ברצוננו להודות ג&#39;יה לי ליו על תמיכתם בבריאה של איור 1. מחקר זה מומן על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF) פרויקט כבד וירטואלי: 0,315,741.

הערה: כל התאים היו מבודדים מרקמת כבד אנושית הלא tumorous שנקטעה, שנשאר לאחר כריתה חלקית כבדה עם גידולים בכבדים ראשוניים או משניים. הסכמה מדעת של החולים הושגה על פי הקווים המנחים האתיים של השריטה - Universitätsmedizin ברלין. 1. הכנת חומרים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל המכשירים ואת החומרים מראש כדי למנוע זיהום חיידקים במהלך תהליך הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הנדרשים זלוף של המדגם רקמת הכבד, את תהליך הבידוד של hepatocytes ותאי הכבד הלא parenchymal וטיפוח בתאי כבד אנושיים ראשוניים על פי לוחות 1 ו -2, עם יוצא מן הכלל של פתרון העיכול אשר מוכן טרי לפני השימוש. כל הפתרונות יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס ומומלץ להשתמש בהם בתוך 4 שבועות לאחר ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְעַקֵרכל הפתרונות באמצעות מסנן העליון 0.22 מיקרומטר הבקבוק. </li></ol> 2. הכנת ציוד זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה לציוד עבור זלוף ועיכול המדגם הכבד הרקמות כפי שמוצג באיור 1 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את הטמפרטורה באמבט מים עד 39 ° C על מנת להבטיח פעילות P collagenase אופטימלי במהלך זלוף ועיכול. </li></ol> 3. זלוף ועיכול מדגם רקמת כבד (1.5 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דגימת רקמה עם הקפסולה של שלמי Glisson מרקמת כבד הכריתה. כאשר חיתוך דגימת רקמה, לנסות לקבל משטח חיתוך קטן עם כלי גלוי טוב. הימנע פעמים איסכמיה חמה על ידי הובלת וטיפול המדגם הכבד רקמות על הקרח עד זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את משקל הרקמה בתנאים סטריליים ולמקם המדגם כבד רקמות בצלחת פטרי בזרימת האוויר למינרית. נקו את פני השטח של דגימת רקמה עם רטייה סטרילי מן מחדשmaining דם ולשטוף את סט הצינורית באמצעות שאני זלוף-פתרון 1x על מנת להבטיח כי כל הצינורית הייתה חדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש רקמות דבקות לתקן את הזיתים של קנולות בחלק כלי דם גדול. בהתאם לגודל של המדגם כבד רקמות ומספר הכלי על פני השטח, להשתמש צינורית משובצת 3 עד 8 קנולות. בדוק את זלוף ולבדוק דליפות. סגור את כל כלי הדם, אשר להדליף לי 1x זלוף-פתרון ברור, עם דבק רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את מדגם רקמת כבד cannulated לתוך המשפך ביכנר על דיסק המסנן המחורר שלה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה של המשאבה peristaltic בין 7.5 מ&quot;ל / דק &#39;ו 14.6 מ&quot;ל / דקה תלוי במספר קנולות משומשים על התנגדות של רקמת הכבד. התאם את קצב הזרימה בכל פעם על מנת להבטיח כי קיים זלוף נוכחי אבל איטי. Perfuse הרקמה עד הדם המלא סמוק החוצה אבל לפחות 20 דקות. שים את הרקמות הופכות בהיר באזורים עם perfusi הטובעַל. הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לצבוט אחד קנולות עם מהדק פלסטיק או להגביר את הלחץ הפנימי של שטח על ידי דחיפת ברכות עם מרית נגד הקפסולה הכבד, כדי לייעל את זלוף. שינוי צבע מלא בצהוב בהיר לצבע חום בהיר מציין זלוף טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את נוזל זלוף-פתרון העיכול המכיל collagenase P (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסדר מחדש את ההתקנה (איור 1 א) עבור שלב העיכול. לכן לבצע זרימה מעגלית של פתרון העיכול על פי איור 1B עבור עד 15 דקות. הערה: זה קריטי להפסיק זלוף מיד כאשר המדגם הכבד רקמות מתעכל מספיק. עיכול טוב ניתן לצפות, כשאף הרקמה מראה סימן של גמישות לפי הערכה ותחזוקה של דפורמציות כמוסה, כאשר הוא דחף עם מרית. </li></ol> 4. בידוד של hepatocytes (1 hr) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tכד משאבת peristaltic ונח המדגם כבד רקמות בצלחת זכוכית. יש לשטוף את החלק החיצוני של דגימת רקמה עם פתרון-Stop קרים כקרח (טבלה 1). הסר את קנולות מהדגימה כבדת הרקמות. השתמש אזמל כדי לפתוח את המדגם כבד רקמות, על ידי חריטה באמצע האזור שבו קנולות צורפו. שמור על עצמך כי הקפסולה Glisson&#39;s נשאר ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלק הפנימי של דגימת הרקמה ולאחר מכן לכסות את דגימת הרקמה השלמה עם פתרון-Stop קר כקרח. לנער את הרקמה בעדינות כדי לשחרר את התאים מתוך הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השעית התא ולסנן אותו דרך משפך מבט (משפך פלסטיק מרופד תחבושות) לתוך 50 צינורות פלסטיק מיליליטר. הוסף עוד עצור-פתרון מדגם כבד הרקמה עד נפח סופי של 500 מיליליטר הוא נצרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. איסוף supernatant בידוד תא הלא parenchymal מאוחר יותר. שטוף את התא גלול עם PBS (איור 2א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעית התא שוב ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. אסוף את supernatant מחדש להשעות גלולה במדיום דגירה Hepatocyte (לוח 2, תרשים 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספר הסלולרי ואת כדאיות השעית התא וכתוצאה מכך באמצעות מכתים trypan הכחול. לספור את החיים תאים מתים בתא לספור נויבאואר. לחשב את מספר הסלולרי, הכדאיות ואת התשואה של PHH תוך שימוש בנוסחאות להלן. תשואה (נספר תאים) = תאים נספר x גורם לדילול נפח x של השעיה תא (מ&quot;ל) x 10,000 תשואה (hepatocytes / (מדגם כבד גרם רקמה)) = (תשואה (hepatocytes / (תקשורת מיליליטר)) נפח x של השעית תא (מיליליטר)) / (משקל של מדגם כבד רקמות (ז)) כדאיות (%) = 100% x (מספר תאי חיים) / (מספר תאים כולל) </li></ol> 5. טיהור hepatocytes (1 hr) הערה: שלב טיהור זו מומלצת, אם את הכדאיותנמוך מ -70%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע כל הצעדים על הקרח. הכן שיפוע צפיפות 25% על ידי ערבוב פתרון שיפוע צפיפות 5 מ&quot;ל ו 15 מ&quot;ל PBS עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מקסימום של 50 תאי Mio בסך הכל מתוך השעית התא העשירה hepatocyte בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת שיפוע צפיפות 25% על מנת להבטיח כי הפרדה ברורה של שני השכבות מושגת (איור 2 ג). שים את הצינורות בזהירות לתוך צנטריפוגות צנטריפוגות ב 1,250 XG, 20 דק &#39;, 4 ° C ללא בלם (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את ההשעיה תא הנותרים ואת התאים המתים שלבי הביניים. בהתאם אחד תכולת השומן עלול גם לשאוב שיפוע-פתרון צפיפות. הערה: PHH עם תוכן שומנים נמוך צורה כדורית צפופה ואת שיפוע הצפיפות ניתן aspirated לחלוטין. PHH עם תוכן שומנים גבוה צורה כדורית מפוזרת יותר והרבה תאי קיימא עשוי להישאר פתרון שיפוע צפיפות מעל הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Re- להשעות את כדורי hepatocyte עם PBS ו צנטריפוגות שוב ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. פינת כדורי, לשטוף שוב עם PBS מחדש להשעות PHH מטוהרים במדיום דגירה Hepatocyte. בצעו ספירת תאים כפי שמתואר בשלב 4.6. </li></ol> טיפוח 6. hepatocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כלי תרבית תאים עבור זריעה של PHH על ידי ציפוי אותם עם תאי מטריקס עבור קולגן זנב חולדה למשל (אני סוג קולגן). כן קולגן עכברוש הזנב לפי הפרוטוקול הוקם על ידי רג&#39;אן et al. 17 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות קולגן עכברוש זנב פתרון 1: 200 ב PBS. העברת 100 μl / 2 ס&quot;מ חולדה פתרון הזנב קולגן לתוך תרבות מנות, מטפלת כי כל פני השטח מכוסה. דגירת פלסטיק תרבית תאים עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב את פתרון קולגן זנב חולדה הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 15 x 10 4 hepatocytes / 2 ס&quot;מ במדיום Hepatocyte דגירה על תרבות disheשעות מצופות קולגן זנב חולדה. טפחו את התאים חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפחות שעה 4. לאחר 4 שעות את hepatocytes דבק והמדיום ניתן לשנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חקירות תלויות בהגדרת הניסוי. זמן תרבות של 48 שעות מומלץ לאפשר לתאים להתאושש תהליך הבידוד. </li></ol> 7. בידוד של תאים בכבד ללא parenchymal (1.5-2 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant אסף (שלב 4.5 ו -4.6) בשעה 72 XG, 5 דקות, 4 ° C לחסל אריתרוציטים ו hepatocytes הנותרים. פינת את supernatants צנטריפוגות אותם פעמיים כדי לקבל שני כדורי תא: 300 XG, 5 דקות, 4 ° C עבור שקיעה של HSC, LEC ובחלקו KC ו -650 XG, 7 דקות, 4 מעלות צלזיוס במשך שקיעה של הנותרים KC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברכה הן כדורים מחדש להשעות אותם HBSS. כן 25% לבין מפלי צפיפות 50% על ידי פתרון שיפוע צפיפות ערבוב PBS עבור centrif שיפוע צפיפותugation (שיפוע הפתרון צפיפות 25%: 5 מ&quot;ל פתרון מפל צפיפויות 15 מ&quot;ל PBS, פתרון שיפוע צפיפות 50%: 10 מ&quot;ל פתרון מפל צפיפויות 10 מ&quot;ל PBS, ראה איור 2). מניח את פתרון שיפוע צפיפות 25% בזהירות על גבי שכבת פתרון