עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (WE849/16 1 / 2 עד KD ו RW). אנו אסירי תודה תומאס אוילר (Töbingen, גרמניה) עבור QDs תוכנה גירוי האור.

התיאור הבא מניחה כי הנסיין יש הבנה בסיסית של מבנה הרשתית, תיקון-clamp הקלטה, שני הפוטונים במיקרוסקופ. למידע שימושי על הקמת מפעיל התקנה תיקון-clamp ושני פוטון מערכת הדמיה לראות השופטים [7-12]. 1. בעלי חיים והכנה רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור עכבר כהה להתאים לפחות 3 ח בינתיים, להכין 1-2 l פתרון של תאית המורכב (מ&quot;מ) 125 NaCl, KCl 2.5, 1 CaCl 2, 1.6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-גלוקוז לאזן אותו pH 7.4 בגז עם carbogen (5% ב-CO 2 O 2) בטמפרטורת החדר. </li> <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בתא אוויר חזק על ידי מנת יתר של CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. הליך זה לבין השלבים הבאים יש לבצע בחושך. שימוש בתאורה עמומה ארוכת הגל (אנו חוסמים אורכי גל קצרים ממקור אור קר על ידי 690 ננומטר-longpasשל מסנן) כדי לתמוך חזון אישי תוך שמירה על העיניים של החיה כהה מותאם (עכברים רק חזון עני בחלק האדום של ספקטרום האור). לעבודה תאורה להשתמש להשלים החושך אינפרא אדום (&gt; 800 ננומטר) ללבוש משקפי ראיית לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate עיניים עם זוג מספריים מעוקל איריס ולהעבירם צלחת של פתרון תאיים תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרנית ואת הגוף ריסי ידי פתיחת הנורה העין לאורך serrata אורה (הגבול בין הרשתית ואת הגוף ריסי) עם זוג מספריים אביב (אנחנו הראשונים להשתמש Lancet לחדור נקודת התחלה עבור חיתוך). קח את העדשה בזהירות להפריד את הרשתית של אפיתל הפיגמנט. אם הכיוון של הרשתית הוא חיוני כדי ללמוד שלך, מציינים את זה כמו שופט [12]. חותכים את העצב האופטי בין הרשתית לבין אפיתל הפיגמנט ולהסיר את הרשתית מן עיינית. הערה כיוון משטחי רשתית: החלק הפנימי של הרשתית מכורבל הוא ganglבצד יון התא; החיצון הוא הצד photoreceptor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזגוגית מעל פני הרשתית הפנימי על ידי משיכתו בעדינות מעל בעזרת קיסם עץ. לשם כך, השתמש נפח קטן של פתרון תאיים כי רק מכסה את הרשתית. מקלות זגוגי עד קיסם והוא יכול להיגרר centrifugally את הרשתית. לאחר מכן, החל חתכים קצרים יחד למתחם הרשתית כדי להקל על שיטוח של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית לתוך תא ההקלטה photoreceptor בצד למטה, ופרש אותה על תחתית זכוכית (אנו משתמשים במכחול דק) ו לשתק אותו עם מסגרת ניילון מתוח של נירוסטה. הכן את הרשתית השני באותו אופן ולשמור כהה להתאים פתרון תאיים carboxygenated לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 2. הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקינו את תא הקלטת בחושך תחת מיקרוסקופ לייזר זקוף סריקה superfuse הכנת רשתית ברציפות (לא פחות מ 5 מ&quot;ל / min) עם פתרון תאיים carboxygenated מחומם ל 35 ° C. המיקרוסקופ (גם מצויד במצלמת CCD אינפרא אדום רגיש) שוכן על שולחן הלם קליטת האוויר בתוך כלוב פאראדיי עבור מיגון אלקטרוניים. מכסים את הכלוב עם וילון לא שקוף כדי לשמור על הכנת בחושך. יש לנו גם את המסך האור מסכי מחשב על ידי סרט אדום שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון לייזר אינפרא