24 שעות הראשונות לאחר הופעת הסימפטומים. שיטה זו יש פוטנציאל לענות על הצרכים הללו לצורך זיהוי של אושר מבודד תרבותי או בתוך מטריצות רלוונטיות קלינית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Difco אגר LB, מילר </td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco LB מרק, מילר </td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 x 100 מ&quot;מ צינורות תרבות </td><td> ארה&quot;ב מדעי </td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> n-Decanal </td><td> סיגמא </td><td> D7384 </td></tr><tr><td> Veritas microplate luminometer </td><td> טרנר Biosystems </td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td> במטוס קטנטן microtiter 96-טוב צלחת </td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

'bioluminescent' reporter phage for the detection of category a bacterial pathogens

Pestis Yersinia ו anthracis Bacillus הם קטגוריה פתוגנים חיידקיים כי הם סוכני סיבתי של המגיפה ואת אנתרקס, בהתאמה 1. למרות התרחשות טבעית של שתי מחלות &quot;כיום נדיר יחסית, את האפשרות של קבוצות טרור באמצעות אלה פתוגנים כמו bioweapon הוא אמיתי. בגלל communicability הטבועה של המחלה, כמובן קליניים מהירה, שיעור תמותה גבוה, זה קריטי, כי התפרצות להתגלות מהר. לכן מתודולוגיות המספקים איתור אבחון מהיר חיוניים על מנת להבטיח יישום מיידי של צעדים לבריאות הציבור ההפעלה של ניהול משברים. רקומביננטי phage הכתב עשוי לספק גישה מהירה ספציפי לגילוי של י &#39; pestis ו-B anthracis. המרכז לבקרת מחלות ומניעתן משתמש כעת תמוגה מבחני קלאסית phage לזיהוי אישר אלה חיידקים פתוגנים 2-4. מבחני אלו לנצל טבעי phage שהם ספציפיים ממס עבור המארחים חיידקי שלהם. לאחר לילה צמיחה של החיידק מעובדים בנוכחות phage הספציפי, היווצרות הפלאק (תמוגה חיידקי) מספק זיהוי חיובי של יעד חיידקי. למרות מבחני האלה הם חזקים, הם סובלים משלושה חסרונות: 1) הם המעבדה מבוססת, 2) הם דורשים בידוד טיפוח חיידקים מן המדגם חשד, ו 3) הם לוקחים 24-36 שעות כדי להשלים. כדי לטפל בבעיות אלה, רקומביננטי &quot;אור מתויג&quot; phage הכתב היו מהונדסים גנטית על ידי שילוב harveyi Vibrio luxAB גנים לתוך הגנום של י &#39; pestis ו-B anthracis phage ספציפי 5-8. הכתב כתוצאה phage luxAB הצליחו לזהות יעד ספציפי שלהם במהירות (תוך דקות) וברגישות הענקת פנוטיפ bioluminescent לתאי הנמען. חשוב לציין, זיהוי הושג גם עם תאים הנמען מעובדים או עם מעושה נגוע דגימות קליניות 7. למטרות הדגמה, כאן אנו מתארים את השיטה לגילוי phage בתיווך של י ידוע pestis לבודד באמצעות phage כתב luxAB בנויים המגפה CDC אבחון phage ΦA1122 6,7 (איור 1). שיטה דומה, עם שינויים קלים (למשל שינוי הטמפרטורה צמיחה התקשורת), ניתן להשתמש לצורך זיהוי של B. anthracis מבודד באמצעות B. phage anthracis Wβ כתב: luxAB 8. השיטה מתארת ​​את התמרה phage בתיווך של פנוטיפ biolumescent י &#39;טיפח pestis התאים הנמדדים לאחר מכן באמצעות luminometer microplate. היתרונות העיקריים של שיטה זו על פני מבחני תמוגה המסורתית הפאג הוא קלות השימוש, התוצאות מהירה, את היכולת לבחון דגימות בו זמנית בפורמט 96-microtiter גם צלחת. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סכמטית איתור. Phage מעורבבים עם המדגם, phage מדביק את התא, luxAB באים לידי ביטוי, ואת bioluminesces התא. עיבוד המדגם אינו הכרחי; phage ותאי מעורבבים ומדד לאחר מכן לאור.

Watch this Scientific Journal Video about 'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens at JoVE.com

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים פתוגנים העדיפות היא להשתמש phage כתב מהונדסים גנטית. אלה phage הכתב, אשר הן ספציפיות למין מסוים המארח שלהם, הם מסוגלים במהירות transducing תגובה אות bioluminescent לתאי המארח. בזאת, אנו מתארים את השימוש phage הכתב לצורך זיהוי של<em&gt; Yersinia pestis</em&gt;.

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

bioluminescent-reporter-phage-for-detection-category-bacterial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K Views.  Guild Associates, Inc.. שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים פתוגנים העדיפות היא להשתמש phage כתב מהונדסים גנטית. אלה phage הכתב, אשר הן ספציפיות למין מסוים המארח שלהם, הם מסוגלים במהירות transducing תגובה אות bioluminescent לתאי המארח. בזאת, אנו מתארים את השימוש phage הכתב לצורך זיהוי של Yersinia pestis.

Video: 'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

"Bioluminescent" כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video