מתיו או &#39;סאליבן ואת פיי ג&#39;ואו הם מקבלי האוסטרלית הלאומית לבריאות המועצה למחקר רפואי לתארים מתקדמים מלגות למחקר רפואי.

בחינה קפדנית חייב להינתן פריימר ועיצוב החללית. רצפים זמין כל היעדים של עניין ממסדי נתונים כגון GenBank צריך להיות מנוצל כדי לזהות אזורים שמורים אשר הם מטרות מתאימות. איפה מספר רב של מטרות נמצאים מוגבר ב assay mPCR יחיד, כל רצף מוגבר צריכה להיות באורך דומה, לא יעלה על 300 זוגות בסיסים, כדי למנוע תחרות. יישום החלופה של השיטה היא כדי להגביר עוד יעד אחד באמצעות primers נגד אזורים שימור להשתמש בדיקות מרובות כדי לזהות וריאציה רצף בתוך amplicon. במקרה זה, המוצר מוגבר PCR עשוי להיות ארוך יותר. הטמפרטורות פריימר חישול צריכים להיות דומים, עם תנאים PCR בהתאם. Primers המהווים מבנה משני חזקה או דימר פריימר יש להימנע. סיגמא אולדריץ DNA מחשבון ( <a href="http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp">http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp</a> ) ניתן להשתמש כדי לנבא תכונות אלה. בדיקות ה-DNA צריך להיות מתוכנן להיות חישול בטמפרטורה קרובה ל -60 ° C. כדי למקסם את סגוליות, שתי חלליות עבור מטרה כל העניין ניתן לכלול assay, אחד והכלאה על גדיל ה-DNA קדימה סמוך לאתר פריימר הפוך מחייב, והשני גדיל הפוכה סמוך לאתר פריימר קדימה מחייב. במקרה זה, הן primers קדימה חייבת להיות הפוכה ביוטין, שונה. אם רק אחד בדיקה לכל מטרה מוגבר נמצא בשימוש, אז רק אחד פריימר צריך להיות ביוטין שונה. בעת תכנון primers ו בדיקות עבור assay mPCR / RLB מומלץ בחום להשתמש בשיטות סיליקו לחזות מוצרי ה-PCR ו הכלאה בדיקה כדי לתאם עם בתוצאות חוץ גופית. באופן אידיאלי זה נעשה באמצעות מבודד עבורו את רצף הגנום כולו זמין. תוכנות כגון FastPCR (זמין ב http://primerdigital.com/fastpcr.html) יכול לשמש למטרה זו. אות בדיקה חלש או נעדר ניתן לחזות היכן בניתוח סיליקו מציין זוג בסיס חוסר התאמה וכתוצאה מכך הטמפרטורות בדיקה נמוך חישול. טכניקות DNA מיצוי ישתנו בהתאם דגימות נבדקות, ותנאי PCR יהיה תלוי בעיצוב פריימר. הקוראים מתייחסים לפרסומים על מבחני הפרט לקבל מידע נוסף לגבי מיצוי דנ&quot;א ריאגנטים PCR ותנאי 1-19. Assay כל לרוץ עם בקרה נאותים כדי לספק לפחות אחת חיובית ואחת שלילית אות בדיקה עבור כל בדיקה על הממברנה, וכן דנ&quot;א ללא שליטה. כמו כן הוא מועיל לכלול בדיקה בחלק העליון של קרום זה צפוי להיות חיובי עבור כל דגימות (למשל: מין או בדיקה ספציפית הסוג במקרה של מיקרו אורגניזם). בדיקה זו משמשת שליטה חיובית, אלא גם מאפשר התמצאות קלה של התוצאות. 1. הכנת ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ל NaHCO3 0.5m (pH 8.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ל NaHCO 3 0.5m </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;ל 16% EDAC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל 0.1 M NaOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל 2xSSPE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.1% - מקום waterbath ב 60 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל 20 mM EDTA. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים תנור ל 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את Miniblotter Immunetics עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את בדיקות oligonucleotide ב 0.5 M NaHCO 3 עד ריכוז סופי של pmol 2 / μl ואת נפח של μl 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור קרום ניילון BiodyneC עד 15x15 ס&quot;מ. בעזרת עיפרון שליט, כלל את חלל 0.5 ס&quot;מ לרוחב החלק העליון של קרום ולכתוב פרטים כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום חותם בתוך שקית ניילון עם 20 מ&quot;ל טרי עשה פתרון EDAC 16% ו רוק בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף במים deionised קרום למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קרום ב miniblotter עם ערוצי פועל על פני קרום (במקביל לקו עיפרון). שימי כרית תמיכה במקומו הסופג