המחברים מבקשים להודות לאנדרס סלזר (Oncovir, Inc) על המתנה של פולי-ICLC.

1. בידוד וCryopreservation של PBMCs 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקי מחיידקי ספייק אחת מיציאות הגישה בתיק leukapheresis באמצעות מערך העברת פלזמה. באמצעות מזרק 60 מ&quot;ל, להעביר leukapheresis מתקבל מחולים לתוך בקבוק 500 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת קול של leukapheresis ל2x נפחו המקורי תוך שימוש בטמפרטורת החדר RPMI. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות את בקבוק Ficoll-Paque PLUS. הוסף PLUS 12 מיליליטר Ficoll-Paque לתוך צינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שכבה 30 מ&quot;ל של מוצר leukapheresis המדולל לכל צינור 50 מיליליטר סטרילי חרוטי המכיל Ficoll. היזהר שלא להפריע לממשק שבין Ficoll והשעית תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.3 ו -1.4 עד שכל leukapheresis כבר שכבתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל ב 1000 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר, ללא בלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את השכבה העכורה של PBMCs זהירות מצינור אחד וtransfeR לצינורות 50 מ&quot;ל סטרילי החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף RPMI על צינור אחד לנפח סופי של 50 מ&quot;ל. מערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 500 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C עם בלם מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatants מצינור אחד. Resuspend את כדורי תא מצינור אחד ולהוסיף RPMI לנפח סופי של 50 מ&quot;ל. מערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 500 × גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatants מצינור אחד. Resuspend ובריכת יחד את השעיות התא לתוך צינור אחד 50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הנפח של PBMCs אספו עד 50 מ&quot;ל עם יותר RPMI. מערבבים בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 300 × גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. Resuspend התא גלולה ב 50 מ&quot;ל RPMI. מערבבים בעדינות כדי להבטיח השעיה תא אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התאים ולקבוע כדאיות תא. לחשב את המספר הכולל של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 300× גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C. הכן את התקשורת המקפיא. תקשורת הקפאה מורכבת של 10% sulfoxide דימתיל (DMSO; Miltenyi BIOTEC) באדם א.ב. סרום (העמק ביו רפואית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. Resuspend התאים בריכוז סופי של 2 x 10 8 תאים / מ&quot;ל בתקשורת קרה וקפואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 aliquots מ&quot;ל ב1.8 cryovials מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את cryovials למקפיא מבוקר השיעור ולהתחיל את ריצת ההקפאה, 1 תכנית. בסוף הריצה, להעביר את cryovials הקפוא מייד לשלב אדים מהמקפיא החנקן הנוזלי. </li></ol> 2. 0 יום: התמיינות של תאי דנדריטים ממונוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 מ&quot;ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית לצינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> aliquots ההפשרה של PBMCs הוקפא על ידי תסיסה עדינה באמבט המים 37 מעלות צלזיוס. כשהפשיר לחלוטין, להעביר את התוכן של הבקבוקונים לצינור סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים במשך 6 דקותב500 × גרם בטמפרטורת חדר. הסר את supernatant ו resuspend תאי pelleted בנפח קטן של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. ואז להוסיף עוד RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית לנפח סופי של 50 מ&quot;ל. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים שוב במשך 6 דקות ב 500 × גרם בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ו resuspend את הכדור ב 50 מ&quot;ל RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התאים ולקבוע כדאיות תא. לחשב את המספר הכולל של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 1.40 x 10 8 תאים ב40 מ&quot;ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית על EasyFlask 225 ס&quot;מ 2. חזור על פעולה עד שמצופים כל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה EasyFlasks השטוחות בצד שלה - 1 שעת 2 ב 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה המכילה 5% CO 2 כדי לאפשר את מונוציטים לדבוק בבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדגירה תושלם, להסיר EasyFlask מהחממה ולשטוף פעמיים כדי להסיר את התאים שאינם חסיד USIמיליליטר ng 30 מתוך prewarmed RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף את השני, להוסיף 40 מ&quot;ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית עם 400-1,000 IU / מ&quot;ל IL-4 ו100-1,000 IU / מיליליטר GM-CSF 5-8. לפרוטוקול זה, אנו משתמשים 400 IU / מיליליטר IL-4 ו 100 IU / מיליליטר GM-CSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה EasyFlasks עבור 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה המכילה 5% CO 2. </li></ol> 3. יום 2: האכלה של תאים דנדריטים עם IL-4 ו-GM-CSF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית עם 400-1,000 IU / מ&quot;ל ​​IL-4 ו100-1,000 IU / מ&quot;ל ​​GM-CSF לכל EasyFlask. מערבבים על ידי מתערבל ומתנדנד על צידו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה EasyFlasks לעוד 3 ימים (עד יום 5) על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה המכילה 5% CO 2. </li></ol> 4. יום 5: קצירה של תאי דנדריטים לא בוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את התרבויות על ידי נמרצות מתערבל את צלוחיות ועל ידי pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend תאים שאינם חסיד וחסידים רופף. העברתאים שנקטפו לצינורות חדשים 50 מ&quot;ל החרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב 500 × גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את supernatants ו resuspend התא גלולה ב 50 מ&quot;ל RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התאים ולקבוע כדאיות תא. לחשב את המספר הכולל של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב 500 × גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. פלייט 1-2 x 10 6 תאים לכל גם ב3 מ&quot;ל RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית עם 400 IU / מ&quot;ל IL-4 ו 100 IU / מיליליטר GM-CSF בצלחות תרבית רקמת 6 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה המכילה 5% CO 2 למשך הלילה. </li></ol> 5. יום 6: התבגרות וטוען Antigen של תאים דנדריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיקרוגרם / מיליליטר KLH עד 1/3 מהבארות בתרבות הצלחות 6 גם. לערבל את הצלחות לתערובת. KLH הוא הוסיף רק עד 1/3 מהבארות בגלל KLH משמש לחיסון DC הראשון בלבד. קון חיסוני DC לאחרTain רק פפטידים אנטיגן הסרטניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכול להיות מגורה DCs להתבגר באמצעות גירויים שונים. הגירויים ההתבגרות הנפוצים ביותר שבו נעשה שימוש במחקרים קליניים כבר קוקטייל של ציטוקינים (IL-1 β, TNFα, ו-IL-6) וE2 פרוסטגלנדין (PGE 2) 9,10. לאחרונה, השימוש בחיוג כמו קולט (TLR) אגוניסטים צבר פופולריות 11,12. בפרוטוקול זה, להוסיף 2 מ&quot;ג / carboxymethylcellulose חומצה פולי-L-ליזין Polyinosinic-Polycytidylic מ&quot;ל (פולי-ICLC) לבארות ומערבבים היטב. Poly-ICLC הוא הניסוח קליני כיתה של פולי-IC שהוא התייצב עם פולי-L-*-ליזין וcarboxymethylcellulose (מיוצר על ידי Oncovir, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 מיקרוגרם / אנטיגנים פפטידים ארוכים מ&quot;ל (NY-ESO-1 ו / או Melan-A/MART-1) לבארות המיועדות שלהם, כל אחד מקבל רק פפטיד יחיד למניעת הצטלבות תחרות 13 כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת חממה המכילה 5% CO &lt;תת&gt; 2 O / נ </li></ol> 6. יום 7: Cryopreservation של תאי דנדריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון מקפיא DC באמצעות הפלזמה אוטולוגית ו10% DMSO. צנטריפוגה הפתרון מקפיא DC ב 2000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי להסיר חומר חלקיקים כל. העבר את supernatant לצינור חדש שכותרת מ&quot;ל 15 חרוטי. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדגירה הלילה הוא סיים, קציר ובריכת את כל הבארות המכילות DCs פעם עם פפטידים לתוך צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב 500 × גרם במשך 6 דקות. הסר את supernatants. Resuspend התא גלולה ב 5 מ&quot;ל של RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. תביא את הנפח הכולל של עד 50 מ&quot;ל עם RPMI / 1% פלזמה אוטולוגית. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התאים ולקבוע כדאיות תא. חישוב מספר כולל של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות ב 500 × גרם במשך 6 דקות בטמפ &#39;החדר. הסר את supernatants וresuspend כל גלולה ב 5 מ&quot;ל SteriLe 0.9% NaCl, USP והעברה לצינורות חדש 15 מ&quot;ל החרוטים. להביא כל השעיה תא 14 מ&quot;ל עם סטרילי יותר 0.9% NaCl, USP. כובע ומערבב על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב קודם פעמיים. לאחר צנטריפוגה האחרונה, להסיר את supernatants, מקבל קרוב ככל האפשר לכדורי התא מבלי להפריע את כדורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי תא הקפאה בפתרון DC ב4 - 20 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ומיליליטר aliquot 1 לכל בקבוקון cryotube 1.8 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מבוקר שיעור המקפיא, תכנית 1, להקפיא במורד aliquots של חיסוני DC ולהעביר מייד לשלב האדים של מקפיא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. </li></ol> 7. בדיקת שחרור הרבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מנה של חיסון DC חייבת להיות מוערכת ועומדות בקריטריונים לשחרור הרבה ספציפיים (טבלת 1) לפני שהוא שוחרר להזרקה לחולים שהשתתפו במחקר, בדרך כלל 5 עד 6 שבועות לאחר הכנת חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדאיות:להעריך את הכדאיות של חיסון DC באמצעות מונה תא אוטומטי. מפרט הכדאיות המקובל המינימום הוא&gt; 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהות: להעריך את זהותו של DCs הבוגר (CD11c + CD14-CD83 +) על ידי cytometry הזרימה. אחוז + תאי CD11c צריך להיות&gt; 50%. אחוז CD11c + ו CD14 + התאים צריך להיות &lt;30% ואחוז CD11c +, CD14-, וCD83 + תאים צריכים להיות&gt; 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקרות: מבחן חיסון DC לנוכחות של חיידקים אנאירוביים ואירוביים ופטריות על ידי תרבות הישירה וכתמי גרם. להעריך את קיומו של Mycoplasma באמצעות מערכת תרבות ישירה ו assay מכתים fluorochrome DNA עם שורת תאי מחוון. לבדיקות אלה, סט המפרט המינימאלי הוא שאין צמיחה נצפתה מכל התרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעלן פנימי: הערכת תוכן רעלן פנימי באמצעות assay LAL chromogenic הקינטית קינטי-QCL וזה חייב להיות &lt;50 איחוד אירופי / מ&quot;ל על מנת לעמוד בקריטריונים המינימאליים. </li><lאני&gt; תפקיד: להעריך את תפקוד DC בתגובת הלימפוציטים מעורב על ידי דגירה עם תאי T אלוגנאית. הנוכחות של התפשטות לעומת DCs unstimulated מדווחת (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+vaccines+in+melanoma:+from+promise+to+proof.">Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).</li><li>Sabado, R. L., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+dendritic+cell+immunotherapy+towards+successful+cancer+treatment.">Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.</a> Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).</li><li>Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keyhole+limpet+hemocyanin+(KLH)+conjugate+vaccines+as+novel+therapeutic+tools+in+malignant+disorders.">Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).</li><li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient.">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).</li><li>Eichler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+study+on+in+vitro+characterization+of+dendritic+cells.">Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells.</a> Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).</li><li>Feuerstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+cryopreserved+aliquots+of+antigen-preloaded,+mature+dendritic+cells+ready+for+clinical+use.">A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use.</a> J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).</li><li>O'Neill, D., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+autologous+peptide-+and+protein-pulsed+dendritic+cells+for+patient-specific+immunotherapy.">Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy.</a> Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).</li><li>de Vries, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypical+and+functional+characterization+of+clinical+grade+dendritic+cells.">Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells.</a> J. Immunother. 25, 429-438 (2002).</li><li>Jonuleit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+cytokines+and+prostaglandins+induce+maturation+of+potent+immunostimulatory+dendritic+cells+under+fetal+calf+serum-free+conditions.">Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.