بدعم من منحة NEI EY014850.

1. إعداد أطباق Sylgard المغطاة وغرف التجريبية ، وشفرات الحلاقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وهناك حاجة إلى 35 مم فالكون أطباق بتري المغلفة مع الاستومر Sylgard لتقطيع السليم للشبكية معزولة للحصول على خلايا مستقبلة للضوء واحدة. مستعدة الاستومر وفقا لتعليمات المورد وسكب كمية صغيرة في كل صحن لتغطية الجزء السفلي مع طبقة. استبدال الطبق بعد يغطي الطلاء وتخزينها. في غضون الأيام القليلة المقبلة لالاستومر يصلب وأطباق جاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبصرات معزولة ضرورة التمسك الجزء السفلي من الغرفة التجريبية بحيث انهم ثبتوا خلال تجربة التصوير. ويتحقق ذلك عن طريق طلاء قيعان الغرف مع بولي - L - يسين أو بولي - L الأورنيثين. إضافة 200 ميكرولتر من محلول 0.01 ٪ من أي واحد لكل دائرة ، ويغطي الغرف مع منشفة ورقية لحمايتها من الغبار. بعد حل قد جفت ، وغسل بالماء المقطر غرف ومخزن في صندوق مغلق. الاستخدام في حدود 2 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنظيف الغرف في نهاية التجربة ، ويغسل لهم الإيثانول بنسبة 100 ٪ لإزالة أي نفط من النفط عدسة الغمر والحطام الخلية. لإزالة الحطام الخلية ، واستخدام القطن يميل تطبيقها بعناية وفرك الجزء السفلي من الغرفة. بعد ذلك ، ويغسل بالماء المقطر ، والسماح للغرف يجف قبل إعادة الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض شفرات الحلاقة ذو حدين الى قطع صغيرة (8 من شفرة واحدة) مع قطع معدنية. </li></ol> 2. إعداد الحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل لحلول تعتمد على الأنواع. لالبرمائيات ، والتي قد رينغر (في ملمول / لتر) : 110 كلوريد الصوديوم ، 2.5 بوكل ، 1.6 MgCl 2 ، 1 CaCl 2 ، 5 HEPES ، ودرجة الحموضة = 7.55. ينبغي تعديل درجة الحموضة إلى القيمة النهائية مع هيدروكسيد الصوديوم. للثدييات ، والتي قد رينغر (في ملمول / لتر) : 130 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 0.5 MgCl 2 ، 2 CaCl 2 ، 25 - hemisodium HEPES ، ودرجة الحموضة = 7.40. يمكن أن تظل الحل رينغر مختومة جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة بضعة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محلول الجلوكوز المخزون ، 1 مول / لتر ، يحتفظ بها في -20 درجة مئوية لتفادي نمو البكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التجربة ، إضافة إلى الجلوكوز الحل رينغر إلى تركيز النهائي من 5 ملمول / لتر. في نهاية اليوم ، وتجاهل لرينغر الذي يحتوي على الجلوكوز لأنه قد تنمو البكتيريا. </li></ol> 3. عزلة شبكية العين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالختان السليم لشبكية العين من المهم أن تكون مظلمة الحيوان مكيفة على الأقل 2-3 ساعات قبل التضحية. وينبغي أن تكون مظلمة الحيوانات مكيفة في وعاء مناسب التهوية في غرفة مظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 ملم ملء two أطباق بتري في منتصف الطريق مع الحل رينغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الحيوانية تحت ضوء أحمر خافت وإزالة العينين. بعد ذلك ، يتم تنفيذ كافة الإجراءات تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء باستخدام مجهر تشريح أو الكاميرا مع جهاز الفيديو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أي نوع من الأنسجة المتبقية من السطح الخارجي للعين. قطع وإزالة الجزء الأمامي ، ثم نقل فنجان العين في واحدة من أطباق بتري مليئة رينغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجسم الزجاجي والشبكية منفصلة بعناية من بقية فنجان العين بواسطة قبالة معسر أو قطع أي مرفقات. رفع بلطف شبكية العين وفصلها تماما من فنجان العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكية إلى صحن بيتري الثانية مع نقل ماصة بلاستيكية. الحفاظ على صحن يحتوي على شبكية العين في ضوء مربع محكم. </li></ol> 4. عزل خلايا مستقبلة للضوء واحد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم جميع الإجراءات تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء. قطع قطعة صغيرة من شبكية العين وتحويلها مع ماصة بلاستيكية لطبق Sylgard المغطاة. وينبغي أن حجم محلول يحتوي على قطعة من شبكية العين حوالي 250 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على قطعة صغيرة من شفرة الحلاقة مع حامل شفرة -- على حافة شفرة ينبغي أن تكون في زاوية ما يقرب من 45 ° لحاملها. تتسطح قطعة