אנחנו בהכרת תודה תודה Ragucci ט, ב ווטקינס, ס &#39;וונג, ו-B Wallek ב Lynntech, Inc לקבלת סיוע טכני דיונים מועילים רבים. עבודה זו נתמכה על ידי המוסד האמריקני למדע (NSF) תחת מענק CBET-0933688.

1. העיצוב הבסיסי של Thermocycler הסעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו צריכים לבנות מכשיר פשוט thermocycling הסעה המורכב להחלפה פלסטיק קאמרית תגובה &quot;דיו&quot;, כי הם דחוקה בין שתי צלחות אלומיניום בטמפרטורות אשר נשלטים באופן עצמאי 7 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות הכור גלילי המוטבעים על ידי מערכי עיבוד של חורים בבלוקים פוליקרבונט, עם שילובים שונים של קוטר חור ואת עובי יריעת פלסטיק המועסקים על מנת להשיג את היבט ratios הרצוי (גובה / קוטר = h / d). שתי הגיאומטריות הכור שונים נחשבים בתוצאות שהוצגו כאן: h / d = 9: h = 15.9 מ&quot;מ, d = 1.75 מ&quot;מ, נפח 38.2 μL; h / d = 3: h = 6.02 מ&quot;מ, d = 1.98 מ&quot;מ, 18.5 μL נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשטח התחתון של הכור הוא מחומם באמצעות בלוק אלומיניום המכיל תנורי מחסנית interfaced עם בקר טמפרטורה microprocesser מונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמפרטורה על פני השטח העליון של הכור מוסדר באמצעות בלוק אלומיניום המחוברים אמבט מים הסירקולציה המחודשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה כולו צמודות זו לזו באמצעות ברגים ניילון להגביל הולכה תרמית בין גושי אלומיניום מנוגדים. </li></ol> 2. הכנה טוען של התגובה התערובת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת אופיינית 100 תגובה μL מכיל 10 μL של פתרון חיץ 10x, 6 μL של 25 מ&quot;מ MgCl 2, 10 μL של dNTPs (2 mM כל אחת), 41.2 μL של די מים, 10 μL של β-אקטין בדיקה, 10 μL של β פריימר-אקטין קדימה, 10 μL של פריימר β-אקטין הפוך, 2 μL של תבנית ה-DNA האנושי גנומית (10 ng / μL) ו 0.8 μL של פולימראז הדנ&quot;א KOD (2.5 יחידות / μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת ריאגנטים, לאטום את המשטח התחתון של החדר PCR באמצעות שכבה דקה של סרט אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הבארות הכור עם פתרון / 10 מ&quot;ג למ&quot;ל מימית של אלבומין בסרום שור ואחריו גשם וערפל-X-Anti. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים פיפטה לתוך בארות הכור באמצעות ג&#39;ל טעינה ארוך טיפים פיפטה ו לאטום את השטח העליון עם סרט טפלון FEP. </li></ol> 3. ריצה את התגובה Thermocycler הסעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת התגובה, מחממים שתי קוביות אלומיניום עם טמפרטורות פני השטח הרצוי העליון והתחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנדוויץ הכור פלסטיק עמוסות PCR ריאגנטים בין גושי חימום אלומיניום, במהירות מהדק את מכלול יחד באמצעות ברגים ניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התגובה יש המשיך בפעם הרצוי, כבה את תנורי ומקום התחתון (חם) משטח של המכשיר על גבי בלוק מתכת צונן במהירות לקרר אותו ולהפסיק את זרימת הסעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכור פלסטיק פיפטה את המוצרים מתוך הבארות (באמצעות טעינת טיפים ארוך ג&#39;ל) לניתוח שלאחר מכן. </li></ol> 4. ביצוע ניתוח ג&#39;ל אלקטרופורזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 wt% agarose ג&#39;ל על ידי חימום של 10 גרם agarose עם 500 מ&quot;ל של חיץ 1x על פלטה חשמלית ערבוב עד לפתרון מתבהרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הג&#39;ל agarose למגש הליהוק והכנס את המסרק. תן סט ג&#39;ל למשך 30 דקות ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המסרק ולהוסיף חיץ 1x טה עד ג&#39;ל הוא שקוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorescently דגימות DNA מוכתם להכיל 2 μL 100x SYBR גרין פתרון אני, 2 דגימת DNA μL, 2 דיי μL 6x אורנג&#39; טוען, ו 4 μL חיץ טה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את דגימות ה-DNA לתוך בארות ולהפעיל את ההפרדה V עבור 60 שעות 1 עם סמן 100 נ&quot;ב סולם הדנ&quot;א לשינוי גודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג&#39;ל ולצלם אותו תחת אור UV כדי להשיג את התוצאה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: עיצוב אופטימאלי של thermocyclers הסעה כרוך בבחירת הגיאומטריה הכור נכונה כי יפיק זרימת הדם מסוגל להעביר באמצעות ריאגנטים הטמפרטורות מפתח המעורבים בתהליך PCR. פרמטרים גיאומטריים כי יכולים להיות מגוונים של כורים גלילי נחשב כאן הם גובה (ח) ואת קוטר (ד), או שקול את יחס הממדים (ח / ד). אנו בחנו את 3-D שדות זרימה הסעה בתוך כורים PCR על פני טווח של היבט ratios שונים