</a> Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).</li><li>Lee, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+grade+cocktail+of+cytokines+and+PGE2+results+in+uniform+maturation+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells:+implications+for+immunotherapy.">A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy.</a> Vaccine. 20, A8-A22 (2002).</li><li>Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+immune+system+to+treat+cancer.">Harnessing the immune system to treat cancer.</a> J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).</li><li>Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+agonists:+are+they+good+adjuvants?.">Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?.</a> Cancer J. 16, 382-391 (2010).</li><li>Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+dominance,+competition+and+T+cell+affinity+maturation.">Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation.</a> Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).</li><li>Bogunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR4+engagement+during+TLR3-induced+proinflammatory+signaling+in+dendritic+cells+promotes+IL-10-mediated+suppression+of+antitumor+immunity.">TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity.</a> Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).</li><li>Verdijk, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyriboinosinic+polyribocytidylic+acid+(poly(I:C))+induces+stable+maturation+of+functionally+active+human+dendritic+cells.">Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells.</a> J. Immunol. 163, 57-61 (1999).</li><li>Rouas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(I:C)+used+for+human+dendritic+cell+maturation+preserves+their+ability+to+secondarily+secrete+bioactive+IL-12.">Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12.</a> Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).</li><li>Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th1-polarizing+capacity+of+clinical-grade+dendritic+cells+is+triggered+by+Ribomunyl+but+is+compromised+by+PGE2:+the+importance+of+maturation+cocktails.">Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails.</a> J. Immunother. 28, 480-487 (2005).</li><li>Krause, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+is+a+key+factor+for+monocyte-derived+dendritic+cell+maturation:+enhanced+T+cell+stimulatory+capacity+despite+IDO.">Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO.</a> J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).</li><li>Morelli, A. E., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+under+the+spell+of+prostaglandins.">Dendritic cells under the spell of prostaglandins.</a> Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).</li><li>Adams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+(DC)+based+therapy+for+cervical+cancer:+use+of+DC+pulsed+with+tumour+lysate+and+matured+with+a+novel+synthetic+clinically+non-toxic+double+stranded+RNA+analogue+poly+[I]:poly+[C(12)U]+(Ampligen+R).">Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R).</a> Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).</li><li>Colombo, M. P., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-12+in+anti-tumor+immunity+and+immunotherapy.">Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).</li><li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity.">Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).</li><li>Dhodapkar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+broad+T-cell+immunity+in+humans+after+a+single+injection+of+mature+dendritic+cells.">Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells.</a> J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).</li><li>Schuler-Thurner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+tumor-specific+type+1+T+helper+cells+in+metastatic+melanoma+patients+by+vaccination+with+mature,+cryopreserved,+peptide-loaded+monocyte-derived+dendritic+cells.">Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells.</a> J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).</li></ol>