אדום באורכי גל 850-870 ננומטר, או יותר, לעבור למצב במצב נעול, ולהשתמש שני הפוטונים עירור לדמיין GFP-להביע תאים. להחליש את פלט לייזר באמצעות מסננים צפיפות ניטרלי בשליטת התוכנה סריקה לייזר למטה במידה כי הוא מספיק רק הכרה ברורה של התא פלורסנט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיקון-clamp הקלטות מהדק הנוכחי לשימוש micropipettes מצב זכוכית (אנו משתמשים בצינור זכוכית בורוסיליקט בקוטר 1.5 מ&quot;מ החיצונית 0.225 מ&quot;מ עובי דופן) מלאים פתרון תאיים המורכב (מ&quot;מ) 125 K-gluconate, 10 KCl, 0.5 EGTא &#39;, 10 HEPES, טיטרציה pH 7.4 עם KOH (מתן התנגדות פיפטה של ​​כ 5 MΩ). שים לב כי תנאי הניסוי אחרים כמו הקלטה מתח-clamp דורשים פתרון אחר. אם זריקות צבע הם הרצוי, להוסיף בדיקה ניאון (אנו משתמשים 10 mM אלקסה פלואוריד 594) או מולקולה נותב (3% Neurobiotin). הכנס את micropipette לתוך מחזיק ולוודא כי הפניה אלקטרודה (חוט כסף כלור) נמצא בקשר עם הפתרון תאיים בתא ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הלחץ micropipette ואת יעד GFP-להביע תאים (אנו משתמשים 40 פי טבילה אובייקטיבי מים; NA 1.25). גופי התא Amacrine נמצאים בשכבת גנגליון תא (ישירות מתחת לפני השטח בכיוון הנוכחי של הרשתית), וכן בחלק הפרוקסימלי של שכבת הגרעין הפנימית (כ 55-75 מיקרומטר עמוק בתוך ההכנות). לפני מגע micropipette עם תא המטרה, להגביל את הממברנה הפנימית (נדן עשוי גליה endfeet) על הרשתיתהמשטח צריך להיות חדרו. חדירה מוצלחת מוכר על ידי פתרון תאיים כי הוא מונע את מקצה micropipette ו מנתק את קרום הגבלת הפנימי של רקמת הרשתית הבסיסית כפי שניתן לראות בתמונה שידור אינפרא אדום נתפס על ידי מצלמה IR-CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגישה לתא הרצוי על ידי השוואת עמדת סומה מהתמונה שני פוטונים עם התמונה של המצלמה IR-CCD מראה את המיקום של micropipette את ההקלטה. שים לב שלב זה לא יושג בקלות דורש קצת תרגול, משום התא GFP-לבטא יש להכיר בדמות שידור אינפרא אדום על מנת לכוון את micropipette אליה. מיקוד נכון מושגת כאשר קצה micropipette גורם מנקדים את פני השטח של התא ניתן לראות תמונה של שני הפוטון. חלופה להליך זה, השתמש צבע פלואורסצנטי (למשל אלקסה פלואוריד 594, 100 מיקרומטר) בפתרון תאיים לחשוף את המיקום micropipette בתמונה שני הפוטון. שני הפוטונים עירור אינפרא אדום מאפשרת הקרינה מספקת של הצבע הזה כדי להפוך micropipette ניכרת. לענין זה, להתאים את טווח גילוי בתוכנה סריקת לייזר כדי לכסות גם פלואורסצנטי אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרור הלחץ micropipette ולקבל כל תא תיקון-clamp מהדק תצורה במצב הנוכחי. הקלטה שמיש צריך לתת פוטנציאל הממברנה של mV -50 ל -55 והאחרונה דקות לפחות 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירויים חזותיים הווה נוצר על ידי תוכנה גירוי (אנו משתמשים QDs ידי תומאס אוילר, אוניברסיטת טובינגן, גרמניה) 11 על צג המחשב. התאם את המיקום המרחבי של הגירוי להיות מרוכז על התא נרשם: מארק עמדת התא על המסך מראה את התמונה של המצלמה שידור IR-CCD מרכז גירוי ספוט כמו על זה. כוון את עוצמת הגירוי על ידי הוספת פילטרים צפיפות ניטרלי לתוך הנתיב הקורה. עבור כיול של הספקטרום לפקח עוצמת לראות שופט [14]. בחר prolongeד interstimulus מרווח (למשל 15 שניות), כדי למנוע הסתגלות. כלול photodiode בתוך נתיב