הפרויקט נתמך על ידי NIH NIAID חוזה מס &#39;HHSN2662000500021C. אנו מודים מינג צ&#39;ן סיוע טכני שלו.

1. תוכנית Amaxa 96 גם מעבורת Nucleofector <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתיחת קובץ פרמטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מספר בארות תשתמש עבור transfection תקן ידי גרירת הסמן מעל תרשים 96 את הצלחת היטב. שימוש מינימום של 3 בארות לבריכה למדגם כל הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את קוד התוכנית קלט: ב part1 בחר &#39;FF&#39; ו part2 לבחור &#39;168 &#39;מ למשוך את הנפתחים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ &#39;, מונוציטים האדם &quot;תיבת פתרון לבחור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אפשרות בקרה בחר &#39;רגיל&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על החל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכלול שליטה ללא transfection, בחר בארות נוספות מן התרשים כנדרש ולאחר מכן לבחור &quot;אין בקרה התוכנית&quot; מ אפשרות שליטה ולחץ על החל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בארות בשימוש הנותרים בתרשים צלחת ולחץ על Undefine. </li></ol> 2. הכן DCs עבור transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל עבודה צריך להיעשות בתנאים סטריליים במנדף תא התרבות במידת האפשר. הכן את הפתרון nucleofection ידי הוספת 96-גם תוספת פתרון האדם מונוציטים 96 היטב Nucleofector ביחס של 450-2025. מערבבים ולאפשר כדי לחמם לטמפרטורת החדר. יהיה עליך 20μl של פתרון לכל nucleofection היטב. הפוך את עודף של 10% כדי לאפשר pipetting שגיאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מספר מודולים nucleocuvette שאתה צריך לתוך הצלחת nucleocuvette ב כלומר בכיוון הנכון הכנסת הראשון כדי שורות 1 ו -2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר DCs הדרוש עבור הניסוי שלך בחישוב על 500,000 תאים לכל היטב על ידי גלולה centrifuging ב 400 גרם עבור 10min. הסר בזהירות את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים הפתרון nucleofection ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את נפח הנכון של תאים לתוך resuspended eppendorfs שכותרתו עבור מסוים כגון טיפול Glo ו-לבוש אני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף siRNA 0.25μg לכל 500,000 תאים ומערבבים ידי pipetting. השתמש siRNA ללא מיקוד במדגם שלך ללא transfection שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20μl של תערובות לעיל לתוך מודולים nucleocuvette, על פי פריסת הניסוי שלך, כדי להבטיח את הנוזל מועבר לתחתית הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת nucleocuvette עם המכסה וללחוץ את הצלחת על משטח קשה כמה פעמים כדי להבטיח את סילוק בועות אוויר. </li></ol> 3. Transfect DCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס הצלחת למגש מעבורת Nucleofector 96-טוב, לחץ על Upload ולאחר מכן להתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר התקדמות תהליך transfection בצג העליון הברכיים; צלב שחור על רקע ירוק מסמל transfection מוצלח כל כך טוב, ואילו פס שחור על רקע אדום אומר שזה לא הצליח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום השלמת תהליך transfection, הסר את צלחת ולהוסיף 80μl של המדיום צמיחה DC זה גם בעזרת פיפטה רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת 10 דקות בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נפח 100μl מ nucleocuvettes לתוך צינורות מטריצה ​​המכילה 100μl