נתמך על ידי מענק ניי EY014850.

1. הכנת Sylgard צלחות מלאות, לתאי ניסוי, סכיני גילוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 מ&quot;מ פלקון צלחות פטרי מצופות אלסטומר Sylgard יש צורך לקצוץ התקין של הרשתית מבודד להשיג תאים photoreceptor יחיד. אלסטומר מוכן על פי הוראות הספק כמות קטנה הוא שפך לתוך כל מנה כדי לכסות את תחתית שלה בשכבה. החלף צלחת מכסה לאחר ציפוי ולאחסן אותם. בעוד ימים ספורים אלסטומר מתקשה ומאכלים מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photoreceptors מבודד צורך להיצמד אל החלק התחתון של תא הניסוי, כך הם משותקים במהלך ניסוי הדמיה. זו מושגת על ידי ציפוי תחתית החדרים עם פולי-L-ליזין או פולי-L-ornithine. הוספת 200 μL של פתרון של 0.01% או אחד לכל חדר, ומכסים לתאי עם מגבת נייר כדי להגן עליהם מפני אבק. לאחר הפתרון התייבש, לשטוף עם מים לתאי חנות מזוקקים בתוך קופסה סגורה. השתמש בתוך 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את חדרי בסוף הניסוי, לשטוף אותם עם אתנול 100% כדי להסיר שמן העדשה שמן הטבילה ופסולת התא. כדי להסיר את פסולת התא, השתמש כותנה שקצהו applicators ובזהירות לשפשף את החלק התחתון של החדר. לאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים ולתת לתאי היבש לפני ציפוי מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור פיפיות סכיני גילוח לחתיכות קטנות (8 מתוך להב אחד) עם חיתוך מתכת. </li></ol> 2. ההכנה של פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב של פתרונות תלוי המין. עבור דו חיים, את הצלצול של יש (ב mmol / L): 110 NaCl, KCl 2.5, 1.6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7.55. PH צריך להיות מותאם לערך הסופי עם NaOH. עבור יונקים, את הצלצול של יש (ב mmol / L): 130 NaCl, KCl 5, 0.5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25-hemisodium HEPES, pH = 7.40. הפתרון של רינגר יכולים להישמר היטב אטום בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלוקוז פתרון במלאי, 1 mol / L, המשיך ב -20 ° C כדי למנוע התפתחות חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, להוסיף גלוקוז לפתרון של רינגר לריכוז סופי של 5 mmol / L. בסופו של יום, למחוק את הצלצול של המכיל גלוקוז כי זה עלול לגדול חיידקים. </li></ol> 3. בידוד של הרשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כריתה התקין של הרשתית חשוב החיה להיות כהה המותאמים לפחות 2-3 שעות לפני להקריב. בעלי חיים צריכים להיות כהה מותאם במיכל מאוורר מתאים בחדר כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא שני 35 מ&quot;מ צלחות פטרי חצי דרך עם פתרון של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן חיה תחת אור אדום עמום להסיר את העיניים. בהמשך, כל ההליכים מתבצעים תחת אור אינפרא אדום באמצעות מיקרוסקופ לנתח או מצלמה עם צג וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל שאריות רקמת מפני השטח החיצוני של העין. גזור להסיר את החלק הקדמי, ולאחר מכן להעביר את עיינית לאחד צלחות פטרי מלאות של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזגוגית ובזהירות להפריד את הרשתית משאר עיינית על ידי צובט את כל חיתוך או קבצים מצורפים. הרם בעדינות את הרשתית ואת זה נפרד לחלוטין מן עיינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית כדי בצלחת פטרי השני עם טפטפת העברת פלסטיק. שמור את המנה המכיל את הרשתית בתיבה אור חזק. </li></ol> 4. בידוד של תאים photoreceptor יחיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל ההליכים מתבצעים תחת אור אינפרא אדום. חותכים חתיכה קטנה של הרשתית ולהעביר אותו עם טפטפת פלסטיק צלחת Sylgard מכוסה. היקף הפתרון הכולל את פיסת הרשתית צריך להיות בערך 250 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו פיסה קטנה של סכין גילוח עם בעל להב - קצה הלהב צריך להיות בזווית של כ 45 ° לבעל. שטחו את פיסת הרשתית על שכבת Sylgard באמצעות