הקורה כדי לשמור על שיא של עיתוי הגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את פרוטוקול גירוי ולהקליט את התגובות אור (אנו משתמשים קצב דגימה של 10 קילוהרץ עם סינון על 5 kHz שאינם spiking תאים; הקלטה ספייק קצב דגימה גבוה כמו kHz 20 מומלץ). השתמש בתוכנה גירוי האור כדי לעורר את תוכנת הצריבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צבע המילוי לתת מפוזר סוכן פלורסנט לתוך התא רשמה 30-45 דקות לפני retracting בעיון את micropipette מהתא. הקפידו לא להוציא את גוף התא. אם לא פלורסנט נותב Neurobiotin שימש, זה צריך להדמיה באמצעות קשירה streptavidin מצומדות כדי fluorophore (אנו משתמשים streptavidin-Cy3, מעל 1:400 בלילה 4 מעלות צלזיוס אחרי 20 דקות paraformaldehyde קיבעון של הרשתית; עבור צימוד, צבע מחקרים הדגירה streptavidin יכול להיות ממושכת 3 ד). לחילופין, זריקות יכול להיות גם הופיעה עםאלקטרודות חדה (&gt; 100 MΩ) כאשר צבע מונע iontophoretically לתוך התא משופד (פולסים מלבני: 0.25-1 NA, 100 אלפיות, 100 אלפיות מרווח, הזמן הכולל 3-6 דקות). </li></ol> 3. נציג תוצאות: את התוצאות הבאות שמקורם במחקר על עכבר לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת האמרגן עבור tyrosine hydroxylase 13,14, האנזים catalyzing שיעור הגבלת צעד בסינתזה קטכולאמינים (TH: עכבר ה-GFP). בהתבסס על הבהירות של ה-GFP אותות שתי אוכלוסיות תאים שונות וניתן להבחין בהם (איור 2A). תאים המבטאים את רמת ה-GFP גבוה בעל גוף התא ממוקם שכבת הגרעין הפנימית (INL, איור 2 א) או עקורים בשכבת תא גנגליון (GCL, איור 2B) ו לרבד באמצע השכבה הפנימית plexiform (IPL, איור 2C) . הם זוהו 2 תאים מסוג 14-16 ויכול להיחקר באופן שיטתי לגבי המורפולוגיה (איור 3) ולבחורפעילות rical (איור 4) למרות צפיפות האוכלוסין שלה מסתכם רק 250 תאים / מ&quot;מ 2. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> באיור 1. ייצוג סכמטי של הגדרת הניסוי. שני הפוטונים עירור (אור אדום שביל מקווקו) של fluorophore-להביע תאים ברשתית שלם מאפשר מיקוד הראייה על ידי micropipette (אור ירוק בנתיב פליטה). הרשתית היא נתון לגירויים אופטי מוקרן דרך הקבל של המיקרוסקופ (נתיב האור הצהוב), ותגובות אור הסלולר נרשמים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> באיור 2. GFP-להביע את התאים flatmount הרשתית של TH: עכבר ה-GFP. שתי אוכלוסיות ניתן להבחין על ידי הבהירות של אות ה-GFP: 1 סוג התאים (תאים DA) הממוקם INL מראה הקרינה חלשה (ראו ראשי חץ) וסוג שכותרתו בעוצמה 2 תאיםעם גופי התא או את INL (ראה חיצים) או עקורים בתוך GCL (B) ריבוד הדנדריטים בשכבה S3 של IPL (C). סולם ברים, 50 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> באיור 3. מורפולוגיה של תא מסוג 2 מוזרק עם Neurobiotin נותב. נותב היה דמיינו לאחר מכן על ידי streptavidin-Cy3 מחייב (מג&#39;נטה). מיקרוסקופ, שהוא גם המתארת ​​את אות ה-GFP (ירוק), היא השלכה של ערימות התמונה מכסה את GCL ו IPL. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> איור 4. תגובות אור של תא מסוג 2 נמצא GCL. תגובת דפוס תאורה לבנה שדה מלא אור בעוצמה גוברת בטווח scotopic. עוצמת הגירוי ניתנת photoisomerizations לכל מוט לשנייה (Rh * / מוט / s). גירוי ממושך של 3 שימש יותר ברוריםיון של מרכיבי התגובה תחילת הגירוי (על התגובה) וכן לקזז (OFF תגובה).