من شبكية العين على طبقة Sylgard واستخدام شفرة يقطع قطعة من شبكية العين ناعما مع الحفاظ على تمسك طبقة Sylgard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 200 ميكرولتر من محلول يحتوي على الخلايا إلى الغرفة التجريبية -- ترك أي قطعة المتبقية للشبكية في صحن Sylgard المغطاة. إبقاء الغرفة مع الخلايا المعزولة في ضوء مربع محكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لمدة 10 دقيقة للخلايا ليستقر ، ثم إضافة 2-3 مل من رينغر. في هذه المرحلة ، يمكن تحميلها على الخلايا المعزولة مع صبغة الفلورسنت معينة (على سبيل المثال Fura - 2) وفقا لبروتوكول تحميل صباغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن أن تؤخذ الخلايا إلى مرحلة مجهر لإجراء التجارب. </li></ol> 5. مضان التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الغرفة الى مرحلة epifluorescence المجهر. ضبط نضح الحل ، مجسات درجة الحرارة ، والإضاءة بالأشعة تحت الحمراء ، الخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الستائر وبدء التجربة. بدوره على ضوء الأشعة تحت الحمراء داخل القفص المجهر ، والتركيز على الجزء السفلي من الغرفة التجريبية ، والتحرك في المرحلة يبحث عن الخلايا. </li></ol> 6. ممثل النتيجةليالي : التين. 1 يبين مورفولوجية قضيب معزولة صحية ومبصرات مخروط حصل مع هذا البروتوكول من شبكية العين (Ambystoma tigrinum) السمندل. وقد استخدمت خلايا السمندل نطاق واسع لدراسات الخلايا التصوير مضان واحد بسبب كبر حجمها وقدرتها على البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات بعد بمعزل عن شبكية العين. بالإضافة إلى ذلك ، من شبكية العين لا يمكن للمرء الحصول على السمندل بانتظام على حد سواء ، وقضيب مبصرات المخروط. أحد المعايير المهمة لصحة الخلايا هي وجود الاهليلجي سليمة (الشكل 1) ، وجزء من الخلية حيث تتركز الميتوكوندريا. عند النظر إلى الخلايا تحت دابي البصريات ، وهذا يعطي تركيز الميتوكوندريا إشارة قوية مضان (الشكل 2) وذلك بسبب وجود NADH. عدم وجود الإهليلجي سليمة هو علامة على خلية معطوب ، مؤهلة للتجربة. الشكل. 3 يظهر معطوب السمندل قضيب مبصرة ، مع تورم في خلايا الجسم ، والنواة مكثف. مثل هذه الخلايا تعرض أدنى بكثير مضان تحت دابي البصريات ، ولكن ينظر تحت البصريات FITC تظهر إشارة قوية FAD في المنطقة الإهليلجي (منشؤها من النيوكليوتيدات فلافين المؤكسد وflavoproteins). معيار آخر للمحافظة على الصحة من مبصرات معزولة هي قدرتها على توليد جميع العابر الريتينول (فيتامين أ) في القطاعات التي تعمل فيها على التحفيز الخارجي من الضوء. جيل من فيتامين (أ) يتطلب كميات كبيرة من NADPH ، التي تعتمد على الآلات الأيضية سليمة. أرقام 4 و 5 اظهار تشكيل فيتامين (أ) في قطاعات الخارجي من الضفادع سليمة وقضيب مبصرات الماوس على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. وقد تم عزل صحي واحد وقضيب مبصرات المخروط ، وخلايا الشبكية من السمندل نمر. Phototransduction يحدث في الجزء الخارجي والمزدحمة بالسكان في الإهليلجي مع الميتوكوندريا. قضبان هي المسؤولة عن رؤية الضوء الخافت ، والأقماع لرؤية الضوء الساطع. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. مضان المعيشة السمندل قضيب والمخروط ، وهذه هي داكنة تكييف الخلايا ، والاداء القوي في مضان NADH مجسمات القطع الناقص كل منهما وليس فيتامين A مضان كبيرة في القطاعات التي تعمل فيها الخارجي. التقاط صورة مضان يمثل التعرض لأول مرة في الضوء المرئي بعد فترة من التكيف الظلام. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. تضررت السمندل قضيب مبصرة ، وخلايا الجسم وتورم نواة مكثفة تدل على الضرر. يتأكسد الخلية وليس هناك أدنى إشارة NADH (دابي البصريات) ، ولكن أقوى بكثير إشارة FAD (FITC البصريات). <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. الضفدع مع قضيب NADH والريتينول ، وهذا هو قضيب الضفدع صحية مبصرة قويا مضان NADH في المنطقة الإهليلجي. قبل التعرض للضوء وجود الحد الأدنى من مضان في الجزء الخارجي. بعد التعرض للضوء ، وهناك زيادة كبيرة في الجزء الخارجي مضان نظرا لتشكيل فيتامين أ. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig5.jpg" alt="الشكل 5"/> الشكل 5. الفأر مع قضيب الريتينول ، وهذا هو قضيب مبصرة الماوس صحية كبيرة تظهر مضان الجزء الخارجي بعد التعرض للضوء نتيجة لتكوين فيتامين (أ) المناطق الإهليلجي من قضيب مبصرات الماوس لا تظهر إشارة قوية مضان.