של המדיום מראש חימם צמיחה DC, שמירה על הכיוון הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורקים אותם צינורות שבו transfection לא התרחשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 עבור מרווח 24h או אחר הזמן הרצוי. </li></ol> 4. להדביק תאים עם NDV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינורות מטריצת מן החממה עד למכסה המנוע לתא תרבות צינורות בריכה מדגם ניסיוני לתוך eppendorfs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים בעדינות על ידי ספינינג בצנטריפוגה גבי השולחן במשך 5 דקות ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בינוני סרום ללא צמיחה המכיל NDV על הפנים של 1 ו לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 דקות 45, עם eppendorfs מכוסה באופן רופף בצורה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 900μl של מדיום הגידול DC, מחדש דגירה של 80-10 ח </li></ol> 5. קציר תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי ספינינג eppendorfs בצנטריפוגה בראש השולחן ולהסיר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים או מיצוי RNA חלבון על פי פרוטוקול שלך. </li></ol> 6. נציג התוצאות: באמצעות פרוטוקול מותאם שלנו transfected DCs עם ריגי במיקוד siRNA למשך 24 שעות ולאחר מכן את התאים הנגועים עם NDV (א paramyxovirus מזוהים על ידי לבוש-I) כדי לעורר את מסלול התגובה אינטרפרון. על ידי ניתוח qRT-PCR הפגנו להפיל של הגן על ידי 75% ברמת שעתוק. אנו הבחנו גם הפחתה דומה בביטוי של IFNβ, שהינה מפעיל במורד הזרם של המתקן, אני במפל IFN איתות. יתר על כן, ראינו כי הביטוי של IFNβ שאינם נגועים, שליטה transfected תאים לא היה להבחין בעוד זה של MxA, גן IFNβ בתגובה במורד הזרם, היה מזערי (איור 1A). Transfection השני של DCs עם ריגי במיקוד siRNA בוצעה באמצעות תאים מספיק כדי לכלול ניתוח כתם המערבי. איפהRT-PCR התוצאות היו דומות למה שראינו בעבר (62% ו -66% להפיל של לבוש, אני וביטוי IFNβ בהתאמה) (איור 1 ב), את כתם המערבי תרה אחר לבוש, אני גילה כי את הביטוי של גן זה היה חסום לחלוטין (תרשים 1C). <img src="/files/ftp_upload/2766/2766fig1.jpg" alt="איור 1 א"/> באיור 1. (א) MoDCs היו transfected עם siRNA או מיקוד חבל, אני או siRNA Glo ספציפי ואת ההשפעה על הביטוי של לבוש, אני IFNβ ו MxA נקבע על ידי qRT-PCR. פרוטוקול transfection בשימוש חיץ מונוציטים ספציפי תוכנית nucleoporation FF168 (Lonza Walkersville Inc) בעקבות הדגירה במשך 24 שעות, תאים transfected היו נגועים או עם NDV (+) או שמאל נגוע (-). לאחר דגירה נוספת עבור 10 שעות, התאים נקצרו רמות RNA תמליל חילוץ לייצג את התוצאות של שני ניסויים לשכפל. הפיקוח בולס ואח&#39; 16. (ב) MoDCs המתקבל מעיל באפי שונים המשמשים איור 1A היו transfected שוב גם עם תלבושת-I-siRNA מיקוד או Glo siRNA ספציפיים באמצעות פרוטוקול transfection כנ&quot;ל. בקרה נוספת באמצעות MoDCs untransfected שולב בניסוי. בעקבות הדגירה 24 שעות כל התאים נדבקו NDV וטופחו במשך 10 שעות נוספות שנקטפו בטרם הן רנ&quot;א מיצוי חלבון. רמות תמליל חבל, אני IFNβ ו MxA כפי שנקבע על ידי qRT-PCR לייצג את התוצאות של שני ניסויים לשכפל. הפיקוח בולס ואח&#39; 16. (C) lysates מתאי המתואר בתרשים 1B לעיל נותחו על ידי כתם המערבי. Lanes 1 ו -2, lysates מתאי untransfected; נתיבים 3 ו -4, lysates מתאי Glo siRNA transfected; נתיבים 5 ו -6, lysates מתאי transfected עם siRNA מעטה אני במיקוד-. דוגמאות נבדקו עבור המתקן, אני גם GAPDH (כמו בקרת העמסה) והיו לרוץ כפולים. הפיקוח בולס ואח&#39; 16.