קרוב. לשאוב נוזל מתוך ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי נתיבים 1 ו 45 עם 150 μl 0.5 M NaHCO 3. השתמש 150 μl של כל פתרון בדיקה למלא נתיבי 2-44 ברצף, להיות זהיר, כדי למנוע בועות אוויר. אם בועת אוויר מופיע בערוץ, שמירה על פיפטה במקום, במהירות לשאוב את הפתרון כדי לאפשר את בועת אוויר לצוף לראש פיפטה, ולאחר מכן נסה שוב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פתרונות בדיקה, להסיר ולשטוף בתוך קרום 250 מ&quot;ל 0.1 M NaOH בטמפרטורת החדר למשך 9 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום ב 250 מ&quot;ל 2xSSPE למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום ב 250 מ&quot;ל מראש חימם SDS 2xSSPE/0.1% בתנור ב 60 ° C במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא בשימוש הכלאה מיד, לשטוף את הממברנה של 240 מ&quot;ל 20 mM EDTA בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות (שומר 10 מ&quot;ל הנותרים), ואז לאטום קרום בתוך שקית פלסטיק עם שאר 10 מ&quot;ל 20 mM EDTA ו storדואר במקרר ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם miniblotter Pyroneg חומר ניקוי במברשת. לשטוף ולאפשר לו להתייבש. </li></ol> 2. הכלאת איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.1% - חנות באמבט מים ב 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.5% - חנות באמבט מים ב 60 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.5% - חנות בתנור ב 42 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל 2xSSPE - לשמור בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל 1% SDS - חנות באמבט מים ב 60 ° C בתחילה (עבור שלב 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל 20 mM EDTA - לאחסן בטמפרטורת החדר (עבור שלב 3). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תנור אחד בכל 60 ° C ואחד תנור ל 42 ° C. מרתיחים את המים בכוס גדולה על פלטה חמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה Immunetics Miniblotter עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 10 מ&quot;ל של SDS 2xSSPE/0.1% לתוך מיכל קטן. הוסף 20 μl של כל מוצר ה-PCR ל 150% SDS 2xSSPE/0.1 μl צינורות ספורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים מוצרים PCR עבור 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס באמצעות בעלי קלקר. מניחים על קרח מיד לפחות 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום הנותרים ב 240 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.1% ב 60 ° C בתנור במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קרום ב miniblotter עם כרית גיבוי. כדי להתמצא ערוצי לרוץ במאונך (בניצב קו עיפרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עודף יניקה נוזל ערוצי miniblotter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הנותרים 150 SDS 2xSSPE/0.1% μl לערוצים הראשונה והאחרונה. הוסף מבושל מוצרים PCR לערוצים הנותרים (2-44) ברצף, להיות זהיר, כדי למנוע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום miniblotter שטוח 60 ° C בתנור במשך שעה 1 כדי לאפשר הכלאה להתקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל לשאוב מערוץ אחד ולאחר מכן להסיר קרום מן miniblotter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים prewarmed 250 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.5% בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלח רשת ניילון עם הפרדה SDS 2xSSPE/0.5% ב 42 ° C ולהשתמש בו כדי להפשיל הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מגולגל הממברנה לתוך צינור גלגלת, ואת לפרוש כדי להבטיח קרום abuts את פני השטח הפנימי. הוסף 3 μl המצומד streptavidin-peroxidase (Roche Applied Science) על 15 מ&quot;ל SDS 2xSSPE/0.5% ב 42 ° C ולהוסיף צינור הרים. בורג מכסה על בחוזקה דגירה בתנור רולר על 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. ודא כיוון רול הוא כזה קרום לא