<ol>
	<li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Counting+Photons:+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction.">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li><li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Photoreceptors.">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li><li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors.">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li><li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin.">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li><li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration:+The+Friedenwald+Lecture.">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li><li>Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark+Adaptation+and+the+Retinoid+Cycle+of+Vision.">Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision.</a> Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).</li><li>Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Microscopy:+Shedding+Light+on+the+Chemistry+of+Vision.">Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision.</a> Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bleached+Pigment+Produces+a+Maintained+Decrease+in+Outer+Segment+Ca2++in+Salamander+Rods.">Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods.</a> J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).</li><li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Dependent+Changes+in+Outer+Segment+Free-Ca2++Concentration+in+Salamander+Cone+Photoreceptors.">Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).</li><li>Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+the+Rods+of+Wild-Type+and+Transducin+Knock-out+Mice.">Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice.</a> J Physiol. 542, 843-854 (2002).</li><li>Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Measurement+of+Current+and+Calcium+in+the+Ultraviolet-Sensitive+Cones+of+Zebrafish.">Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish.</a> J Physiol. 579, 15-27 (2007).</li><li>Matthews, H. R., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors.">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li><li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors.">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li><li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors.">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li><li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments.">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li><li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks.">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li><li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors.">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li><li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle:+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology.">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li><li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors.">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li><li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments.">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li><li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors.">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li><li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors.">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