שיפוע צפיפות 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את ההשעיה NPC בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת פתרון שיפוע צפיפות 25% באופן הפרדה ברורה של שתי שכבות מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא על שיפוע צפיפות 1,800 XG, 20 דק &#39;, 4 ° C ללא בלם (איור 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאים מתים ופסולת תא מהשכבה העליונה. ה NPC ממוקם ביניים בין שכבת שיפוע צפיפות 25% ו -50% (איור 2). אסוף NPC, לשטוף אותם עם HBSS צנטריפוגות ההשעיה תא החלת השלב צנטריפוגה כפול שתואר לעיל (שלב 7.2.). </li></ol> הפרדת 8. של תאי Kupffer (דבקשלב ההפרדה) (1 hr) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו ספירת תאים עבור KC בשבריר NPC כמתואר בשלב 4.6. (לקבלת מראה של KC ההשעיה לראות איור 3B). צנטריפוגה השבר NPC עם הצעד צנטריפוגה כפול שתואר לעיל (שלב 7.2) מחדש להשעות את NPC ב Kupffer תא זריעת בינוני (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים חלק KC המכיל על כלי תרבית תאים פלסטיק בצפיפות של 5 x 10 5 KC / 2 ס&quot;מ. דגירת תרבויות KC במשך 20 דקות בתוך חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. KC הראשי לדבוק על פלסטיק תרבית תאים בתוך פרק הזמן קצר (איור 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant המכיל אינו דבק NPC, המורכב בעיקר של הבקר ואת HSC. פינה את supernatants להפרדה מאוחרת של בקר (ראה סעיף 9) ו HSC (ראה סעיף 10). שטוף את KC החסיד עם HBSS ולטפח אותם במדיום תרבית תאי Kupffer (לוח 2) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בתוך חממה humidified. </li></ol> 9. הפרדה לתאי אנדותל (1.5 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant אסף (שלב 8.5.) ב 300 XG, 5 דקות, 4 ° C. שטפו את הכדור עם PBS. לאחר צנטריפוגה XG ב 300, 5 דקות, 4 ° C מחדש להשעות את התאים תא stellate / בינוני ההפרדה תא האנדותל ולבצע ספירת תאים עבור כל התאים הנותרים כמתואר בשלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות 1 x 10 7 תאים Mio ב 1 מ&quot;ל תא stellate / בינוני ההפרדה תא האנדותל, להוסיף 20 μl פתרון חסימת מן-KIT MACS ו -20 μl של חרוזים מיקרו CD31 עבור immunolabeling דגירה ההשעיה וכתוצאה מכך במשך 15 דקות ב 4 טמפרטורת ° C (איור 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקר בנפרד HSC כמתואר בפרוטוקול manufacturer&#39;s עבור מערכת מיון התא המופעלת המגנטי MACS (איור 2.5). Elute מגנטית שמר LEC CD31 חיובי, ולהשהות אותם stellate Cell / בינוני תרבות תא האנדותל (טבלה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תא לספור עבור בקר כמתואר בשלב 4.6. בקר זרע בצפיפות של 1.25 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר בכלי תרבית תאים מצופים קולגן זנב חולדה (ראה שלב 6.1). טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified. </li></ol> 10. הפרדת תאי stellate (0.5 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HSC ללא תווית להעביר את עמודת ההפרדה במהלך הליך MACS. אסוף את שבריר HSC (ראה שלב 9.5, איור 2.5). בצעו ספירת תאים כפי שמתואר בשלב 4.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HSC זרע עם צפיפות של 5 x 10 4 תאים / 2 ס&quot;מ בכלי תרבית תאים מצופה קולגן זנב חולדה (ראה שלב 6.1) ב תא stellate / בינוני תרבות תא האנדותל (טבלה 2) ולטפח אותם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified. </li></ol><img alt= &quot;טבלה 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53,069 / 53069table1.jpg&quot; /&gt; טבלה 1: זלוף פתרון בידוד. <img alt="טבלה 2" src="/files/ftp_upload/53069/53069table2.jpg" /> תקשורת ותרבות ובידוד: טבלה 2.

<ol>
	<li>Pfeiffer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+cultivation+of+human+hepatocytes+and+non-parenchymal+liver+cells.">Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells.</a> Exp Biol Med. , (2014).</li><li>Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+and+development+of+the+liver.">Organogenesis and development of the liver.</a> Dev Cell. 18 (2), 175-189 (2010).</li><li>Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+isolation+of+liver+cells.">Recent advances in the isolation of liver cells.</a> Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).