להב לקצוץ את החלק של הרשתית דק תוך שמירה על אותה שכבת דבק Sylgard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 200 μL של פתרון הכולל את התאים לתאי ניסיוני - לצאת כל פיסת הנותרים של הרשתית בצלחת Sylgard המכוסה. שמרו על חדר עם תאים בודדים בתיבת אור חזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו 10 דקות עבור התאים להתיישב, ואז להוסיף 2-3 מ&quot;ל של רינגר. בשלב זה, התאים מבודדים ניתן לטעון עם פלורסנט לצבוע מסוים (לדוגמה Fura-2) על פי פרוטוקול הטעינה צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים יכולים עתה לקחת על הבמה מיקרוסקופ לניסויים. </li></ol> 5. פלואורסצנטי הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לתא לשלב של המיקרוסקופ epifluorescence. התאם פתרון זלוף, בדיקות טמפרטורה, אור אינפרא אדום, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הווילונות להתחיל בניסוי. כבה את האור האינפרה אדום בתוך הכלוב מיקרוסקופ, להתמקד התחתון של תא הניסוי, ולעבור את השלב מחפש תאים. </li></ol> 6. נציג תוצאותs: איור. 1 מציג את המורפולוגיה של מוט מבודד בריא photoreceptors קונוס שהושגו עם פרוטוקול זה מן הרשתית סלמנדרה (Ambystoma tigrinum). תאים Salamander נעשה שימוש נרחב עבור יחיד פלואורסצנטי תא הדמיה בגלל גודל גדול ויכולתם לשרוד במשך כמה שעות לאחר במנותק מן הרשתית. בנוסף, מן הרשתית סלמנדרה אפשר להשיג באופן סדיר הן מוט photoreceptors קונוס. אחד הקריטריונים החשובים לבריאותם של התאים הוא נוכחותם של אליפסואיד תמים (איור 1), החלק של התא שבו המיטוכונדריה מרוכזים. כאשר התאים מוצגים תחת DAPI אופטיקה, זה ריכוז של המיטוכונדריה נותן איתות הקרינה חזקה (איור 2) בשל נוכחותם של NADH. חוסר אליפסואיד שלמים היא סימן של תא פגום, פסול, בדרך כלל לצורך הניסוי. איור. 3 מראה פגום סלמנדרה מוט photoreceptor, עם גוף התא נפוחות גרעין מרוכז. תאים אלה להציג פלואורסצנציה נמוכה בהרבה מתחת DAPI אופטיקה, אבל שנצפו תחת אופטיקה FITC להראות אות FAD חזק באזור אליפסה (שמקורם נוקלאוטידים פלבין ו flavoproteins חמצון). קריטריון נוסף לבריאות photoreceptors מבודד היא יכולתם ליצור כל טרנס רטינול (ויטמין A) במגזרי החיצוני שלהם על ידי גירוי האור. הדור של ויטמין A דורשת כמויות ניכרות של NADPH, אשר תלוי מכונות מטבולית ללא פגע. איורים 4 ו -5 להראות את היווצרות ויטמין A במגזרי החיצוני של צפרדע שלם מוט photoreceptors העכבר בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. בריא יחיד מוט חרוט photoreceptors. התאים היו מבודדים מן הרשתית נמר סלמנדרה. Phototransduction מתרחש במגזר החיצוני ואת אליפסה הוא ארוז בצפיפות עם המיטוכונדריה. מוטות אחראים ראייה באור עמום, חרוטים עבור החזון אור בהיר. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. Fluorescence החיים סלמנדרה מוט חרוט. אלה הם כהים המותאמים תאים, מראה NADH הקרינה חזקה ellipsoids שלהם ולא ויטמין משמעותי הקרינה במגזרי החיצוני שלהם. לכידת התמונה פלואורסצנציה מייצג החשיפה הראשונה שלהם לאור הנראה לאחר תקופה של הסתגלות כהה. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. פגומים סלמנדרה מוט photoreceptor. גוף התא נפוחות גרעין מרוכז המעידים על נזק. התא הוא מתחמצן ויש מינימלית אות NADH (DAPI אופטיקה), אלא אות FAD הרבה יותר חזק (FITC אופטיקה). <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. צפרדע עם מוט NADH ו רטינול. זהו צפרדע בריא מוט photoreceptor מראה NADH הקרינה חזקה באזור אליפסה. לפני חשיפה לאור יש פלואורסצנציה מינימלי בקטע החיצוני. בעקבות חשיפה לאור, ישנו גידול משמעותי הקרינה את הקטע החיצוני עקב היווצרות של ויטמין A. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. עכבר מוט עם רטינול. זהו עכבר בריא מוט photoreceptor מראה פלח משמעותי הקרינה החיצוני לאחר חשיפה לאור עקב היווצרות של ויטמין A. האזורים אליפטיים של photoreceptors מוט העכבר לא מראים אות הקרינה חזקה.