באמצעות דינמיקה של נוזלים חישובית (CFD), ומצאו כי תבניות מורכבות בלתי צפוי יכול להתעורר. יתרה מכך, הניתוח שלנו חשף משנה של שדות אלה זרימה מורכבים להאיץ באופן משמעותי את התגובה 12. תופעות אלה גיאומטריות ניתן לראות בבירור על ידי השוואת שדות זרימה בכורים על היבט ratios גבוה ונמוך. בכל מקרה היבט יחס גבוה (ח / d = 9; צילינדר גבוה ורזה), הם האלמנטים נוזל advected לאורך מסלולי התחקות את השבילים כי הם בעצם לולאות סגורות, והם נעולים, כדי לעקוב אחר נתיבי אותו לתקופות ארוכות זמן (איור 3a). כתוצאה מכך, יש הזדמנות קטנה החליפין בין fמסלולים נמוכים החושפים ריאגנטים רצף אופטימלי של התנאים תרמית PCR (נדנוד בין חישול denaturing הקצוות על משטחים העליון והתחתון של כור) ואת ההרכב הרבה יותר גדול של מסלולים הנותרים שאינם תורמים הגברה (מקומי קרוב למרכז הכור). שדה זרימה שונה בהרבה ביחס היבט קטן (ח / d = 3; קצר, גליל רחב יותר), הופך כאוטי יותר במובן זה מסלולי אלמנט נוזל כבר לא פעל נתיבים סגורים (איור 3 ב). כך, על אף ריאגנטים כפופים פרופיל הטמפרטורה מורכבים יותר, אלמנטים נוזל מסוגלים לבחון מגוון רחב יותר של מסלולים, כך יותר של נפח מגיב יש הזדמנות לחוות פרופילים תרמית אופטימלית. תוצאות אלו counterintuitively מראים כי בעוד מסלולי זרימת הפרט h / d = 9 עשוי להיראות חיובי יותר עבור ה-PCR על ידי ייצור פרופילי טמפרטורה כי &quot;המראה&quot; דומים לאלה המועסקים thermocycler קונבנציונלית, האופי הכאוטי של שדה הזרימה ב h / d = 3 בסופו של דבר שולטת בקנה מידה עולמי על ידי קידום חילופי משופר, כך ריאגנטים לא להיות לכודים מסלולי שלילי למשך זמן רב. כדי לבחון סברה זו ולקבוע אילו הגיאומטריה הכור היה נוח יותר עבור ה-PCR, השתמשנו שניהם לבצע שכפול PCR מטרה 295 נ&quot;ב הקשורים הגן β-אקטין מ תבנית ה-DNA האנושי גנומית. למרבה הפלא, אנו שגרתי להשיג הגברה של המוצר היעד הנכון רק 10 דקות בכל שעה / d = 3 (תרשים 4 א), ואילו את אותה התגובה הנדרשת לפחות 20 דקות לפני מוצרים לזיהוי נצפו ב h / d = 9 (איור 4 ב) . סגוליות התגובה היא גם הרבה יותר על h / d = 3 שם מוצר בודד PCR מתקבל, בעוד מוצרים ספציפיים מרובים נוצרות h / d = 9 שם בשדה זרימה מלכודות אלמנטים נוזל מסלולי תרמית שלילי במשך פרקי זמן ארוכים. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הסעה תרמית בתא גלילי אשר העליון והתחתון משטחים נשמרים בטמפרטורות קבועות שונות. אם הטמפרטורה על פני השטח התחתון גבוה יותר מאשר בחלק העליון, שיפוע צפיפות אנכי הוא הוקם בתוך הנוזל סגורה כי היא מסוגלת לייצר דפוס זרימת הדם. עם הבחירה הימני של פרמטרים גיאומטריים (גובה h ו בקוטר ד), בשדה זרימה הסעה ניתן לרתום להניע thermocycling PCR כאשר משטחים העליון והתחתון הם manintained ליד חישול denaturing בטמפרטורות, בהתאמה (כוח הכבידה פועל אנכית כלפי מטה). <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. (א) רכיבי מפתח של זרימה הסעה PCR thermocyler. מחסנית הכור מורכב בלוק פוליקרבונט המכיל מערך של תאים גליליים. הבלוק היא דחוקה בין צלחת העליון נועד להיות מחובר אמבט מים במחזור וצלחת תחתית שילוב תנורי מוטבע. (ב) ריאגנטים PCR נטענים וחתום בתוך המחסנית הכור, שלאחריו ההתקן מורכב כדי לבצע את התגובה. בסיום, procucts ניתן pipetted בקלות החוצה לניתוח שלאחר מכן. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. סימולציות חישוביות של 3-D שדות זרימה הסעה שנוצר בתוך כורים גלילי עם טמפרטורות של 53 ו - 96 ° C הוטל על משטחים עליונים ותחתונים, בהתאמה. תוצאות מוצגים היבט ratios של (א) h / d = 9 (38.2 נפח הכור μL) ו (ב) h / d = 3 (18.5 נפח הכור μL). מסלול נציג ואחריו אלמנט נוזל נסיעה דרך שדה זרימה 3D מוצג בקצה השמאלי יחד עם תחזיות להציג העליונה ואת הצד של הנתיב, את העלילה המקביל הטמפרטורה לעומת פעם הבאה אלמנט נוזל מוצגת בחלק הימני. פרופיל תרמית על h / d = 9 מופיע קרוב לזה של thermocycler קונבנציונלית, אבל בשדה זרימה כאוטית ב h / d = 3 הוא counterintuitively יותר נוחים PCR. <img src="/files/ftp_upload/2366/2366fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. שכפול הדנ&quot;א התוצאות שהתקבלו ב הגיאומטריות הכור שמוצג באיור 3 (העליון והתחתון משטחים נשמרו על 53 ו - 96 ° C, בהתאמה). (א) PCR מואץ מאוד ב h / d = 3, ברור לפי מוצרים חזק לעין לאחר 10 דקות בלבד של זמן תגובה (מ: 100 סולם bp, 1-4 נתיבים: מוצרים מן התגובות מקביל 4 חדרים גלילי שונים). (ב </strאונג&gt;) התגובה זהה שבוצעה ב h / d = 9 דורש לפחות 20 דקות לפני מוצרי לעין הם נצפו, להקות מרובות שכפול המציין ניכר של ה-DNA הלא ספציפית יעד נוסף על המוצר הרצוי (מ: 100 סולם נ&quot;ב, 1-2 נתיבים: מוצרים תגובות מקביל 2 חדרי גלילי שונים).