</li><li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes,+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity,+cell+signaling+and+ADME.">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).</li><li>G&#243;mez-Lech&#243;n, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocytes--the+choice+to+investigate+drug+metabolism+and+toxicity+in+man:+in+vitro+variability+as+a+reflection+of+in+vivo.">Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo.</a> Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).</li><li>Ginai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+bioreactors+as+in+vitro+models+in+pharmaceutical+research.">The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research.</a> Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).</li><li>Schyschka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+3D+cultures+but+not+2D+cultures+preserve+specific+transporter+activity+for+acetaminophen-induced+hepatotoxicity.">Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity.</a> Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).</li><li>Kostadinova, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+three+dimensional+liver+co-culture+system+for+improved+prediction+of+clinically+relevant+drug-induced+hepatotoxicity.">A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).</li><li>Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-cell+type+human+liver+microtissues+for+hepatotoxicity+testing.">Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing.</a> Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).</li><li>Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G., Santin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Holy+Grail+of+Hepatocyte+Culturing+and+Therapeutic+Use.">The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use.</a> Strategies in Regenerative Medicine. , 1-38 (2009).</li><li>Friedman, S. L., Roll, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+lipocytes,+Kupffer+cells,+and+sinusoidal+endothelial+cells+by+density+gradient+centrifugation+with+Stractan.">Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan.</a> Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).</li><li>Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Kupffer+and+endothelial+cells+from+the+rat+liver.">Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver.</a> Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).</li><li>Alabraba, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+isolation+and+culture+of+human+Kupffer+cells.">A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells.</a> J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).</li><li>Friedman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+hepatic+lipocytes+and+Kupffer+cells+from+normal+human+liver:+morphological+and+functional+characteristics+in+primary+culture.">Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture.</a> Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).</li><li>Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+can+be+distinguished+by+expression+of+phenotypic+markers+related+to+their+specialised+functions+in+vivo.">Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo.</a> World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).</li><li>Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+by+a+two-step+collagenase+perfusion+procedure.">Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hepatic+stellate+cells+from+mouse+liver.">Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).</li><li>Zeng, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+isolate+and+culture+rat+kupffer+cells.">A new method to isolate and culture rat kupffer cells.</a> PLoS One. 8 (8), e70832 (2013).</li><li>Tokairin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+specific+isolation+of+rat+sinusoidal+endothelial+cells+by+the+immunomagnetic+bead+method+using+SE-1+monoclonal+antibody.">A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody.</a> J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).