<ol>
	<li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Counting+Photons:+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction.">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li><li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Photoreceptors.">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors.">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin.">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li><li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration:+The+Friedenwald+Lecture.">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li><li>Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark+Adaptation+and+the+Retinoid+Cycle+of+Vision.">Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision.</a> Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).</li><li>Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Microscopy:+Shedding+Light+on+the+Chemistry+of+Vision.">Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision.</a> Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleached+Pigment+Produces+a+Maintained+Decrease+in+Outer+Segment+Ca2++in+Salamander+Rods.">Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods.</a> J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Dependent+Changes+in+Outer+Segment+Free-Ca2++Concentration+in+Salamander+Cone+Photoreceptors.">Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).</li><li>Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+the+Rods+of+Wild-Type+and+Transducin+Knock-out+Mice.">Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice.</a> J Physiol. 542, 843-854 (2002).</li><li>Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Measurement+of+Current+and+Calcium+in+the+Ultraviolet-Sensitive+Cones+of+Zebrafish.">Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish.</a> J Physiol. 579, 15-27 (2007).</li><li>Matthews, H. R., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors.">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li><li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors.">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li><li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors.">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li><li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments.">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li><li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks.">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li><li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors.">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li><li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle:+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology.">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li><li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors.">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li><li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments.">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li><li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors.">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li><li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors.">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אם מבודדים תאים בריאים לא מתקבלים, הבעיה נעוצה גם עם בידוד או לבריאות של הרשתית או עם הקיצוץ שלה. בדרך כלל, לאחר הסרת הקדמי של העין ואת הזגוגית, הרשתית בקלות מרים את אפיתל הפיגמנט. אם לא, לנסות לקלף אותו החל בפריפריה של עיינית. אם זה עדיין קשה להפריד, אפשרות סבירה היא כי ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> החדר האפל (100-150 רגל 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אורות אדומים 19 </td><td></td><td></td><td> חנויות מקוונות </td></tr><tr><td> מקורות אור אינפרא אדום לצופים תמונה אינפרא אדום </td><td> FJW Optical Systems, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ 19 </td><td></td><td></td><td> לבוש עם הצופים אינפרא אדום </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ Epifluorescence סגורה בכלוב אור חזק 19 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> כלים לנתח (מספריים, מלקחיים, בעל להב) </td><td> Roboz או כלים המדע פיין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard אלסטומר </td><td> אסקס (שארלוט, NC) </td><td> Sylgard 184 אלסטומר ערכת </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ornithine (0.01%) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין (0.1%) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P8920 </td><td> מדולל ל% 0.01 </td></tr><tr><td> ניסיוני בתאי </td><td> וורנר מכשירים (Hamden, CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי, טפטפות פלסטיק </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging

ברשתית החוליות, phototransduction, ההמרה של האור לאות חשמלי, מתבצעת על ידי מוט חרוט תאים photoreceptor 1-4. Photoreceptors רוד אחראים ראייה באור עמום, חרוטים על רקע בהיר. Phototransduction מתרחש במגזר החיצוני של התא photoreceptor, תא מיוחד המכיל ריכוז גבוה של פיגמנט ויזואלי, גלאי אור ראשוני. פיגמנט ויזואלי מורכב chromophore, 11 - ציס רשתית, מחובר לחלבון, opsin. פוטון נספג על ידי פיגמנט הראייה isomerizes chromophore מ 11 - ציס לכל, טרנס. Photoisomerization זה מביא לשינוי קונפורמציה פיגמנט הראייה כי יוזם מפל של תגובות שהגיעו לשיאן שינוי פוטנציאל הממברנה, ולהביא על התמרה של גירוי האור לאות חשמלי. ההתאוששות של התא מפני גירוי האור כולל את שחרור משרות של ביניים מופעל על ידי אור, ואת כינונה מחדש של פוטנציאל הממברנה. Ca 2 + מודולציה את הפעילות של כמה אנזימים המעורבים phototransduction, וריכוז שלה הוא מופחת על גירוי אור. בדרך זו, Ca 2 + משחק תפקיד חשוב בתהליך ההחלמה של התא מפני גירוי האור והתאמתה אור רקע. עוד חלק חיוני של תהליך ההחלמה הוא התחדשות של פיגמנט הראייה כי הושמד במהלך איתור לאור על ידי photoisomerization של 11 שלה - chromophore לכל cis-trans 5-7. התחדשות זה מתחיל עם שחרורו של טרנס כל הרשתית על ידי הפיגמנט photoactivated, והותיר אחריו opsin apo-החלבון. שוחררו כל טרנס רשתית מצטמצם במהירות התגובה לכל ניצול NADPH-טרנס רטינול, ו opsin משלב עם 11 טרי - רשתית cis להכניס קטע החיצוני לרפורמה פיגמנט הראייה. כל trans-רטינול הוא הועבר לאחר מכן מתוך קטע החיצוני לתוך תאים שכנים על ידי חלבון retinoid התמחה Interphotoreceptor המוביל הכבילה (IRBP). דימות פלואורסצנטי של תאים photoreceptor יחיד יכול לשמש כדי ללמוד הפיזיולוגיה שלהם ביולוגיה של התא. Ca 2 + רגיש צבעי ניאון ניתן להשתמש כדי לבחון בפירוט את יחסי הגומלין בין קטע החיצוני Ca 2 + שינויים בתגובה האור 8-12, כמו גם את תפקידו של פלח Ca פנימי 2 + חנויות Ca 2 + הומאוסטזיס 13,14 . צבעי ניאון יכול לשמש גם למדידת Mg 2 + בריכוז 15, רמת החומציות, וכן קליעים נותבים של מימיות קרום התאים 16. לבסוף, הקרינה הפנימית של כל טרנס רטינול (ויטמין A) ניתן להשתמש כדי לפקח על קינטיקה של הקמתו והסרת תאים photoreceptor יחיד 17-19.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

