עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר גרנט-in-Aid מפרויקט ננוטכנולוגיה מזון של משרד החקלאות, יערנות, דיג ו של יפן.

1. זלוף הכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברוש מבוגר זכר Sprague-Dawley (ב -10 ל -15 שבועות בת: משקל גוף 150-200 גר &#39;) על ידי זריקה intraperitoneal של פתרון נתרן pentobarbital (50 מ&quot;ג נתרן pentobarbital / ק&quot;ג משקל גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במחבת נירוסטה תרסיס אתנול 70% על הבטן שלה החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קטן לקלף את העור. פתח את הבטן על ידי לחתוך עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את מיקומו של וריד שער, להעביר חוט כירורגי תחת הווריד הפורטל רופף גוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש החלק הדיסטלי של קאווה הנבוב נחות וריד mesenteric למנוע ריפלוקס הדם אל הכבד. פתח את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת במספריים, ולחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר פלסטיק (2 מ&quot;מ קוטר) לווריד פורטל להדק את החוט בחוזקה סביב הקטטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הקטטר למערכת זלוף אשר נטען עם פתרון כביסה (Ca 2 +-Mg 2 + HBSS חינם המכיל 0.5 mM EGTA, HEPES 10 מ&quot;מ ו 4.2 mM NaHCO 3; pH 7.2) prewarmed על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין זלוף באתרו בשיעור של 10 מ&quot;ל / דקה. באותו הזמן, לעשות חתך בדופן ימין אטריום. המשך זלוף במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הפתרון זלוף לפתרון collagenase [HBSS המכיל HEPES 10mm ו 4.2mM NaHCO 3 בתוספת סוג אני collagenase (0.05%) ו מעכבי טריפסין (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל); pH 7.5], ו perfuse עבור 10 - 20 דקות בקצב של 10 מ&quot;ל / דקה עד הכבד מתנפח מעט ומראה את סימן להתפוררות של המבנה הכבד תחת קרום הצפק. </li></ol> 2. הכנת שבר hepatocyte עשיר Parenchymal Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות להעביר את הכבד לתוך מבחנה סטרילית המכילה 25 מ&quot;ל של תמיסת collagenase. לקצץ לחתיכות קטנות על ידי מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 75 מ&quot;ל של ממ קר לתוך התא כתוצאה ההשעיה. לאחר pipetting עדין, תסנין דרך מסננת תא (100 מיקרומטר) כדי להסיר רקמות החיבור ושברי רקמות מעוכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את תסנין לתוך צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל ו צנטריפוגות XG ב 50 דקות 1 ב 4 ° C (בלם כבוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להתעלמות supernatant. Resuspend גלולה עם מזכרות קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור 2.4) שלוש פעמים. </li></ol> 3. תרבות ראשי מעורבות של תאים בכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את התאים המתקבלים 2.5) במדיום הגידול מורכב המכיל DMEM חום FCS 10% מומת, בתוספת 100 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אינסולין, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 100 סטרפטומיצין U / ml פניצילין, וזרעי לתוך 09:55 בתרבית רקמה צלוחיות (שטח: 75 ס&quot;מ 2) בצפיפות של 6.7 x 10 4 תאים / ס&quot;מ 2 (5 x 10 6 תאים / בקבוק / 12 -15 מ&quot;ל של מדיום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התרבות flasksat 37 ° C באווירה של 5% CO 2-95 אוויר%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מדיום הגידול כל 2-3 ימים במרווחים. </li></ol> 4. בידוד סלקטיבי של המקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12 ימים של תרבות, מקרופאגים להתרבות בגיליון התא. תאים אלה מושעים ידי הגומלין רועד של צלוחיות תרבות ב 80-120 משיכות לדקה למשך 30 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת בינוני תרבות לתוך 100 מ&quot;מ רקמת שאינם מאכלים תרבות כיתה פלסטיק. בריכת בינוני משני T75 לתוך צלוחיות מנה אחת מפלסטיק. צלוחיות עם מילוי תרבות המדיום הצמיחה ולהחזיר אותם בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מנות פלסטיק למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO 2-95 אוויר%. המקרופאגים ברצון לצרף רקמות שאינן כיתה תרבות צלחות פלסטיק תחת תהליך הדגירה, בעוד התאים מזהמים אחרים לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב הבינוני בעדינות ולשטוף את צלחת פלסטיק עם PBS. חזור על שלב זה שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של תמיסת אקספרס TrypLE לתוך התבשיל, ואת דגירה עבור 10min ב 37 ° C באווירה של 5% CO 2-95 אוויר%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ&quot;ל של מדיום הגידול. בעדינות לגרד את מקרופאגים שצירפו מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ו - 180 צנטריפוגות ב XG 5 דקות במהירות של 25 ° C (על הבלמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום הגידול. לנתק לתוך תאים בודדים ידי pipetting נמרצת. ספירת מספר התאים על ידי ספירת-hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעדים בידוד ניתן לחזור עם צלוחיות תרבות באותו 02:58 במרווחים יום במשך יותר משבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרופאגים מבודד יכול להיות מתורבת במדיום הגידול המתואר 3.1. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה לתרבות העיקרי מעורבת של תאים בכבד המבוגר עכברוש מוצג באיור 2. Hepatocytes Parenchymal לאבד את המורפולוגיה תא אפיתל בתוך ימים ספורים בתרבות, מנוונת או להפוך פיברובלסטים דמויי תאים.ואז, בסביבות יום 6 עד 12, לעומת זאת בשלב בהיר, עגול macrophage דמויי תאים vigourouly להתרבות בגיליון תא fibroblastic. על ידי רועדת של צלוחיות תרבות, מקרופאגים מושעים בקלות לתוך המדיום תרבות, ולהעביר הדגירה עתידיים בצלחות פלסטיק לגרום הדבקה סלקטיבית של מקרופאגים (איור 3). Macrophage כמו התאים ניתן לקצור כבר ביום 8, וכן את המספרים הגיעו לרמות מירבית בימים 12-14. יותר מ 10 6 תאים ניתן לקצור מבקבוקון T75 תרבות שוב ושוב במשך יותר משבועיים בבית 2-3 במרווחים יום, המאפשר תשואה התא הכולל לכל בקבוק של בקבוק 10 7 לכל תרבות T75 (איור 3). Purities של מקרופאגים מבודד היו 95-99%, הערכה לפי flowcytometry או immunocytochemistry עם macrophage נוגדנים ספציפיים חולדה, כגון ED-1 (איור 4), ED-3, OX-41 (איור 4) ו Iba1 9. תאים מבודדים להראות מאפיינים טיפוסיים של מקרופאגים, כגון phagocytosis פעיל של חרוזים polystylene (איור 5), בתגובה על שגשוג רקומביננטי GM-CSF, הפרשת דלקתי / אנטי דלקתיות ציטוקינים על גירוי עם LPS, היווצרות של תאים ענק multinucleated 9. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תכנית לבידוד לטיהור סלקטיבית של macrophage דמויי תאים מתרבות העיקרי מעורבת של תאים בכבד חולדה. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. לתרבות ראשונית של תאים בכבד חולדה הפצת macrophage דמויי תאים. החץ מצביע על התא ענק multinuclear. בר סולם = 100 מיקרומטר. הודפס מתוך כתב העת של שיטות החיסוני, Vol.360, 47-55 (2010) 9 באישור Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. בידוד סלקטיבי של macrophage דמויי תאים על ידי לוחץ את שיטת ההתקשרות. תאים הושעו לתוך המדיום התרבות ידי ניעור צלוחיות, הועבר לאחר מכן לתוך הרקמה הלא מנות התרבות כיתה פלסטיק, מודגרות ב 37 ° C. כבר 10 דקות אחרי ציפוי, macrophage דמויי תאים המחוברים פני השטח את המנה, ואילו השני תאים fibroblastic לזהם נשארה תלויה על בלימה. לאחר שטיפה עם PBS, אוכלוסייה macrophage מטוהרים הושג. תאים אלה זכו מורפולוגיה macrophage טיפוסי לאחר 40 דקות של תרבות, והתאים mitotic נצפו לעתים קרובות (חיצים). השינויים הבאים במספרים תא התאושש צלוחיות בתקופות תרבות שונים מוצגים. הערכים הם ממוצע ± SD 3-5 צלוחיות. ניסויים חזרו שלוש פעמים נתונים מסומנים על ידי סמלים שונים. בר סולם = 100 מיקרומטר. הודפס מתוך כתב העת של שיטות החיסוני, Vol.360, 47-55 (2010) 9 באישור Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. מכתים Immunocytochemical של macrophage דמויי תאים עם נוגדנים חד שבטיים נגד מקרופאגים חולדה. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. Phagocytosis של FITC שכותרתו microbeads ידי macrophage דמויי תאים.