<ol>
	<li>Spitzack, K. D., Ugaz, V. M., Minteer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Techniques:+Reviews+and+Protocols.">Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2005).</li><li>Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+in+a+Rayleigh-B&#233;nard+convection+cell.">PCR in a Rayleigh-B&#233;nard convection cell.</a> Science. 298, 793-793 (2002).</li><li>Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential+DNA+replication+by+laminar+convection.">Exponential DNA replication by laminar convection.</a> Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).</li><li>Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermosiphon-based+PCR+reactor:+experiment+and+modeling.">Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling.</a> Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).</li><li>Wheeler, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convectively+driven+polymerase+chain+reaction+thermal+cycler.">Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler.</a> Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).</li><li>Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+and+fluidics+in+miniaturized+natural+convection+systems.">Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems.</a> Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).</li><li>Ugaz, V. M., Krishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+convective+flow+based+approaches+for+high-throughput+PCR+thermocycling.">Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling.</a> Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).</li><li>Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-Rayleigh-Benard+convection+polymerase+chain+reaction+system.">Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system.</a> Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).</li><li>Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pocket-sized+Convective+PCR+Thermocycler.">A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).</li><li>Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction+in+natural+convection+systems:+A+convection-diffusion-reaction+model.">Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model.</a> Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).</li><li>Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+flow+and+reaction+during+natural+convection+PCR.">Coupled flow and reaction during natural convection PCR.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).</li><li>Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+Biochemistry+by+Chaotic+Stirring.">Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring.</a> , (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יחסי הגומלין בין זרימה תגובה כימית יכול לשנות באופן דרמטי תחת השפעת advection כאוטי. אבל אלה מדינות זרימה מורכבים מאתגרת ללמוד, במיוחד הגיאומטריות מציאותי שבו אפקטים 3D הופכים לחשובים. ריילי, ברנארד הסעה ב h / d&gt; 1 לא רק מספק פלטפורמה נוחה כדי לחקור תופעות אלה, היישום שלהם לבצע PCR גם מאפשרת צימוד בין תגובות כימיות זרימה להיות נחקר. יכולת ייחודית זו מאפשרת לבחור מצבי זרימה אופטימלי שבו לפעול תופעות כאוטיות (counterintuitively) כדי להאיץ את קצב שכפול הדנ&quot;א.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>KOD DNA Polymerase kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>71085-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TaqMan &beta;-actin Control Reagents kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>401846</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen, Inc.</td>
<td>PCR-AS-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2153</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X Anti-Fog</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SOPUS Products</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long Gel-loading Pipette Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-408-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FEP Teflon tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>7562A17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose gel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>161-3107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TAE running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>141-0743</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYBR Green I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
<td>S7563</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6x Orange Loading Dye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fermentas</td>
<td>R0631</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 bp DNA ladder sizing marker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>170-8202</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rapid pcr thermocycling using microscale thermal convection

