המחברים מודים מעבדה חברי צ&#39;ירילו לדיונים בעלי ערך וסיוע לאורך כל תקופת המחקר הזה. אנו מודים לד&quot;ר יהושע היל המעבדה של ד&quot;ר ג&#39;יימס סמואל לקבלת סיוע במהלך הסרטה של ​​פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק של 48,523 ביל ומלינדה גייטס ולהעניק AI47866 מן המכונים הלאומיים לבריאות.

1. זיהום ריאתי ידי אינטובציה Intratracheal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול עכברים, אופציונלי, סימני יכול להתבצע על האוזניים לזיהוי קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם קטמין (100 מיקרוגרם לכל גרם של משקל העכבר) ו xylazine (10 מיקרוגרם לכל גרם של משקל העכבר) על ידי חיסון intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עכברים בכלובים עד בהרדמה מלאה. לסחוט את כריות רגליהם כדי לבדוק דוושת רפלקס. עכברים צריך להציג מופחת או ללא תגובת רפלקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על דוכן אינטובציה שוכב על גבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן גומייה לעמוד אינטובציה, ואז למקם אותו תחת החותכות העליונות של העכבר. השתמש קלטת לתקן ידיים ורגליים על דוכן אינטובציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להזיז tougue מהפה באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס ספקולום עם octoscope בתוך הפה ולהסתכל לתוך oropharynx עד לפתיחת הגרון גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדריך מתקדם תיל מכוסה cathether לתוך קנה הנשימה עד catether הרכזת נמצאת החותכות. הסר חוט מדריך. מכניסים אוויר לתוך cathether לצפות התרחבות החזה לאשר אינטובציה הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 50 μL של חיידקים (ב מהתמונות המוצגות השתמשנו חיידק Calmette גרן (BCG) מביע לחץ חיפושית אדומה בלוציפראז (CBRLuc), שנבנה במעבדה שלנו, אלא כל זן חיידקי זורח יכול לשמש) פתרון באמצעות cathether באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עכבר בכלוב ולצפות בו במהלך ההתאוששות מן ההרדמה. </li></ol> 2. בעלי חיים הרדמה והכנה הדמיה פליטת אור עכברים עם isoflurane מורדמים באמצעות XGI-8 מערכת Aneshesia גז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מערכת ההפעלה-8 XGI הרדמה, לשקול כל מיכל פילטר פחם ולכתוב את המשקל תאריך. אם המשקל הוא 50 גרם מעל המשקל ההתחלתי, להחליף אותו עם בלון חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מפלס isoflurane ב מאדה ולמלא אותו במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה פינוי בחלק הקדמי של מערכת XGI 8-הרדמה מוגדר LPM 8 (ליטר minuite). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אספקת החמצן מן הצילינדר בלחץ גבוה ולהגדיר אותו psig 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את החמצן לעבור (ירוק) על החלק הקדמי של מערכת XGI-8 הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת הגז לחדר ההדמיה כדי לקבוע את רמת זרימת הגז. הגדר LPM 0.25 ואז לכבות את זרימת הגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת הגז לתא אינדוקציה הרדמה כדי להגדיר את רמת זרימת הגז. הגדר LPM 1.5 ולאחר מכן כבה זרימת הגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את isoflurane עם מאדה ולהגדיר ל 2-2.5. רמת isoflurane יכול להיות מותאם בהתאם למספר בעלי חיים בשימוש במשקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עכברים לתוך תא אינדוקציה ולסגור את המכסה. הפעל את זרימת הגז לתא אינדוקציה. עכברים מקום בחדר עבור 5-10 minuites עד שהם להרדים לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה אופטי לעיניים כדי להגן על העיניים עכבר במהלך הדמיה המקום עכברים בחדר הדמיה באחד הקונוסים האף על סעפת ההרדמה. השתמש לבלבל בין אור עכברים כדי למנוע השתקפות של אור על נושאים בעלי חיים הסמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק luciferin (150 מיקרוגרם / גרם של משקל הגוף) על ידי חיסון intraperitoneal. </li></ol> 3. פליטת אור הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה הדמיה חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המערכת לא מאותחל, לאתחל את מערכת הדמיה IVIS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים עבור הדמיה על ידי לחיצה על הגדרת רצף בלוח הבקרה IVIS הרכישה. בחר הארה ולצלם במצב הדמיה. אם האפשרות לבצע DLIT 3D השיקום הוא הרצוי, בחר תמונות צילומי אור, זורח מבניים כחלק רצף התמונה. הגדרת זמן חשיפה של שניה 0.5-10 דקות. הגדר binning ו-F / להפסיק מבוסס על בהירות הצפוי של המדגם. הגדר עירור במסנן כדי לחסום פליטת לסנן לפתוח, אלא אם כן מתכננים לרכוש רק אורכי גל מסוימים של אור. במקרה של DLIT 3D חוקה, להגדיר מסנני פליטה כפולה של אורכי גל שונים על מנת לאפשר איתור מדויק של המקור. הגדר FOV מ-A עד D תלוי במספר של עכברים או באזור של חיה להיות צילמו. בחר A ו-B עבור עכבר 1, C עבור עכברים 2-3, 4-5 ו-D עבור עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ להוסיף באשף תמונה בלוח רכישת שליטה כדי להוסיף את ההגדרה ברצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל רצף הדמיה ידי לחיצה לרכוש. במקרה של בנייה 3D DLIT, תמונות זורח יירכשו עבור מסנני פליטה מרובה באורכי גל שונים. תמונות אור צילום מובנים יהיה גם רכש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הרכישה את התמונה ולערוך רמות לוחות תמונה יהיה גלוי. מלא כמו מידע מפורט ככל האפשר עבור כל ניסוי ב לערוך תמונה כדי להבטיח מעקב קל של תמונות בכל עת לאחר מכן לשמור את התמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ReRemove העכברים מן IVIS הדמיה קאמרית ולהחזיר אותם בכלובים שלהם. שימו לב ההתאוששות מןesthesia כדי להבטיח עכברים לא הושפעו באופן משמעותי על ידי ההליך. בעלי חיים צריכים להיות תחת פיקוח מתמיד עד שהם להחלים לחלוטין מן ההרדמה (בדרך כלל 1-2 דקות). </li></ol> 4. Ex vivo הדמיה וניתוח CFU עבור כימות של חיידקים בריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עכברים עם luciferin intraperitoneally באופן זהה עבור הדמיה, זמן קצר לפני המתת חסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים בזריקה intraperitoneal של 100 דקות מ&quot;ג / ק&quot;ג 5 pentobarbitol לאחר ההזרקה luciferin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explant הריאות של עכברים מקום סטרילי, צלחות פטרי סטרילי באמצעות מלקחיים ומספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי, המכיל איבר explanted בתחום ההדמיה קאמרית לרכוש תמונות פליטת אור באותו אופן כמו כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה, להסיר איבר explanted מתוך צלחת פטרי באמצעות מלקחיים סטרילית homogenize ב 1 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את דילולים ורקמות הצלחת על התקשורת סלקטיבית המתאימה. רקמה הומוגני יכול להיות מאוחסן -80 מעלות ציפוי מחדש זה צריך להיות הכרחי. לחלופין, רקמה הומוגני יכול לשמש להפקת RNA או DNA לכמת במספרים חיידקי ידי qPCR. </li></ol> 5. ניתוח הדמיה הארה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל &quot;Imaging Software חי&quot; ולגלוש קבצי תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;Palette Tool&quot; כדי להתאים את התמונות. לחץ על התמונה כדי לשנות את כוון תיקון / סינון הגדרות מינ &#39;/ מקס עבור קשקשים צבע בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלים ROI ברשימה הנפתח עבור כימות של עוצמת אור. צורת בחר ROI, מספר וגודל. גרור ROI מסגרת לאזור הריבית על התמונה. ודאו כי כל ROI הם באותו גודל וצורה. לחץ ROI מדידה לשמור, להעתיק ו / או לייצא נתונים כמותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של 3D שחזורים DLIT, עומס התמונה ברצף, כולל התמונה אור מובנה. לחץ על הטופוגרפיה משטח בכלי פלאט. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה מחדש כדי ליצור את הטופוגרפיה משטח. בלגן משטח יופיע בחלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שחזור DLIT 3D של כלי פלאט. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה מאפיינים כדי להגדיר מאפיינים רקמות ספקטרום המקור. שרירים מומלץ ברוב הנסיבות. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה ניתוח כדי לבחור את אורך הגל לניתוח. לחץ על הכרטיסייה פרמטרים ואשר ערכי ברירת המחדל או לשנות פרמטרים DLIT במידת הצורך. לחץ על הכרטיסייה כדי להתחיל לשחזר ניתוח 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שחזור 3D נגמר, תצוגת 3D יציג את התוצאות של שיקום 3D. לחץ על הכרטיסייה כדי לראות את תוצאות ניתוח נתונים על צפיפות, voxels פוטון ופרמטרים אלגוריתם DLIT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה ו / או לייצא את התוצאות של ניתוחי שחזור 3D לדמויות וקבצי נתונים. </li></ol> 6. נציג תוצאות: התמונות של פליטת אור עכברים נגועים בחיידקים bioluminescent יחד עם שליטה בעכבר נגוע מוצגים באיור 1. ריאתי עכברים נגועים בחיידקים bioluminescent לייצר אות משמעותי מן הריאות (איור 1). עוצמת הארה היא לכמת כמו בתוך השטף סך ההחזר על ההשקעה (האזור של עניין) (איור 2). נתונים כמותיים על עוצמת האור הוא מנורמל עבור יחידות המושבה להרכיב (CFU) של חיידקים המתקבל הריאות כדי לאשר את האות מופק החיידקים bioluminescent וניתן לעומת שליטה שלילית. מיקום ועוצמת האות ניתן לנתח עוד יותר על ידי שחזור 3D DLIT מקור הארה מבוסס על טומוגרפיה של משטח העכבר 11. ניתוחים אלו מאפשרים כימות ולוקליזציה של האות bioluminescent מיוצר. התוצאות של שיקום 3D של מקור זורח בעכברים נגועים מוכיח כי אור מופק הריאות של העכבר (איור 3). התמונות vivo לשעבר של הריאות וכתוצאה מכך עכבר הארה לאשר כי נפלט מהריאות, ולא רקמות איבר כלשהו juxtaposed מקרוב אחר או (איור 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הדמיה הארה של עכברים נגועים ריאתי עם חיידקים bioluminescent מתוייגים עם CBRluc. העכבר לשלוט נגוע נמצא משמאל ושני עכברים נגועים נמצאים בצד ימין. עכברים שהיו נגועים בחיידקים להביע CBRluc (n = 2) בציר intratracheal. 10 דקות לאחר ההזרקה luciferin, תמונות הארה נרכשו עבור 10 דקות ב 4 עמדות: הגב, בצד הגחוני, שמאל ימין. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. עוצמת האור כמותי של עכברים נגועים בחיידקים להביע CBRluc. (A, B) תמונות הארה של ניתוח ROI ואת השטף הכולל לכמת אור מן ההחזר על ההשקעה במיקומים הגבי ו הגחון, בהתאמה. עכברים נגוע הם בצד שמאל ושני עכברים נגועים נמצאים בצד ימין. תמונות הארה נרכשו מהריאות of עכברים נגועים נגוע ו CBRlux (n = 2). עוצמת האור סביב הריאות היה לכמת ידי ניתוח ROI. ג) תמונות לשעבר vivo של הריאות מן (למטה שתי קבוצות של הריאות) עכברים נגוע (למעלה) ו נגועים. Luciferin הוזרק לפני 5 miniuts של המתת חסד ותמונות נרכשו לאחר מכן. הערכים לכמת הם מנורמל ל CFU. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. שחזור 3D של מקור פליטת אור (ים) עכבר נגוע ריאתי. העכבר היה נגוע בחיידקים להביע CBRluc בזריקה intratracheal. רצף התמונה נרכשה באמצעות מסנני פליטה שונות של אורכי גל סדרתי של nm 540-700 ננומטר. רצף התמונה שימש הכינון מחדש 3D עבור מקור הארה בנושאים בעלי חיים ובו מתאר לעצמי מובנים. א) טומוגרפיה על העכבר מוצגת במיקומים שונים: מלפנים, מאחור, על ימין ועל שמאל. מקורות אור מוצגים voxels (תיבות אדום בתוך העכבר 3D) הממוקמים בתוך ריאה כפי שנקבע על ידי שחזור. ב) פוטון densiy המפה של הנתונים שנמדדו מדומה. השוואת צפיפות עקומות נמדד מדומה פוטון לספק את המידע באיכות השיקום. איכות שחזורים טובים התוצאה דומה לצפיפות פוטון נמדד מדומה.