<ol>
	<li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+as+a+lymphoid+organ.">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li><li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis.">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li><li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver:+An+organ+with+predominant+innate+immunity.">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li><li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation.">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li><li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells.">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li><li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay.">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells.">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li><li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells.">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li><li>Gorrell, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+fibrosis:+the+hepatocyte+revisited.">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li></ol>

כל בעלי החיים הוחזקו ומופעל במתקן בעלי חיים המכון הלאומי לבריאות בעלי חיים, על פי הנחיות ותקנות שנקבעו על ידי הוועדה של מכון לניסויים בבעלי חיים.

כאן אנו מדווחים שיטה פשוטה ויעילה כדי להשיג מקרופאגים מן התרבויות העיקרי מעורבת של תאים בכבד חולדה מבוגר. השיטה שלנו מתבססת הראשון על פעילות שגשוג הרומן של מקרופאגים בתרבות מעורבת של תאים בכבד חולדה, ואחר כך בידוד וטיהור עתידיים של תאים אלה על בסיס המאפיינים הביולוגיים שלהם, כמו מקרופאגים 9. אפשר אולי מקרופאגים התרבו בתרבות העיקרי מעורבת של תאים בכבד מבוגר שאולי מקורם Kupffer או תאים הקשורים זה מזוהמים לתוך השבר hepatocytes parenchymal. מקרופאגים אולי הגיב לשינויים סביבתיים ספציפיים שנגרמו על ידי הפיכתו של hepatocyte תאים parenchymal fibroblastic 10 אחרים בתרבויות העיקרי מעורבת. לסיכום, השיטה שלנו מספק בידוד של macrophage דמויי תאים במספר טוהר מספיק מן התרבות העיקרי של הכבד עכברוש cellswithout באמצעות ציוד מתוחכם מיומנויות טכניות. בנוסף, הליך הבידוד ניתן לחזור עם בקבוק התרבות אותו במשך יותר משבועיים. שיטה זו עשויה להיות ישימה מיני יונקים אחרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> נתרן pentobarbital פתרון </td><td> Kyoritsu Seiyaku </td><td> Somnopentyl Injection </td><td></td></tr><tr><td> האנק של פתרון מאוזן מלח (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> אתילן גליקול tetraacetic חומצה (EGTA) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Wako טהור תעשיות כימיות בע&quot;מ </td><td> 032-10534 </td><td> תא דיסוציאציה כיתה (לוט לבדוק הצורך) </td></tr><tr><td> מעכבי טריפסין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T-9128 </td><td></td></tr><tr><td> הנשר של מינימום הכרחי בינוני (ממ) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M-4655 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco של שינוי הנשר של המדיום (DMEM) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D-6459 </td><td> גלוקוז גבוהה מסוג </td></tr><tr><td> עוברית עגל בסרום (FCS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> מחממים מומת על 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. (לוט לבדוק הצורך) </td></tr><tr><td> TrypLE אקספרס </td><td> Invitrogen </td><td> 12605 </td><td></td></tr><tr><td> פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td> Ca 2 +-Mg 2 + החופשי </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M-7522 </td><td> במלאי: 100 מ&quot;מ מים מזוקקים </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> אני-5500 </td><td> במלאי: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​0.1N HCl </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> תא מסננת </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> גודל Mesh: 100 מיקרומטר </td></tr><tr><td> תרבות רקמות צפחת </td><td> Sumitomo הבקליט ושות&#39; בע&quot;מ </td><td> MS-21250 </td><td> פני השטח: 75 ס&quot;מ 2 </td></tr><tr><td> Non-רקמות תרבות צלחות פלסטיק </td><td> BD Biosciences </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> תא מגרד </td><td> קורנינג בע&quot;מ </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> גומלין שייקר </td><td> TAITEC </td><td> NR-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method to isolate macrophages from mixed primary cultures of adult liver cells