להדק. בדוק מעת לעת דליפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף miniblotter ב Pyroneg דטרגנט ומים, לשטוף ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת קרום מהצינור הרים. לשטוף פעמיים הנותרים 2xSSPE/0.5% SDS על 42 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים 2xSSPE בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התנור עד 80 מעלות צלזיוס, במקום 1% SDS 500ml בתנור חם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאפרים 15 מ&quot;ל Amersham פתרון ECL זיהוי (7.5 מ&quot;ל של תמיסת A ו 7.5 מ&quot;ל של תמיסת B). בטל 2xSSPE ולהוסיף פתרון זיהוי. רוק בעדינות ביד במשך 2 דקות להבטיח כיסוי מלא של הממברנה עם פתרון. בטל פתרון chemiluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים שתי יריעות של ניילון שקיפות כדי להתאים מחסנית חשיפה. המקום קרום בין שני סדינים במקום לתוך מחסנית חשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך אל החושך. תחת אור אדום, להוסיף סרט זיהוי ECL למחסנית ולחשוף במשך 5 דקות. כלב באוזן ימין בפינה התחתונה של הסרט עם הסרת לאפשר בכיוון הנכון בעת ​​הצפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרט פתח עם מפתח אוטומטיות או אמבטיות כימיים כמו יצרן לכל הכיוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על החשיפה פעמים עם חשיפה ארוך או קצר אם נדרש. </li></ol> 3. התחדשות של ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 250 מ&quot;ל ב SDS 1% ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום 240 מ&quot;ל ב 20 מ&quot;מ EDTA בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם קרום בשקית פלסטיק עם 10 מ&quot;ל 20 mM EDTA ושומרים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש מחדש בעתיד. </li></ol> 4. נציג תוצאות: התוצאות הן הנצפים ביותר על ידי הצבת את הסרט על הרשת מודפס, או אחר סריקת תמונה וייבוא ​​לתוך התוכנה כגון BioNumerics (יישומי מתמטיקה, Sint-מרטנס-Latem, בלגיה). התוצאה בכל בדיקה יש לפרש תוך התייחסות בדיקות בקרה חיוביים ושליליים. התוצאות מדורגות כמיטב שלילי או חיובי חלש. תוצאות חיוביות שבו האות חזק כמו או יותר חזק לחקור את השליטה חיובית. תוצאות שליליות הן שם האות נעדר או שווה לשלוט השלילי (במקרה של אות הרקע). תוצאות חלשות הם שבו האות חלש יותר מאשר לחקור את השליטה חיובי, אבל חזק יותר שליטה שלילית. תוצאות חלש עשוי להיות תוצאה של מוטציות נקודה המוביל מחייב בדיקה חלש, או בשל אי - ספציפי אותות היווצרות dimer פריימר. באמצעות שתי בדיקות לכל יעד הריבית יכולה לשפר את הספציפיות, שם תוצאה חלשה יחיד יכול בבטחה להתפרש האות הלא ספציפית. אם נותר ספק כלשהו, ​​תגובה אחת Plex PCR ניתן לבצע עם זיהוי הג&#39;ל מבוסס רצף של המגבר כלlified מוצר כדי לקבוע אם התוצאה היא חיובית באמת. התוצאה נציג מוצג באיור 2. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig1.jpg" alt="איור 1"/> 1. איור mPCR / RLB עקרונות (P1) שלב 1.9. אמין בדיקות שונה קשורים קוולנטית אל קרום ניילון. (P2) שלב 2.10. ביוטין שונה מוצרים PCR הם הכלאה של בדיקות. (P3) שלב 2.14. Streptavidin, שכותרתו עם peroxidase, הוא מודגרות עם הקרום ונקשר ביוטין. (P4) שלבים 2.19-2.21. Peroxidase catalyses תגובה של ריאגנטים זיהוי ECL, ייצור אור שבה הסרט רגיש לאור חשוף. הממברנה נשטף אז לשימוש חוזר. <img src="/files/ftp_upload/2781/2781fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. MPCR נציג / RLB התוצאה. דוגמאות 1 עד 6 לייצג שולטת חיובית - ביניהם יש אחד לפחות אות בדיקה חיובית עבור כל אחד 43 בדיקות. כל רצף היעד (באמצעות U) מזוהה עם שתי בדיקות שונות על מנת למקסם את סגוליות. בדיקות A1 ו-A2 לייצג מינים ספציפיים בדיקות אשר צפויים להיות חיוביים עבור כל דגימה ולסייע עם המכוונת את הסרט. בדיקה A1 חוזר בחלק התחתון של הממברנה. דוגמאות 7 ו -8 הם שולטת שלילית. שים לב, בדיקות Q1, Q2, T1 ו-T2 יש אות שולטת שלילי, המעיד על הכריכה ספציפי סביר של primers או דימר המוצר פריימר. עיצוב מחדש של אלו בדיקות או primers יהיה צורך. בדיקות C1, D1 ולהראות F1 נמרח על פני קרום הנראה בשל ספיגת הלא ספציפית כמה המצומד streptavidin-peroxidase או המצע chemiluminescent, אולם זה נכון להבחין בקלות בין אותות בדיקה חיובית. בדיקות D1 ו-D2 יש אות חלש יחסית לעומת בדיקות אחרות, זה יכול להיות בגלל amplicons גדול המוביל הגברה פחות יעיל. בדיקה J2 הוא שלילי הוא מספר דוגמאות (1, 3, 4, 6, 39) שבו חללית J1 היא חיובית. זה ככל הנראה מייצג מוטציה מחייב האתר J2 עבור דגימות אלה.