<ol>
	<li>Reis e Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+dendritic+cells:+translating+innate+into+adaptive+immunity.">Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).</li><li>Bancherau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li><li>Clark, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dendritic+cells+in+the+innate+immune+system.">The role of dendritic cells in the innate immune system.</a> Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).</li><li>Hamm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+method+for+primary+cells.">Efficient transfection method for primary cells.</a> Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).</li><li>Henderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dendritic+cells+genetically+engineered+to+express+high+levels+of+the+human+epithelial+tumor+antigen+mucin+(MUC-1).">Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1).</a> Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).</li><li>Reeves, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+human+dendritic+cells+with+a+tumor-associated+antigen+gene.">Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene.</a> Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).</li><li>Aicher, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+retroviral+mediated+transduction+of+a+reporter+gene+in+human+dendritic+cells:+feasibility+of+therapy+with+gene-modified+antigen+presenting+cells.">Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells.</a> Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).</li><li>Thomas, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+dendritic+cells+by+DNA+viral+vectors+directs+the+immune+response+to+transgene+products+in+muscle+fibers.">Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers.</a> J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).</li><li>Mitchell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-transfected+dendritic+cells+in+cancer+immunotherapy.">RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy.</a> J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).</li><li>Mincheff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+transfection+and/or+cross-priming+of+dendritic+cells+following+DNA+and+adenoviral+immunizations+for+immunotherapy+of+cancer-changes+in+peripheral+mononuclear+subsets+and+intracellular+IL-4+and+IFN-gamma+lymphokine+profile.">In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).</li><li>Roth, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helper-dependent+adenoviral+vectors+efficiently+express+transgenes+in+human+dendritic+cells+but+still+stimulate+antiviral+immune+responses.">Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses.</a> J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).</li><li>Tendeloo, V. F. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells:+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells.">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98, 49-56 (2001).</li><li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoporation+of+dendritic+cells:+efficient+gene+transfer+by+electroporation+into+human+monocyte-derived+dendritic+cells.">Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells.</a> FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).</li><li>Prechtel, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+monocyte-derived+dendritic+cells+by+electroporation.">Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation.</a> J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).</li><li>Bowles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+efficient+high-throughput+plasmid+and+siRNA+transfection+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells+without+cell+maturation.">Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation.</a> J. Immunol. Methods. , .</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response.">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23, 19-28 (2005).</li><li>Kato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MDA5+and+RIG-I+helicases+in+the+recognition+of+RNA+viruses.">Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses.</a> Nature. 441, 101-105 (2006).</li><li>Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mx+GTPase+family+of+interferon-induced+antiviral+proteins.">The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins.</a> Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Transfection יעיל של נאיביות תאים דנדריטים הראשוני חשוב לניתוח תפוקה גבוהה הנדסה לאחור של מסלולים דלקתיים הסלולר בתא מפתח זה מתווך את המעבר מולדת-אדפטיבית החיסונית. עם זאת, רוב החוקרים מוצאים כי התאים האלה קשה transfect הן ביעילות וללא הליך התבגרות transfection גרימת התא כאשר שימוש בטכניקות transfection סטנדרטי. אנו בדקו האם המגבלות האלה אפשר להתגבר על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול גבוהה התפוקה באמצעות סימולטני, מערכת עצמאית 96-היטב מסחרי transfection גרעיני (Lonza). באמצעות ניאון מיון התא הפעיל (FACS), מדדנו GFP-לבטא פלסמיד כסמן ליעילות transfection ו immunoreactivity CD86 ו MHCII כמו readout של התבגרות התא. סדרת ניסויים הערכת מאגרים ותוכניות electroporation זיהה בסופו של דבר התנאים מראה&gt; transfection 50% והעדר גידול סמנים התבגרות. כדי להמשיך לחקור הפעלה אפשרית של DCs על ידי תהליך nucleofection ניתחנו את רמת הביטוי של הגן IFNβ ו MxA הזרם שלה בתגובה ברמת ה-mRNA. MxA הביטוי הוא רגיש להפליא ייצור IFNβ והוא יכול לשמש המבדק לזהות רמות נמוכות מאוד של cytokine18. באמצעות ניתוח qRT-PCR לא ראינו ביטוי IFNβ לזיהוי אבל ראיתי כמה upregulation של MxA ובכך המציין מעל הבסיס אינדוקציה IFNβ. אולם זה upregulation מינימלי של MxA שאינם נגועים, שליטה transfected התאים היה זניח לעומת זה הנובע גירוי וירוס בתיווך של מפל איתות IFNβ (איור 1A) ואישר כי נוכל להשתמש בהצלחה פרוטוקול nucleoporation שלנו transfect DCs ללא הפעלת אותם לרמה משמעותי. השירות של פרוטוקול אופטימיזציה שלנו אושרה על ידי ניתוח כתם המערבי. Transfection של DCs עם siRNA מיקוד חבל, אני גרמה לאובדן מוחלט של חלבון המתקן, אני לגילוי (תרשים 1C). נציין כי עבור ההפרעות מוצלח של גנים אחרים, כמות siRNA בשימוש משך הזמן transfection עשוי להיות מותאם. למיטב ידיעתנו, עבודה זו מאפשרת לראשונה את העיצוב של תפוקה גבוהה הפסד של פונקציה לימודי DCs האנושי הראשוני, ובכך לפתור מכשול קשה מחקר בתחום זה. זה אמור לספק הזדמנויות חדשות עבור המחקר של DC איתות עשוי לתרום להתקדמות בפיתוח DC מבוסס immunotherapies.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד / מגיב </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector 96-היטב מעבורת </td><td> Lonza </td><td> 108S0109 </td><td> מספר סידורי </td></tr><tr><td> Amaxa האדם מונוציטים 96-Kit היטב Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> VHPA-2007 </td><td> מכיל את מונוציטים האדם 96-פתרון טוב Nucleofector, מוסף 96-היטב Nucleocuvettes וצלחות </td></tr><tr><td> חבל, אני siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> L-012511-00 </td><td></td></tr><tr><td> Glo siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-001600-01-20 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td><td> בתוספת FCS 10%, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין לעשות בינוני DC צמיחה </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030081 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> עגל עוברית סרום </td><td> HyClone </td><td> 3,070.03 </td><td></td></tr><tr><td> תאים דנדריטים </td><td> ניו יורק דם במרכז </td><td></td><td> DCs הם מטוהרים מן מעילים באפי באמצעות הליך רגיל </td></tr></tbody></table>

optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation

תאים דנדריטים (DCS) יכול להיחשב זקיפים של המערכת החיסונית אשר לשחק תפקיד קריטי בייזום שלה בתגובה לזיהום 1. זיהוי של אנטיגן פתוגניים ידי DCs נאיבית היא באמצעות הכרה קולטנים דפוס (PRRs) אשר מסוגלים לזהות מבנים ישומרו ספציפי המכונה הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPS). גילוי PAMPs ידי DCs מפעילה מפל איתות תאיים והתוצאה ההפעלה שלהם טרנספורמציה כדי DCs בוגרת. תהליך זה מאופיין בדרך כלל יחד עם ציטוקינים מעודדי דלקת אחרים על ידי ייצור של אינטרפרון מסוג 1, upregulation של תא השטח סמנים כגון MHCII ו CD86 והגירה של DC הבוגרת לבלוטות הלימפה לנקז, שבה האינטראקציה עם בתאי T מפעילה את התגובה החיסונית אדפטיבית 2, 3. לפיכך, DCs הקישור מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. היכולת לנתח את רשתות המולקולריים שבבסיס התגובה DC לפתוגנים שונים חיוני להבנה טובה יותר של ויסות של מסלולים אלו איתות גנים המושרה שלהם. זה אמור גם לעזור להקל על פיתוח של DC מבוסס חיסונים נגד מחלות זיהומיות וגידולים. עם זאת, הקו הזה של המחקר כבר הקשתה קשות הקושי העיקרי transfecting DCs 4. התמרה וירוס שיטות, כגון מערכת lentiviral, משמשים בדרך כלל, אבל לשאת מגבלות רבות כגון המורכבות ביו מסוכנים סיכון (עם העלויות הכרוכות) 5,6,7,8. בנוסף, אספקת המוצרים גנטי נגיפי מעלה את immunogenicity של אלה transduced DCs 9,10,11,12. Electroporation נעשה שימוש עם תוצאות מעורבות 13,14,15, אבל אנחנו הראשונים לדווח על השימוש בפרוטוקול תפוקה גבוהה transfection ו משמעי להפגין השירות שלה. בדוח זה אנו מסכמים פרוטוקול מסחרי אופטימיזציה עבור transfection תפוקה גבוהה של DCs ראשוני האדם, עם רעילות לתא מוגבלת והעדר התבגרות DC 16. יעילות transfection (של ה-GFP הפלסמיד) ואת כדאיות התא היו יותר מ 50% ו -70% בהתאמה. FACS ניתוח הקים את העדר עלייה ביטוי של סמני הבשלה CD86 ו MHCII בתאים transfected, בעוד qRT-PCR הפגינו שום upregulation של IFNβ. שימוש בפרוטוקול זה electroporation, אנו מספקים ראיות transfection מוצלח של DCs עם siRNA ויעיל להפיל של הגן ממוקד תלבושת-I, קולטן מפתח זיהוי נגיפי 16,17, ב-mRNA והן רמות החלבון.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation at JoVE.com

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

optimized-protocol-for-efficient-transfection-dendritic-cells-without

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.2K Views.  Mount Sinai School of Medicine. אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.

Video: Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

ניתוח של התבגרות ריאתי Cell Migration הדנדריטים ובמהלך דלקת אלרגית Airway

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university centers worldwide. While ECP&#8217;s clinical efficacy and exemplary safety profile have driven its widespread use, elucidation of the underlying mechanisms has remained a challenge, partly owing to lack of a laboratory ECP model. To overcome this obstacle and create a simple, user-friendly platform for ECP research, we developed a scaled-down version of the clinical ECP leukocyte-processing device, suitable for work with both mouse models, and small human blood samples. This device is termed the Transimmunization (TI) chamber, or plate. In a series of landmark experiments, the miniaturized device was used to produce a cellular vaccine that regularly initiated therapeutic anti-cancer immunity in several syngeneic mouse tumor models. By removing individual factors from the experimental system and ascertaining their contribution to the in vivo anti-tumor response, we then elucidated key mechanistic drivers of ECP immunizing potential. Collectively, our results revealed that anti-tumor effects of ECP are initiated by dendritic cells (DC), physiologically generated through blood monocyte interaction with platelets in the TI plate, and loaded with antigens from tumor cells whose apoptotic cell death is finely titrated by exposure to the photoactivatable DNA cross-linking agent 8-methoxypsoralen and UVA light (8-MOPA). When returned to the mouse, this cellular vaccine leads to specific and transferable anti-tumor T cell immunity. We verified that the TI chamber is also suitable for human blood processing, producing human DCs fully comparable in activation state and profile to those derived from the clinical ECP chamber. The protocols presented here are intended for ECP studies in mouse and man, controlled generation of apoptotic tumor cells with 8-MOPA, and rapid production of physiologic human and mouse monocyte-derived DCs for a variety of applications.

The transimmunization (TI) device or plate and related protocols have been developed to replicate the key features of extracorporeal photochemotherapy (ECP), in an experimental setting, allowing for production of physiologically activated, tunable dendritic cells (DCs) for cancer immunotherapy.

הפרוטוקול הרומן ליצירת תאי הדנדריטים הפיזיוגניים האימונולוגיים

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...