תאים בכבד Kupffer הם ספציפיים מקרופאגים תושב לשחק תפקיד חשוב פונקציות פיזיולוגיים ופתולוגיים של הכבד 1-3. למרות שיטות הבידוד של מקרופאגים הכבד כבר היטב תיאר 4-6, רוב השיטות האלה דורשות ציוד מתוחכם, כגון elutriator צנטריפוגלי וכישורים טכניים. כאן, אנו מספקים שיטה חדשה להשיג מקרופאגים הכבד במספר טוהר מספיק מתרבויות העיקרי מעורבת של תאים בכבד חולדה מבוגר, כפי שמודגם סכמטי באיור 1. לאחר ניתוק של תאים בכבד על ידי שני שלבים 7,8 שיטה זלוף, שבר מורכב ברובו hepatocytes parenchymal ערוכה seeded לתוך T75 תרבות צלוחיות עם רקמה בינוני תרבות מורכבת DMEM hepatocytes FCS.Parenchymal ו 10% לאבד את המורפולוגיה תא אפיתל בתוך ימים ספורים בתרבות, מנוונת או להפוך תאים דמויי פיברובלסטים (איור 2). כמו תרבות התמורה, סביב יום 6, שלב בניגוד בהיר, עגול macrophage כמו התאים מתחילים להתרבות בגיליון תא fibroblastic (איור 2). הצמיחה של macrophage דמויי תאים להמשיך ולהגיע לרמות היותר סביב 12 יום, המכסים את הגיליון התא על פני הבקבוק. על ידי רועדת של צלוחיות תרבות, מקרופאגים מושעים בקלות לתוך המדיום לתרבות. לאחר העברת ו דגירה קצרה בעקבות הידבקות צלחות פלסטיק סלקטיבית של מקרופאגים (איור 3), שם כמו תאים מזהמים אחרים נשארים תלויים. אחרי כמה שטיפות עם PBS, מקרופאגים מצורף נקצרים. יותר מ 10 6 תאים ניתן לקצור שוב ושוב במשך יותר משבועיים (איור 3) מן הבקבוק רקמות זהה T75 התרבות בשעה 02:58 במרווחים יום. Purities של מקרופאגים מבודד היו 95-99%, כפי מוערך על ידי cytometry זרימה או immunocytochemistry עם macrophage נוגדנים ספציפיים חולדה (איור 4). בתאים מבודדים להראות phagocytosis פעיל של חרוזים polystylene (איור 5), בתגובה על שגשוג רקומביננטי GM-CSF, הפרשת דלקתי / אנטי דלקתיות ציטוקינים על גירוי עם LPS, היווצרות של תאים ענק multinucleated 9. לסיכום, אנו מספקים שיטה פשוטה ויעילה כדי להשיג מקרופאגים הכבד במספר טוהר מספקת וללא ציוד skills.This מורכבות השיטה עשויה להיות ישימה מיני יונקים אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells at JoVE.com

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

שיטה חדשנית להשיג מקרופאגים מתרבות העיקרי של תאים בכבד חולדה מתואר. שיטה זו מנצלת את ריבוי של מקרופאגים בתרבות, ואחריו רעד של צלוחיות תרבות וטיהור על ידי התקשרות סלקטיבית מנות פלסטיק. טכניקה זו יעילה מספק מקרופאגים הכבד ללא ציוד מיומנויות מורכבות.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

a-simple-efficient-method-to-isolate-macrophages-from-mixed-primary

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

37.9K Views.  National Institute of Agrobiological Sciences, Tsukuba, Japan. שיטה חדשנית להשיג מקרופאגים מתרבות העיקרי של תאים בכבד חולדה מתואר. שיטה זו מנצלת את ריבוי של מקרופאגים בתרבות, ואחריו רעד של צלוחיות תרבות וטיהור על ידי התקשרות סלקטיבית מנות פלסטיק. טכניקה זו יעילה מספק מקרופאגים הכבד ללא ציוד מיומנויות מורכבות.

Video: A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...