<ol>
	<li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp.">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li><li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li><li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li><li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+(SCCmec)+typing.">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li><li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay.">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li><li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium,+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization.">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li><li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li><li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li><li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay.">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li><li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses.">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species.">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li><li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens.">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li><li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay.">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li><li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis.">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li><li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+(mPCR/RLB)+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia.">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+(mPCR/RLB)+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens.">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li><li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization.">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li><li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+(mPCR/RLB)+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool.">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה mPCR / RLB היתרי זיהוי סימולטני של מספר רב של amplicons PCR. בשל הרגישות הגבוהה של בדיקה לגילוי מבוססי chemiluminescent, זמנית יחיד PCR תגובה עם מספר גדול של זוגות פריימר יכול לשמש כדי להגביר את תבנית ה-DNA. אם לא מתקבלים אותות בדיקה עם אחד או יותר דגימות, ביצוע אלקטרופורזה בג&#39;ל עם מוצר ה-PCR הנותרים יכולה לסייע להבחין אם הבעיה היא עם הגברה PCR או הכלאה בדיקה. איפה כל אותות בדיקה על הממברנה חלשים או נעדרים, אבל ג&#39;ל אלקטרופורזה מציין מוצלח הגברה PCR, האפשרויות כוללות בעיות עם תיוג של הממברנה, התחדשות שגוי של קרום לאחר השימוש הקודם, טמפרטורות נכונות במהלך הדגירה הכלאה או streptavidin, או פגום streptavidin- peroxidase המצומד או מגיב לגילוי. אם דגימות בקרת עולה כי בדיקות בודדים ניתן לייצר אותות שלילי כוזב, PCR יחיד עם זיהוי הג&#39;ל מבוסס רצף הבאות ניתן לבצע כדי לוודא הגברה של מוצר ה-PCR ולחפש וריאציה רצף באתר מחייב בדיקה. אות בדיקה חלש או נעדר יכול להיות בגלל גודל amplicon גדול: אם אפשר amplicons כל צריך להיות באורך דומה פחות מ -300 נ&quot;ב. מבנה ה-DNA משני של amplicons יכול גם לייצר מחייב בדיקה עני, ועלול להצריך