</li><li>Damm, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cell+isolation,+culture+and+characterization.">Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization.</a> Hepatology International. 7, 915-958 (2013).</li><li>Baccarani, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+hepatocytes+from+livers+rejected+for+liver+transplantation+on+a+national+basis:+results+of+a+2-year+experience.">Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience.</a> Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).</li><li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells.">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Gerlach, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+isolation+of+sinusoidal+endothelial+cells+from+pig+and+human+liver.">Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver.</a> J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

הפרוטוקול שפורסם מתאר טכניקה לבודדת PHH הטהור NPC, כלומר KC, HSC ו בקר, בו זמנית באיכות גבוהה וטוהרים מאותה דגימת רקמת כבד אנושית. רוב הפרסומים העוסקים isolations תא כבד מכסים רק אחד מאותם אוכלוסיות תאי 18-20 ונהלי בידוד מבוצעים עם רקמה אנושית הם נדיר (נבדק על ידי Damm et al.) ...

רקמת כבד אנושית היא מאוד מורכבת מורכבת משני גופי תאים שונים, תאי parenchymal ותאי הלא parenchymal (NPC). תאי כבד Parenchymal כוללים hepatocytes ו cholangiocytes. Hepatocytes מייצג 60 עד 70% של תאי כבד סכו להסביר את רוב הפונקציות הכבדות מטבולית, למשל, חומצות מרות ומשלים סינתזת גורם, biotransformation ואנרגית מטבוליזם 2,3. שבר NPC הקטן מהווה 30-40% של תאים כבדים כוללים. NPC לכלול אוכלוסיות תאים שונות, כלומר תאי Kupffer (KC), תאי אנדותל כבדים (LEC) ותאי stellate הכבדים (HSC). שבריר תא הטרוגנית זו ממלאת תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים של הכבד. בנוסף, NPC להשתתף בתיווך נזק כבד חריפה, למשל, פגיעה בכבד הנגרמת התרופה (דילי) וכן לפציעת כבד כרונית, כגון שחמת 4. בשנים האחרונות, hתאי כבד באומן הפכו יותר ויותר חיוני במחקר ופיתוח של בדיקות סמים, פיתוח תרופות וזיהוי הביוכימיים חדשים במחלות כבדות. עבור בדיקות במבחנה monocultures PHH עדיין נחשבים &quot;תקן הזהב&quot; 5. המגבלה העיקרית של מודלים כבדים homotypic הנוכחיים היא dedifferentiation ואובדן התפקוד של hepatocytes תוך מספר ימים 4. הקמת טכניקות תרבות 3-ממדי (3D) הוכיחה כי מגבלות אלה ניתן לפצות 4,6. עם זאת, אפילו טכניקות תרבות 3D מודרניות אינן מסוגלות להציג את כל מצבי hepatotoxic של פעולות 7. אוכלוסיות NPC חסרות במודלים במבחנה הקיימים נדונות כסיבה אפשרית לאי התאמה זו למצב vivo. הוכח כי תקשורת תאי תאים בין אוכלוסיות תאים בכבד השונות ממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס פיסיולוגי אלא גם pathophysiologic מעבד 8. לכן את תשומת הלב המדעית מתמקדת יותר ויותר על NPC ואינטראקציות תאי התאים שלהם. שימוש ותכליתי במערכות שיתוף תרבות רקמות מהונדסות יכול להיות פתרון עבור הביקוש הרב של מודלים כבדים במבחנת 8,9 שהן קרובות ככל למצב in vivo ככל האפשר. כרגע האתגר המרכזי הוא הפיתוח של מודל כבד אנושי סטנדרטי שיתוף תרבות, המכיל חלקים ברורים של PHH ו NPC. כתוצאה מכך, טכניקות לבידוד תאי הכבד הטרוגנית מאוד נדרשות ואלה צריכים להיות מותאמים על מנת לקבל אוכלוסיות תאים טהורות. בעוד פרוטוקולים סטנדרטיים עבור בידוד PHH קיימים 10, הבידוד הסטנדרטי של NPC אדם עדיין בפיתוח. רוב שפורסמו פרוטוקולי בידוד NPC מבוססים על ניסויים עם תאים שאינם בני אדם 11,12. רק כמה פרסומים לתאר את תהליך הבידוד של האדם NPC ורוב מכסים רקשיטות הבידוד של תא בודד מקלידים 11-16. מאפייני התא החשובים ביותר כי כבר רתמו להפרדה סלולרית הם גודל, צפיפות, התנהגות-הקשר, ואת הביטוי של חלבוני פני שטח. על סמך מאפיינים אלה פתחנו פרוטוקול פשוט לבודדים PHH, KC, בקר ואת HSC, אשר פורסם בעבר בביולוגיה ניסויית ורפואת 1. בגלל העניין הרחב בטכניקה זו, המטרה של מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט יותר על תהליך הבידוד כבד התא כולל וידאו, אשר יאפשר לשחזר את הטכניקה יותר בקלות. הפרוטוקול כולל גם שיטות בקרה איכות להערכת תשואה ואת הכדאיות וכן להערכת זיהוי ורמת ניקיון באמצעות immunostainings הספציפי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">General Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:293px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PIPETBOY</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2-incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamin Air</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge Varifuge 3.0R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Urine Beaker</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>2041101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">perfusor syringe 50 ml</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>12F0482022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bottle Top Filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>1058787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue Culture plate</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>533047</td>
			<td>24 well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">serological pipettes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>357525, 357551, 357543</td>
			<td>25 ml, 10 ml, 5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipette tips</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011</td>
			<td>100 &#181;l, 200 &#181;l, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isolation Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">water bath</td>
			<td>Lauda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peristaltic pump</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circulation thermostat</td>
			<td>Lauda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter</td>
			<td>Schott</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">fine scales</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">stand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B&#252;chner funnel</td>
			<td>Haldenwanger</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">plastic funnel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">silicone tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cannulae with olive tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>12068760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neubauer counting chamber</td>
			<td>Optic Labor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cell lifter</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Drape</td>
			<td>Charit&#233; Universit&#228;tsmedizin Berlin</td>
			<td>A2013027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">compress</td>
			<td>Fuhrmann</td>
			<td>40013331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sterile surgical gloves</td>
			<td>Gammex PF</td>
			<td>1203441104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue glue</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase P</td>
			<td>Roche</td>
			<td>13349524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll Separating Solution</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L6145</td>
			<td>Density 1.124 g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s BSS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H00911-3938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#8217;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15 - 002</td>
			<td>without Mg/Ca</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampuwa</td>
			<td>Plastipur&#160;</td>
			<td>13CKP151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49,361,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes Pufferan&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>133196836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Media Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-005</td>
			<td>Low Glucose (1 g/l) (without L-Glutamine)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES Buffer Solution 1M</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1135546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM NEAA</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15 - 039</td>