רבים מבחני ביולוגיה מולקולרית תלויים בדרך כלשהי על תגובת שרשרת פולימרז (PCR) כדי להגביר את ה-DNA לדלל בתחילה מדגם היעד לרמה ריכוז לזיהוי. אבל העיצוב של חומרה PCR קונבנציונאלי thermocycling, המבוססת בעיקר על חימום מסיבי גושי מתכת אשר הטמפרטורה מווסתת על ידי חימום Thermoelectric, מגביל מאוד את מהירות התגובה השגה 1. חשמל ניכרת נדרש גם שוב ושוב חום לקרר את התערובת מגיב, להגביל את היכולת לפרוס אלה מכשירים בפורמט נייד. הסעה תרמית התפתחה גישה חלופית thermocycling מבטיח כי יש את הפוטנציאל להתגבר על המגבלות האלה 2-9. זורם הסעה הם אירוע יומיומי במערך רחב של הגדרות, החל האטמוספרה של כדור הארץ, האוקיינוסים, פנים, מנורות לבה דקורטיבי וצבעוני. נוזל בתנועה היא יזמה באותה דרך בכל מקרה: אי יציבות הציפה מונע מתעוררת כאשר נפח מוגבל של נוזל נתונה מפל הטמפרטורה מרחבית. אלה תופעות אותו מציעים דרך אטרקטיבית לבצע thermocycling PCR. על ידי יישום הדרגתי בטמפרטורה סטטית לאורך הגיאומטריה הכור תוכנן כראוי, זרימת הדם רציפה ניתן לקבוע כי יהיה שוב ושוב תחבורה ריאגנטים PCR דרך אזורי טמפרטורה הקשורים denaturing, חישול, ובשלבים הרחבה של התגובה (איור 1). Thermocycling ולכן ניתן actuated באופן פסאודו מקורר באופן איזוטרמי פשוט על ידי החזקת שני משטחים מנוגדים בטמפרטורה קבועה, לחלוטין ומבטל את הצורך שוב ושוב חום לקרר את המכשיר. אחד האתגרים המרכזיים הניצבים בפני העיצוב של thermocyclers הסעה הוא הצורך לשלוט במדויק את מהירות מרחבית הפצות הטמפרטורה בתוך הכור על מנת להבטיח כי ריאגנטים ברצף לכבוש את אזורי טמפרטורה נכונה לתקופה מספיק זמן 10,11. כאן אנו מתארים את התוצאות של מאמצינו כדי לבחון את מהירות מלא 3-D ו הפצות הטמפרטורה thermocyclers הסעה microscale 12. במפתיע, גילינו קבוצת משנה של מסלולי זרימת מורכבים הם נוחים מאוד עבור ה-PCR עקב שילוב סינרגיסטי של חילופי (1) רציפה בין שבילי זרימה מספקת הזדמנות משופרת עבור ריאגנטים לטעום מגוון רחב של פרופילים טמפרטורה אופטימלית, ו ( 2) זמן גדל ובילה את הטמפרטורה בתוך אזור הרחבה שיעור הגבלת הצעד של ה-PCR. מאוד מהיר הגברה DNA פעמים (לפי 10 דקות) הם ברי השגה בכורים נועד ליצור זרמים אלה.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection at JoVE.com