החוקרים קיבלת תמיכה כספית מהפעולות הבאות: NIH (AI061684, AI071078, AI044628, וK08 AI084578 (מילר)), ביל ומלינדה גייטס קרן, קרן הצדקה של דוריס דיוק, לחקר סרטן במכון, למחקר לופוס ברית, ואמרלד קרן. נינה Bhardwaj הוא coinventor על פטנטים הקשורים להכנה ושימוש בתאים דנדריטים לתפעל חסינות. יש החוקרים אין השתייכות רלוונטיות אחרות או מעורבות כספית עם כל ארגון או ישות עם אינטרס כלכלי בסכסוך כספי או עם העניין או חומרי הנושא נדון בכתב היד מלבד אלה פורסמו.

השלב I ו-II של ניסויים קליניים DCs מונוציטים הנגזרות הראו כי הם לעורר תגובות חיסוניות בחולים עם זאת הצלחה קלינית הייתה מוגבלת 1. זה עשוי להיות בחלקו בשל חוסר הסכמה על איך ליצור את DCs האופטימלי לשימוש immunotherapeutic גידול. אמנם יש דרכים רבות כדי ליצור DCs הקליני בדרגה, בשיטו...

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td fo:width="2in">Reagent/Supplies/Equipment</td>
 <td>Manufacturer</td>
 <td>Catalog No.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI-1640 medium with L-glutamine</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>12-702F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1M HEPES buffered saline</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>17-737E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
 <td>BioWhittaker</td>
 <td>17-516F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human albumin, 25% solution USP</td>
 <td>Aventis Behring</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5442-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human AB serum</td>
 <td>Valley Biomedical</td>
 <td>HP1022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile saline USP</td>
 <td>Hospira</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CryoMACS DMSO </td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>170-076-303</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml</td>
 <td>Berlex</td>
 <td>A02266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MACS GMP IL-4</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>170-076-101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td>
 <td>Oncovir</td>
 <td>NA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VACMUNE KLH</td>
 <td>Biosyn</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>225 sq cm EasyFlasks</td>
 <td>Nalgene Nunc</td>
 <td>159934</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Falcon 6-well tissue culture plates</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml CryoTube vials</td>
 <td>Nalgene Nunc</td>
 <td>377267</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Controlled Rate Freezer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>CryoMed</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy

בעוד שמחקרים קליניים הוכיחו שהחיסונים DC אנטיגן טעונים בטוחים ומבטיחים לטיפול בגידולים 1, היעילות הקלינית שלהם עדיין לא הוקמה. השיטה המתוארת להלן, ערוכה בהתאם לתהליך ייצור טוב (GMP) הנחיות, היא אופטימיזציה של שיטת הכנת vivo לשעבר הנפוצה ביותר ליצירת מספר רב של מחקרים קליניים לDCs 2. השיטה שלנו מנצלת את TLR הסינטטי 3 אגוניסט carboxymethylcellulose חומצה פולי-L-ליזין Polyinosinic-Polycytidylic (פולי-ICLC) כדי לעורר את DCS. המחקר הקודם שלנו הוקם שפולי-ICLC הוא גירוי התבגרות הפרט החזק ביותר לDCs אדם כפי שהוערך על ידי גברת ביטוי של CD83 וCD86, אינדוקציה של interleukin-12 (IL-12), גורם נמק גידול (TNF), אינטרפרון גאמא-Induced חלבון 10 (IP-10), 1 interleukmin (IL-1), וסוג שהאינטרפרונים (IFN), והמינימאלי אינטרלוקין 10 (IL-10) ייצור. </p&gt; DCs הם מובחנים מתאי קפואים דם היקפי (mononuclear PBMCs) המתקבלים על ידי leukapheresis. PBMCs מבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll וקפוא בaliquots. ביום 1, PBMCs הם הפשירו ומצופה על צלוחיות תרבית רקמה כדי לבחור למונוציטים שנצמדים למשטחי הפלסטיק לאחר דגירה 1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה. לאחר דגירה, הלימפוציטים הם לשטוף ומונוציטים חסיד בתרבית במשך 5 ימים בנוכחות של interleukin-4 (IL-4) וגורם מגרה מקרופאג&#39;ים מושבה granulocyte (GM-CSF) כדי לבדל לDCs בשלה. ביום 6, DCS בשלה הם פעמו עם חלבון hemocyanin עלוקת חור המנעול (KLH) המשמש כבקרה לאיכות של החיסון ועלולים להגביר את התגובה החיסונית של החיסון 3. את DCs מומרצים להבשיל, עמוס אנטיגנים פפטיד, וטופחו במשך הלילה. ביום 7, התאים נשטפים, וקפוא ב1 aliquots מ&quot;ל המכיל4 - 20 x 10 6 תאים באמצעות מקפיא מבוקר שיעור. בדיקות שחרורו הרבה לקבוצות של DCs מבוצעת וחייבות לעמוד במפרט מינימאליים לפני שהם מוזרקים לחולים.