<ol>
	<li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence.">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases.">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors.">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li><li>Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli.">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li><li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions:+a+review.">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo.">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li><li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes.">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li><li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li><li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging.">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li></ol>

מחקרים שנעשו בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש טקסס A &amp; M האוניברסיטה.

למרות הבאים הפרוטוקולים הללו יהיו בדרך כלל תוצאה של תמונות באיכות גבוהה, חשוב לשקול כמה נושאים מרכזיים על מנת לקבל נתונים מדויקים ועקביים של לימודי הדמיה. תמונות הארה יש רכשה כי יש ספירת 600 מתוך 60,000 כדי להבטיח כי האות מעל הרקע ואת המצלמה לא רווי. אם האות המתקבל הוא פחו?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VETONE</td>
<td>501027 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Butler animal health supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>158307</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GMT</td>
<td>LUCK-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal plus solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VOR tech pharmaceutical</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cathether (22G x 1&#x201D;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TERUMO</td>
<td>OX2225CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Guide wire </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>210A3491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octocope with speculum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hallowell EMC</td>
<td>000A3748</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xenogen IVIS system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XGI-8-gas Anesthsia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Living Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transparent nose cones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light baffle divider </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using luciferase to image bacterial infections in mice

הדמיה היא טכניקה ערך שיכולים לשמש כדי לפקח על תהליכים ביולוגיים. בפרט, נוכחות של תאים סרטניים, בתאי גזע, סוגי תאים חיסוניים ספציפיים, פתוגנים נגיפיים, טפילים וחיידקים ניתן בעקבות בזמן אמת תוך חיים בעלי חיים 1-2. יישום של הדמיה פליטת אור ללימוד פתוגנים יש יתרונות לעומת אסטרטגיות לניתוח קונבנציונלי של זיהומים במודלים של בעלי חיים 3-4. זיהומים ניתן דמיינו בתוך חיות אדם לאורך זמן, ללא צורך המתת חסד כדי לקבוע את המיקום והכמות של הפתוגן. הדמיה אופטית המאפשרת בחינה מקיפה של כל רקמות ואיברים, ולא דגימה של אתרים ידועים בעבר להיות נגועים. בנוסף, הדיוק של חיסון לתוך רקמות ספציפיות ניתן לקבוע ישירות לפני ביצוע חיות קדימה שהיו מחוסן הצלחה לאורך הניסוי כולו. השוני בין בעלי החיים יכול להיות נשלט, מאחר הדמיה מאפשר לכל בעל חיים אחר להיות בנפרד. הדמיה יש פוטנציאל לצמצם במידה ניכרת את מספר בעלי החיים הדרושים בגלל היכולת לקבל נתונים מנקודות זמן רב מבלי מדגם רקמות כדי לקבוע 3-4 לטעון הפתוגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמיין זיהומים בבעלי חיים באמצעות דימות של פליטת אור רקומביננטי זנים של חיידקים להביע בלוציפראז. החיפושית לחץ (CBRLuc) ו luciferases גחלילית (FFluc) לנצל luciferin כמו מצע 5-6. האור המיוצר על ידי שתי CBRluc ו FFluc יש אורך גל רחב של nm 500-700 ננומטר, מה שהופך את אלה luciferases כתבים מעולה עבור דימות אופטי במודלים של בעלי חיים החיים 7-9. זה בעיקר בגלל אורכי הגל של האור יותר מאשר 600 ננומטר נדרשים כדי למנוע ספיגה של המוגלובין, ולכן עוברים דרך רקמות יונקים ביעילות. בלוציפראז הוא הציג גנטית לתוך חיידקים כדי לייצר אות אור 10. עכברים הם ריאתי מחוסן עם חיידקים bioluminescent intratracheally לאפשר ניטור של זיהומים בזמן אמת. לאחר הזרקת luciferin, תמונות נרכשים באמצעות מערכת דימות IVIS. במהלך הדמיה, עכברים מורדמים עם isoflurane באמצעות XGI-8 מערכת Anethesia גז. דמויות יכולות להיות מנותח למקם ולכמת את מקור האות, המייצגת את אתר זיהום חיידקי (ים) ומספר, בהתאמה. לאחר הדמיה, נחישות CFU מתבצעת על רקמת הומוגני כדי לאשר את קיומו של החיידק. כמה מנות של חיידקים המשמשים לקשר בין מספרי חיידקים עם הארה. הדמיה ניתן ליישם מחקר של הפתוגנזה והערכה של יעילות של תרכובות וחיסונים אנטיבקטריאלי.

Watch this Scientific Journal Video about Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice at JoVE.com

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.3K Views.  Texas A&M Health Science Center. שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על י...

Video: Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

הערכת פלישת חיידקים לתאי לב בתרבות וקולוניזציה של הלב בעכברים נגועים באמצעות מונוציטוגנים ליסטריה

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

באמצעות את Protozoan סנדלית caudatum כמו רכב עבור זיהומים שמקורם במזון הזחלים דג זברה

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...