השיטה מתוארת להכנת יחיד photoreceptor תאים חיים ממינים שונים חוליות דימות פלואורסצנטי. השיטה יכולה לשמש התמונה פלואורסצנציה של fluorophores אנדוגני, כגון NADH או ויטמין A, או של exogenously צבעי ניאון הוסיף רגיש Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; או גורמים אחרים.

הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

preparation-living-isolated-vertebrate-photoreceptor-cells-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Views.  Medical University of South Carolina. השיטה מתוארת להכנת יחיד photoreceptor תאים חיים ממינים שונים חוליות דימות פלואורסצנטי. השיטה יכולה לשמש התמונה פלואורסצנציה של fluorophores אנדוגני, כגון NADH או ויטמין A, או של exogenously צבעי ניאון הוסיף רגיש Ca 2 + או גורמים אחרים.

Video: Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are laterally packed in the outermost layer of the retina, the photoreceptor layer, resulting in alignment of analogous subcellular compartments. Traditionally, tangential sectioning of the frozen flat-mounted retina has been used to study the movement and localization of proteins within different rod compartments. However, the high curvature of the rod-dominant mouse retina makes tangential sectioning challenging. Motivated by the study of protein transport between compartments, we developed two peeling methods that reliably isolate the rod outer segment (ROS) and other subcellular compartments for western blots. Our relatively quick and simple techniques deliver enriched and subcellular-specific fractions to quantitatively measure the distribution and redistribution of important photoreceptor proteins in normal rods. Moreover, these isolation techniques can also be easily adapted to isolate and quantitatively investigate the protein composition of other cellular layers within both healthy and degenerating retinae.

This protocol presents two techniques to isolate the subcellular compartments of murine rod photoreceptors for protein analysis. The first method utilizes live retinae and cellulose filter paper to separate rod outer segments, while the second employs lyophilized retinae and adhesive tape to peel away rod inner and outer segment layers.

שתי שיטות פילינג לבידוד תאי קולטני אור ברשתית העכבר לניתוח חלבונים

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks of Parkinson's disease. Yet, much of its biological activity, as well as its aggregation, centrally involves the soluble monomer form of the protein. Elucidation of the molecular mechanisms of aSyn biology and pathophysiology requires structurally highly resolved methods and is sensitive to biological conditions. Its natively unfolded, meta-stable structures make monomeric aSyn intractable to many structural biology techniques. Here, the application of one such approach is described: hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry (HDX-MS) on the millisecond timescale for the study of proteins with low thermodynamic stability and weak protection factors, such as aSyn. At the millisecond timescale, HDX-MS data contain information on the solvent accessibility and hydrogen-bonded structure of aSyn, which are lost at longer labeling times, ultimately yielding structural resolution up to the amino acid level. Therefore, HDX-MS can provide information at high structural and temporal resolutions on conformational dynamics and thermodynamics, intra- and inter-molecular interactions, and the structural impact of mutations or alterations to environmental conditions. While broadly applicable, it is demonstrated how to acquire, analyze, and interpret millisecond HDX-MS measurements in monomeric aSyn.

The structural ensemble of monomeric alpha-synuclein affects its physiological function and physicochemical properties. The present protocol describes how to perform millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry and subsequent data analyses to determine conformational information on the monomer of this intrinsically disordered protein under physiological conditions.

ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...