<ol>
	<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+plan+of+the+retina.">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li><li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry.">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells.">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Jackson, M. B., Gerfen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+voltage+clamp+recording.">Whole-cell voltage clamp recording.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (1997).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pf&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li><li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , (2005).</li><li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pfl&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li><li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li><li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice.">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li><li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina.">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li><li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina.">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla M&#252;ller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina.">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li><li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

העכברים טופלו ו מורדמים בהתאם להנחיות המוסדי לרווחת בעלי חיים לבין חוקי על ניסויים בבעלי חיים שהונפקו על ידי ממשלת גרמניה.

שיטה זו מציעה את האפשרות ללמוד את התכונות החשמליות של נוירונים ספציפיים ברשתית שלם תחת הדרכתו חזותי ללא השפעה על מצב adaptational של הרשתית. זה מתאים במיוחד עבור אפיון של התאים כיום למד די רע בשל צפיפות אוכלוסין נמוכה כמו רוב אוכלוסיות של תאים amacrine. שני הפוטונים עירור היתרי הדמיה ברזולוציה גבוהה וניגודיות גבוהה אפילו ממקומות עמוקים יותר של הרקמה 17, תנאי הכרחי מיקוד מדויק ומוצלח תיקון-clamping של תאים בעיקר INL עם צפיפות גבוהה של גופי התא. הרשתית עכבר מבודד הוא בר קיימא עבור 3-4 שעות תחת תנאי הניסוי. אם הרשתית השני הוא מאוחסן בחושך מוחלט תחת בגז carbogen רציפה, הוא שומר את הצבע הסגול של photopigment מולבן וניתן להשתמש בו לאחר סיום ניסויים הרשתית הראשונה. בהתחלה, מיקודהתא הנבחר עם micropipette ב wholemount הרשתית היא קצת מאתגרת דורש קצת תרגול, במיוחד כאשר עובדים בחושך. כולל צבע פלואורסצנטי ב micropipette יכול לפשט את ההליך, כי התא micropipette גלויים תחת עירור שני פוטונים באותו זמן. עם זאת, הוספת רכיבים לפתרון תאיים עשוי לעכב היווצרות gigaseal או לגרום את איכות ההקלטה לסבול. לאחר שהושגו בהצלחה, הקלטה טובה יכולה להימשך כ 1 ח בעוד האור עירור אינפרא אדום עצמו נספג היטב רק על ידי קולטני האור ברשתית, נרגש GFP-לבטא בתאי פולטים אור בחלק הנראה של הספקטרום. עם זאת, fluorophores שמחים רק בנפח מוקד קטן אינו צפוי לשנות את המצב adaptational של הרשתית. כל עוד, עירור נדרשת רק המיקוד יכול להיות כבוי במהלך ההקלטה של ​​תגובות אור. UsefulnESS של גישה זו באה לידי ביטוי כבר על ידי מחקרים על אוכלוסיות ספציפיות של תאים amacrine 14,18 שממנו הקלטות אלקטרו אחרת היה אפשרי רק במקרה 12. לבסוף, טכניקה זו עוצמה נוספת יכולה להיות מורחבת על ידי כולל גישה תרופתי 14, Ca 2 + הדמיה 19 או באמצעות התאים מוזרקים ללימודי immunocytochemical או במיקרוסקופ אלקטרונים. בדרך זו, עמדת תפקודית של סוג תא נתון המעגלים ברשתית יכול להיות פרומים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב / צייד-ment </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> משקפי ראיית לילה </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, גרמניה </td><td> Xtron F1 </td><td> כולל מקור אור 800 ננומטר </td></tr><tr><td> פילטר אופטי </td><td> שוט, מיינץ, גרמניה </td><td> RG9 </td><td> longpass מסנן עם הפסקת ב 690 ננומטר </td></tr><tr><td> איריס מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 14061-09 </td><td> מעוקל עם להב 22 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> האביב מספריים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15000-00 </td><td> ישר עם להב 3 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> הקלטה קאמרית </td><td> Luigs &amp; נוימן GmbH, Ratingen, גרמניה </td><td> 200-100 500 0180 סוג (TC) </td><td> טפלון קאמרית עם תלוש התחתונה רכוב מכסה זכוכית (כ 0.15 מ&quot;מ; מס &#39;500 200-100 0182) </td></tr><tr><td> תזרים דוד </td><td> רב מערכות, Reutlingen, גרמניה </td><td> PH01, TC01 </td><td> זלוף צינורית heatable עם טמפרטורה שלאנסור וטמפרטורה בקר </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ לייזר סורק </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> נשלט על ידי תוכנה Confocal לייקה </td></tr><tr><td> שולחן האוויר </td><td> ניופורט </td><td> VH-3036W הכבושים </td><td></td></tr><tr><td> לייזר </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> מצב נעול הצונאמי טי: ספיר לייזר </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> PCO AG, Kelheim, גרמניה </td><td> PixelFly QE </td><td> כולל תוכנת שליטה </td></tr><tr><td> Micropipette זכוכית נימי </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, גרמניה </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette חולץ </td><td> סאטר Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> פלורסנט צבע </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> לא פלורסנט נותב </td></tr><tr><td> Streptavidin-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרופוןromanipulator </td><td> Luigs &amp; נוימן GmbH, Ratingen, גרמניה </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> ממונע Mini25 יחידת מניפולטור עם תצוגה SM-5 </td></tr><tr><td> Patch-clamp מגבר </td><td> NPI אלקטרוניים GmbH, Tamm, גרמניה </td><td> ה-SEC-05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> נתונים רכישת תוכנה WinWCP </td><td> ג&#39;ון דמפסטר, אוניברסיטת סקוטלנד, גלזגו, בריטניה </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> גנרטור גירוי חזותי QDs </td><td> תומאס אוילר, אוניברסיטת טובינגן, גרמניה </td><td></td><td> צריך להיות מופעל במחשב נפרד שליטה 2 צגים (ממשק משתמש, גירוי צג) </td></tr><tr><td> הצפיפות מסננים ניטרלי </td><td> ITOS, מיינץ, גרמניה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