בין 10 ל - 20% של PBMCs מתחיל להתמיין DCs בסוף תקופת התרבות. DCs בוגרת הן CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, וCCR7 + (איור 1). הם מבטאים רמות גבוהות של MHC כיתה אני ומולקולות השנייה ואת מולקולות costimulatory CD80 ו CD86. Poly-ICLC גם מושרה רמות נמוכות יותר של PDL-1, בהשוואה לאגוניסטים TLR האחרים 14. בנוסף, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy at JoVE.com

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

השיטה הנפוצה ביותר להפקת כמויות גדולות של תאים דנדריטים אוטולוגי (DCS) לשימוש באימונותרפיה גידול מתוארת. השיטה משתמשת IL-4 ו-GM-CSF להבדיל מDCs מונוציטים. את DCs הבוסר הוא גירוי לבוגרת ולאחר מכן נטען עם אנטיגנים לפני שהם מוזרקים חזרה לחולה.

הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

preparation-tumor-antigen-loaded-mature-dendritic-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.1K Views.  NYU Langone Medical Center. השיטה הנפוצה ביותר להפקת כמויות גדולות של תאים דנדריטים אוטולוגי (DCS) לשימוש באימונותרפיה גידול מתוארת. השיטה משתמשת IL-4 ו-GM-CSF להבדיל מDCs מונוציטים. את DCs הבוסר הוא גירוי לבוגרת ולאחר מכן נטען עם אנטיגנים לפני שהם מוזרקים חזרה לחולה.

Video: Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

בידוד של ריאות תאים דנדריטים עכבר

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

דור של תאי T CAR למאמצת תרפיה בהקשר של גליובלסטומה טיפול סטנדרטי

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university centers worldwide. While ECP&#8217;s clinical efficacy and exemplary safety profile have driven its widespread use, elucidation of the underlying mechanisms has remained a challenge, partly owing to lack of a laboratory ECP model. To overcome this obstacle and create a simple, user-friendly platform for ECP research, we developed a scaled-down version of the clinical ECP leukocyte-processing device, suitable for work with both mouse models, and small human blood samples. This device is termed the Transimmunization (TI) chamber, or plate. In a series of landmark experiments, the miniaturized device was used to produce a cellular vaccine that regularly initiated therapeutic anti-cancer immunity in several syngeneic mouse tumor models. By removing individual factors from the experimental system and ascertaining their contribution to the in vivo anti-tumor response, we then elucidated key mechanistic drivers of ECP immunizing potential. Collectively, our results revealed that anti-tumor effects of ECP are initiated by dendritic cells (DC), physiologically generated through blood monocyte interaction with platelets in the TI plate, and loaded with antigens from tumor cells whose apoptotic cell death is finely titrated by exposure to the photoactivatable DNA cross-linking agent 8-methoxypsoralen and UVA light (8-MOPA). When returned to the mouse, this cellular vaccine leads to specific and transferable anti-tumor T cell immunity. We verified that the TI chamber is also suitable for human blood processing, producing human DCs fully comparable in activation state and profile to those derived from the clinical ECP chamber. The protocols presented here are intended for ECP studies in mouse and man, controlled generation of apoptotic tumor cells with 8-MOPA, and rapid production of physiologic human and mouse monocyte-derived DCs for a variety of applications.

The transimmunization (TI) device or plate and related protocols have been developed to replicate the key features of extracorporeal photochemotherapy (ECP), in an experimental setting, allowing for production of physiologically activated, tunable dendritic cells (DCs) for cancer immunotherapy.

הפרוטוקול הרומן ליצירת תאי הדנדריטים הפיזיוגניים האימונולוגיים

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...