إذا لم يتم الحصول على الخلايا المعزولة صحية ، والمشكلة تكمن إما العزلة أو صحة شبكية العين أو مع تقطيع والخمسين. عادة ، بعد إزالة الجزء الأمامي من العين والجسم الزجاجي ، والشبكية ترفع بسهولة قبالة ظهارة الصباغ. إذا لم يكن ، في محاولة لقشر تشغيله ابتداء من محيط فنجان ال?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> الغرفة المظلمة (100-150 قدم 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> أضواء حمراء 19 </td><td></td><td></td><td> متاجر </td></tr><tr><td> مصادر الأشعة تحت الحمراء والأشعة تحت الحمراء للمشاهدين صورة </td><td> FJW البصرية سيستمز </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تشريح المجهر 19 </td><td></td><td></td><td> تجهيزه مع المشاهدين الأشعة تحت الحمراء </td></tr><tr><td> مجهر Epifluorescence المغلقة في قفص محكم ضوء 19 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> تشريح أدوات (مقص ، ملقط ، حامل شفرة) </td><td> Roboz أو أدوات العلوم الجميلة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard الاستومر </td><td> إيسيكس (شارلوت في نورث كارولاينا) </td><td> Sylgard عدة الاستومر 184 </td><td></td></tr><tr><td> بولي - L - الأورنيثين (0.01 ٪) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> بولي - L - يسين (0.1 ٪) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8920 </td><td> تمييع إلى 0.01 ٪ </td></tr><tr><td> غرف التجريبية </td><td> نذير الثمينة (حمدان ، CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> أطباق بتري ، الماصات البلاستيكية </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of living isolated vertebrate photoreceptor cells for fluorescence imaging

في شبكية الفقاريات ، ويتم phototransduction ، وتحويل الضوء إلى إشارات كهربائية وبها قضبان وخلايا مستقبلة للضوء مخروط 1-4. قضيب مبصرات هي المسؤولة عن الرؤية في الضوء الخافت ، والأقماع في الضوء الساطع. Phototransduction يحدث في الجزء الخارجي للخلية مستقبلة للضوء ، حجرة المتخصصة التي تحتوي على نسبة عالية من الأصباغ البصرية ، وكاشف الضوء الأساسي. تتكون صبغة بصرية من حامل اللون ، 11 -- رابطة الدول المستقلة في شبكية العين ، تعلق على البروتين ، opsin. الفوتون تمتصه صبغة بصرية isomerizes حامل اللون في الفترة من 11 -- رابطة الدول المستقلة إلى العابرة للجميع. الايزوميرة الضوئية يجلب هذا التغيير متعلق بتكوين في الصباغ البصرية الذي يبدأ سلسلة من ردود الفعل وبلغت ذروتها في تغيير محتمل في الغشاء ، وإحداث تنبيغ من التحفيز الضوء إلى إشارات كهربائية. استعادة الخلية من التحفيز تنطوي على ضوء التعطيل من وسيطة تفعيلها من خلال الضوء ، وإمكانات إعادة الغشاء. كاليفورنيا 2 + ينظم نشاط العديد من الأنزيمات المشاركة في phototransduction ، ويتم تقليل تركيزه على تحفيز الضوء. في هذه الطريقة ، كا 2 + يلعب دورا مهما في استعادة الخلية من التحفيز الخفيفة والتكيف للضوء الخلفية. آخر جزء أساسي من عملية الانتعاش هو تجديد الصباغ البصرية التي تم تدميرها خلال الكشف عن الضوء من قبل الايزوميرة الضوئية من 11 في -- حامل اللون رابطة الدول المستقلة على جميع العابر 5-7. هذا التجدد تبدأ الافراج عن ريتينال مفروق من الصباغ photoactivated ، مخلفين وراءهم opsin الاشتقاق البروتين. يتم تقليل بسرعة الإفراج عن جميع العابر الشبكية في رد فعل على جميع الاستفادة من NADPH العابر الريتينول ، ويجمع بين opsin الطازجة مع 11 -- رابطة الدول المستقلة الشبكية جلبت الى الجزء الخارجي لإصلاح صبغة بصرية. ثم يتم نقل جميع العابر الريتينول من الجزء الخارجي والى الخلايا المجاورة من البروتين الناقل المتخصصة ريتينويد Interphotoreceptor تجليد (IRBP). ويمكن استخدام التصوير مضان من خلايا مستقبلة للضوء واحد لدراسة علم وظائف الأعضاء وبيولوجيا الخلية. كاليفورنيا 2 + يمكن حساسة الأصباغ الفلورية يمكن استخدامها لفحص بالتفصيل التفاعل بين الجزء الخارجي كا 2 + التغيرات والاستجابة للضوء 12/08 فضلا عن دور الكالسيوم الجزء الداخلي 2 + مخازن في كا 2 + التوازن 13،14 . ويمكن أيضا أن تستخدم الأصباغ الفلورية لقياس تركيز المغنيسيوم 2 + 15 ، ودرجة الحموضة ، وكأثر من الغشاء المائي والمقصورات 16. أخيرا ، يمكن استخدام مضان الجوهرية للجميع عبر الريتينول (فيتامين أ) لرصد حركية من تشكيلها ، وإزالة خلايا مستقبلة للضوء في واحدة 17-19.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging at JoVE.com