			<td>without L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>1137663</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">William&#8217;s E&#160;&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>32551-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">with GlutaMAX&#8482;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03780-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fortecortin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49367</td>
			<td>8 mg/2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human-Insulin</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td>100 I.E./ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-Acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment for Immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD 68</td>
			<td>R&#38;D Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK 19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>D2309</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK18</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>K2105</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vimentin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFAP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>23.472-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-Mouse IgG1-PE</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>C0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>L0412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>1104509006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formaldehyde 4%</td>
			<td>Herbeta Arzneimittel</td>
			<td>200-001-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for isolation of primary human hepatocytes and corresponding major populations of non-parenchymal liver cells

לצד hepatocytes parenchymal, הכבד מכיל תאים שאינם parenchymal (NPC) כלומר תאים Kupffer (KC), תאי אנדותל הכבד (LEC) ותאי stellate הכבד (HSC). דו מימדי (2D) תרבות של hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH) עדיין נחשב &quot;תקן הזהב&quot; במבחנה בדיקות של חילוף החומרים סמים הרעילות. זה ידוע היטב כי monoculture 2D של PHH סובל dedifferentiation ואובדן תפקוד. לאחרונה הודגם כי הכבד NPC למלא תפקיד מרכזי בכבד (patho-) פיזיולוגיה החזקת פונקציות PHH. המחקר הנוכחי מתמקד בשחזור של האדריכלות רקמות in vivo על ידי 3D- ומודלים לתרבות משותפת כדי להתגבר על המגבלות של monocultures 2D. בעבר פרסמנו שיטה לבודדת בתאי כבד אנושיים וחקרתי את התאמתו של תאים אלה לשימושם בתרביות תאים בביולוגיה ניסויית ורפואת 1. בהתבסס על הריבית הרחבה te זהchnique המטרה של מאמר זה הוא לספק פרוטוקול מפורט יותר על תהליך הבידוד כבד התא כולל וידאו, אשר יאפשר רבייה קלה של טכניקה זו. בתאי כבד אנושיים בודדו מדגימות רקמת הכבד האנושי של התערבויות כירורגיות ידי טכניקה P זלוף שני שלבים EGTA / collagenase. PHH הופרד NPC ידי צנטריפוגה ראשונית ב 50 x ז. צעדי צנטריפוגה שיפוע צפיפות שמשו להסרת תאים מתים. אוכלוסיות תאים בכבד הפרט בודדו את שבר NPC מועשר באמצעות מאפייני תאים ספציפיים ונהלי מיון תא. לצד בידוד PHH הצלחנו להפריד KC, הבקר ואת HSC לגידול נוסף. יחדיו, הפרוטוקול המובא מאפשר בידוד של PHH ו NPC באיכות ובכמות גבוהה ממדגם רקמות התורם אחד. הגישה אוכלוסיות תאים בכבד מטוהרים יכול לאפשר יצירה של in vivo כמו li אדםמודלים Ver.

ההפרדה לתוך חלק parenchymal ולא parenchymal, באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות כהליך לנקות בשילוב עם השימוש של נכסים היצמדות MACS מובילה לבידוד PHH ו NPC מוצלח. PHH ו NPC ניתן לבודד באיכות ובכמות גבוהות. איור 1 מציג את התקנת נציג וציוד זלוף והעיכול כבדים. 10% FCS נוס?...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells at JoVE.com

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

protocol-for-isolation-primary-human-hepatocytes-corresponding-major

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Views.  Charité University Medicine Berlin. A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Video: Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

בידוד של הכבד CD133 + בתאי גזע משובטים עבור הרחבת

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

קביעת חומצות שומן החמצון וLipogenesis בעכבר העיקרי hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...