עיצוב מחדש של ספרי לימוד. פריימר בודדת או ריכוזי בדיקה עשוי גם להיות מגוונות כדי לייעל את עוצמת האות. אותות חיוביים False בשל מחייב בדיקה של primers nonamplified או פריימר-dimer המוצר יכול להיחקר על ידי ביצוע PCR יחיד עם זיהוי הג&#39;ל מבוסס רצף הבאים. במקרה זה, עיצוב מחדש של בדיקות ניתן חייבה. מוטציות נקודתיות באתרים מחייב בדיקה עלולה להוביל אותות חלשים או נעדרים. מתן שתי בדיקות עבור כל מוצר מוגבר עושה את זה קל לזהות. מאפיין זה עשוי להיות מנוצל עם פריימר זהיר ועיצוב בדיקה כדי לזהות שינויים קטנים ב-DNA רצף היעד. לסיכום, בעוד ישנן שיטות רבות של זיהוי המוצר הבא תגובה זמנית PCR זמין, mPCR / RLB יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה וזול, עם עלויות התקנה נמוכות. הגמישות של השיטה היתרי השימוש בו למגוון רחב של יישומים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> אמין 5 &quot;C6 שונה בדיקות oligonucleotide </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S-8875 </td><td> 0.5 פתרון M עשה עד pH 8.4 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S5881 </td><td> 0.1M פתרון </td></tr><tr><td> 20xSSPE חיץ </td><td> Amresco </td><td> 0810-4L </td><td></td></tr><tr><td> Dodecyl נתרן סולפט (SDS) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> L-4390 </td><td> להמציא פתרון המניה 10%, לא החיטוי, יש לשמור על מקסימום 1 שבוע לפני השימוש </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E9884 </td><td> מאפרים 0.5 פתרון M מותאם pH 8.0 ו החיטוי </td></tr><tr><td> N-(3-Dimethylaminopropyl)-N &#39;ethylcarbodiimide-hydrochloride (EDAC) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E7750 </td><td> להמציא פתרון 20 מ&quot;ל 16% רק לפני השימוש באמצעות EDAC 3.2 גרם ו 18 מ&quot;ל מים Millipore </td></tr><tr><td> BiodyneC ניילון 0.45 מיקרומטר ממברנה 20x20 ס&quot;מ </td><td> מל מדעי החיים </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionised, מים מטוהרים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pyroneg נוזלי ניקוי </td><td> ג&#39;ונסון Diversey </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-peroxidase המצומד </td><td> רוש </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL זיהוי ריאגנטים </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> Amersham ECL זיהוי ריאגנטים </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> מטולשקפים הסרט שקיפות </td><td> חברות אקספרס </td><td> 504 EXP מטולשקפים </td><td></td></tr><tr><td> Amersham hyperfilm ECL ביצועים גבוהים chemiluminescent הסרט 18x24 ס&quot;מ </td><td> GE Healthcare </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> קרח </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1. מתכלים המשמשים assay mPCR / RLB. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Shake&#39;n&#39;Stack תנורים Hybaid (2) בקבוק מתגלגל רשת ניילון המפריד </td><td> Thermo Scientific </td><td> HBSNSRS220 </td><td> השיטה יכול להתבצע עם תנור אחד, כל עוד יש מתקן לשמירה על פתרונות 42 ° C ו 60 ° C לפני השימוש </td></tr><tr><td> רקדנית הבטן נדנדה פלטפורמה </td><td> Stovall מדעי החיים </td><td> יורו BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100-45 </td><td></td></tr><tr><td> המים באמבטיה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> יניקה </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חם בצלחת </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> חשיפה מחסנית </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> Z36 ,009-0 </td><td></td></tr><tr><td> רנטגן הסרט מפתח </td><td></td><td></td><td> ניתן גם להשתמש, מפתחת מתקן מים במגשי בחדר חשוך במקום אוטומטיותמפתח. Lumino-imager עשוי לשמש גם במקום הסרט Xray </td></tr></tbody></table> 2. ציוד לוח הדרושים assay mPCR / RLB.