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

אנו מתארים שיטה חדשה לבצע שכפול הדנ&quot;א באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR). הסעה תרמית היא רתומה ריאגנטים מעבורת ברציפות בין denaturing, חישול, ותנאי הרחבה על ידי שמירה על משטחים מנוגדים של הכור בטמפרטורה קבועה. זהו עיצוב פשוט מטבעו מבטיח לעשות PCR מהיר יותר נגיש.

ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

rapid-pcr-thermocycling-using-microscale-thermal-convection

Research

JoVE Journal

Biology

22.6K Views.  Texas A&M University. אנו מתארים שיטה חדשה לבצע שכפול הדנ"א באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR). הסעה תרמית היא רתומה ריאגנטים מעבורת ברציפות בין denaturing, חישול, ותנאי הרחבה על ידי שמירה על משטחים מנוגדים של הכור בטמפרטורה קבועה. זהו עיצוב פשוט מטבעו מבטיח לעשות PCR מהיר יותר נגיש.

Video: Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to humans through the bite of infected Ixodes ticks. The primary etiological agent in North America is Borrelia burgdorferi sensu stricto. As geographic risk regions expand, it is prudent to support robust surveillance programs that can measure tick infection rates, and communicate findings to clinicians, veterinarians, and the general public. The molecular technique of nested polymerase chain reaction (nPCR) has long been used for this purpose, and it remains a central, inexpensive, and robust approach in the detection of Borrelia in both ticks and wildlife. 
This article demonstrates the application of nPCR to tick DNA extracts to identify infected specimens. Two independent B. burgdorferi targets, genes encoding Flagellin B (FlaB) and Outer surface protein A (OspA), have been used extensively with this technique. The protocol involves tick collection, DNA extraction, and then an initial round of PCR to detect each of the two Borrelia-specific loci. Subsequent polymerase chain reaction (PCR) uses the product of the first reaction as a new template to generate smaller, internal amplification fragments. The nested approach improves upon both the specificity and sensitivity of conventional PCR. A tick is considered positive for the pathogen when inner amplicons from both Borrelia genes can be detected by agarose gel electrophoresis.

Detecting the Lyme Disease Spirochete, Borrelia Burgdorferi, in Ticks Using Nested PCR

Nested PCR is a sensitive, specific, and straightforward technique that can be applied to tick DNA extracts to probe for Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease. The initial PCR experiment uses gene-specific primers to generate long amplicons, which then become templates for a subsequent reaction using internal primers.

זיהוי החיידק מחלת ליים, Borrelia Burgdorferi, בשנתות באמצעות PCR מקוננים

Lyme disease is a serious vector-borne infection that is caused by the Borrelia burgdorferi sensu lato family of spirochetes, which are transmitted to ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...