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

تم وصف طريقة لإعداد واحدة من خلايا مستقبلة للضوء الذين يعيشون نوعا من الفقاريات المختلفة للتصوير مضان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لصورة مضان من fluorophores الذاتية ، مثل NADH أو فيتامين (أ) ، أو أن من الأصباغ الفلورية خارجيا وأضاف حساسة لكاليفورنيا<sup&gt; 2 +</sup&gt; أو غيرها من العوامل.

إعداد يعيشون معزولين خلايا مستقبلة للضوء الفقارية للتصوير الإسفار

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

preparation-living-isolated-vertebrate-photoreceptor-cells-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K Views.  Medical University of South Carolina. تم وصف طريقة لإعداد واحدة من خلايا مستقبلة للضوء الذين يعيشون نوعا من الفقاريات المختلفة للتصوير مضان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لصورة مضان من fluorophores الذاتية ، مثل NADH أو فيتامين (أ) ، أو أن من الأصباغ الفلورية خارجيا وأضاف حساسة لكاليفورنيا 2 + أو غيرها م...

Video: Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

إعداد شرائح الحاد المنطقة Subventricular للتصوير الكالسيوم

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

تصور جسيم داخلي حيوية في محطات عصب المعيشة مع رباعية الابعاد التصوير الإسفار

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

التنمية المقايسة للقياس الكمي المحتوى عالية Sod1 البروتين متحولة تشكيل التجميعية في الخلايا الحية

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

عزل يمكن الاعتماد عليه من الاوعيه المجهرية للجهاز العصبي المركزي عبر خمس مجموعات فقاري

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are laterally packed in the outermost layer of the retina, the photoreceptor layer, resulting in alignment of analogous subcellular compartments. Traditionally, tangential sectioning of the frozen flat-mounted retina has been used to study the movement and localization of proteins within different rod compartments. However, the high curvature of the rod-dominant mouse retina makes tangential sectioning challenging. Motivated by the study of protein transport between compartments, we developed two peeling methods that reliably isolate the rod outer segment (ROS) and other subcellular compartments for western blots. Our relatively quick and simple techniques deliver enriched and subcellular-specific fractions to quantitatively measure the distribution and redistribution of important photoreceptor proteins in normal rods. Moreover, these isolation techniques can also be easily adapted to isolate and quantitatively investigate the protein composition of other cellular layers within both healthy and degenerating retinae.

This protocol presents two techniques to isolate the subcellular compartments of murine rod photoreceptors for protein analysis. The first method utilizes live retinae and cellulose filter paper to separate rod outer segments, while the second employs lyophilized retinae and adhesive tape to peel away rod inner and outer segment layers.

طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...