ללמוד את המאפיינים פיזיולוגיים קשרים סינפטיים של נוירונים ספציפיים ברקמות שלמות היא אתגר עבור אותם תאים חוסר תכונות מורפולוגיות בולט או להראות צפיפות אוכלוסין נמוכה. זה חל במיוחד amacrine תאים ברשתית, מעמד יוצא דופן של רב צורות interneurons המרכיבים בערך 30 תת ביונקים 1. למרות היותו חלק חיוני של עיבוד חזותי על ידי עיצוב פלט הרשתית 2, רוב תת אלה לא נחקרו עד כה בהקשר פונקציונלי כי המפגש התאים האלה עם אלקטרודה ההקלטה היא אירוע נדיר. לאחרונה, מספר רב של קווי עכבר מהונדס זמין המבטאים סמנים ניאון כמו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטתו של היזמים עבור קולטני קרום או אנזימים ספציפיים משנה בלבד של נוירונים רקמות נתון 3,4. אלה מראש שכותרתו תאים ולכן הם accessibl<html> דואר אל microelectrode ביים מיקוד בשליטה מיקרוסקופיים, המתיר לימוד שיטתי של מאפיינים פיזיולוגיים שלהם באתרם. עם זאת, עירור של סמנים ניאון מלווה בסיכון phototoxicity עבור רקמת החיים. ברשתית, גישה זו היא בנוסף הקשו על ידי הבעיה האור גורם עירור גירוי מתאים של קולטני האור, ובכך גרימת photopigment הלבנת והעברת מעגלים רשתית למצב האור מותאם. חסרונות אלה להתגבר באמצעות עירור אינפרא אדום נמסר על ידי לייזר במצב נעול בפולסים קצרים של טווח femtosecond. עירור שני פוטון מספקת מספיק אנרגיה עבור עירור fluorophore ו באותו זמן מגבילה את עירור לנפח רקמה קטן למזער את הסיכונים של נזקי 5. כמו כן, הוא עוזב את הרשתית מגיבים לגירויים חזותיים מאז אור אינפרא אדום (&gt; 850 ננומטר) נספג היטב רק על ידי photopigments 6. s = &quot;jove_content&quot;&gt; במאמר זה אנו מדגימים את השימוש של הרשתית עכבר מהונדס להשיג אלקטרו בהקלטות באתרו של ה-GFP-להביע תאים ממוקדות חזותית על ידי עירור שני הפוטונים. הרשתית היא מוכנה ומתוחזק בחשכה יכול להיות חשוף לגירויים אופטיים אשר מוקרנים דרך הקבל של המיקרוסקופ (איור 1). Patch-clamp הקלטה של ​​תגובות אור ניתן לשלב עם צבע מילוי כדי לחשוף את המורפולוגיה כדי לבדוק לצבוע הפער צומת בתיווך צימוד תאים שכנים, כך תא היעד יכול ללמוד על רמות על ידי ניסויים שונים.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina at JoVE.com

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.3K Views.  University of Oldenburg. מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

Video: Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

אפיון היסטולוגית שלם של Microdevices מוח מושתלים-ורקמה סובבת

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

בידוד של אוכלוסיות תאים שונות מהמוח הקטן פיתוח על ידי Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

מעמיק פיסיולוגי ניתוח של אוכלוסיות תאים מוגדרות ב אקוטי רקמות פרוסות של איברי עכבר vomeronasal

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

במבחנה אפיון של המאפיינים אלקטרופיזיולוגיות של סיבי מביא שטיפת המעי הגס בחולדות

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...