multiplex pcr and reverse line blot hybridization assay (mpcr/rlb)

Multiplex PCR / קו הפוך כתם assay הכלאה מאפשרת זיהוי של עד 43 מטרות מולקולריות ב 43 דגימות באמצעות אחד ה-PCR זמנית תגובה ואחריו הכלאה בדיקה על קרום ניילון, אשר מחדש שמיש. בדיקות הן אמין &quot;5 שונה על מנת לאפשר קיבוע על הממברנה. Primers הם ביוטין 5 &quot;שונה המאפשר זיהוי של הכלאה מוצרים באמצעות PCR streptavidin-peroxidase ואת המצע chemiluminescent באמצעות סרט רגיש. עם ההתקנה עלויות נמוכות מתכלים, טכניקה זו היא זולה (כ 2 $ ארה&quot;ב לפי המדגם), קצב העברת נתונים גבוה (ממברנות מרובים יכול להיות מעובד בו זמנית) ויש לו זמן תגובה קצר (כ 10 שעות). הטכניקה ניתן להשתמש במספר דרכים. בדיקות מרובות ניתן נועד לזהות וריאציה רצף בתוך מוצר מוגבר אחד, או מספר רב של מוצרים יכול להיות מוגבר בעת ובעונה אחת, עם אחד (או יותר) בדיקות לגילוי שימוש לאחר מכן. השילוב של שתי הגישות יכול לשמש גם בתוך assay אחד. היכולת לכלול בדיקות מרובות רצף מטרה אחת עושה assay מאוד ספציפיות. פורסם יישומים של mPCR / RLB כוללים זיהוי של גנים 1,2 התנגדות לאנטיביוטיקה, הקלדה של סטפילוקוקוס עמידים-methicillin 3-5 ו סלמונלה sp 6, serotyping המולקולרי של Streptococcus pneumoniae 7,8, סטרפטוקוקוס agalactiae 9 ו enteroviruses 10,11, זיהוי של Mycobacterium sp 12, זיהוי של המין 13-15 ו - 16 בדרכי הנשימה ועוד 17 פתוגנים איתור וזיהוי של mollicutes 18. עם זאת, את צדדיות של הטכניקה אמצעי יישומים בלתי מוגבלות כמעט ולא מוגבלת ניתוח מולקולרית של מיקרואורגניזמים. חמשת השלבים mPCR / RLB הם פריימר) ועיצוב החללית, ב) מיצוי דנ&quot;א הגברה PCR ג) הכנת הממברנה, ד) הכלאת זיהוי, ו-e) התחדשות של הממברנה.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB at JoVE.com

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

שיטה זולה, תפוקה גבוהה לגילוי סימולטני של עד 43 מטרות מולקולריות מתואר. יישומים של mPCR / RLB כוללים הקלדה וזיהוי של חיידקים פתוגנים רבים של דוגמאות קליניות.

Multiplex PCR הפוך כתם וקו הכלאה Assay (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

43.3K Views.  University of Sydney. שיטה זולה, תפוקה גבוהה לגילוי סימולטני של עד 43 מטרות מולקולריות מתואר. יישומים של mPCR / RLB כוללים הקלדה וזיהוי של חיידקים פתוגנים רבים של דוגמאות קליניות.

Video: Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.