מחקר זה נתמך על ידי CCSRI גרנט # 700537 ו CIHR גרנט # 84535 כדי JDL NIH ו / NCI מענק # CA120711 ו-01A1-01A1 CA120711 ל AZ. כל הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות והנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש ועדת באוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו, טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת מערב אונטריו.

1. הרכבה של הגידול לתוך CAM העובר העופות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פגז פחות עוברי תרנגולת מופרית כפי שתואר 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 9 של ההתפתחות העוברית, להרכיב מיקרו הזרקה באמצעות מחט 18-מד מחובר על מזרק 1 מ&quot;ל. לחתוך 5-6 ס&quot;מ חתיכת צינור Tygon (1 / 32 &quot;קוטר פנימי, 3 / 32&quot; קוטר חיצוני, 1 / 32 &quot;עובי דופן) בזהירות להכניס שפוע של מחט לתוך צינורות. כ 4-5 ס&quot;מ של צינורות צריך להאריך מקצה המחט (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המזרק צינורות עם ההשעיה התא. לאחר מכן, הכנס מחט זכוכית microinjection בסוף בצינור ובזהירות להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק יום 9 עוברי (איור 1b) תחת בהיקף דיסקציה עם המאייר עם 10,000-100,000 תאים סרטניים כמו בולוס בתוך CAM (איור 1 ג&#39;). לאט לאט ובזהירות להזריק תאים להבטיח כי המחט נמצאת במקום הנכון עבור התאים לצורה בולוס גלוי בתוך CAM. תאים לטפטף על פני השטח CAM ניתן לנקות באמצעות המוליך Kimwipe או אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל העוברים באינקובטור humidified ב 38 ° C לחות על 60% ולאפשר הגידול לגדול vascularize (עד 7 ימים). </li></ol> 2. הכנה של חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין שכותרתו fluorescently חלקיקים CPMV עבור הזרקה לתוך העובר עוף; לדלל את חלקיקים נגיפיים (מסונתז כמו 8 ב-PBS, pH 7.4, ריכוז של 100 מיקרוגרם תערובת / ml וורטקס היטב לפני השימוש ו צנטריפוגות במשך דקה אחת כדי להסיר. אגרגטים. Sonication יכול להיות גם שימושי, תלוי conjugates ומידת צבירה. מניות של CPMVs שכותרתו fluorescently יציבים במשך שנה לפחות 1 כאשר מאוחסנים 4 ° C בחושך. בדוק מניות מעת לעת על ידי הצבת כמה טיפות לשקופית זכוכית בדיקת הקרינה. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) יכול לשמש גם כדי לקבוע אם חלקיקים נותרו על כנן לאחר הצמידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, אחד מיקרוגרם של חלקיקים נגיפיים (נפח סופי של μl 2) ניתן להוסיף רשתות נחושת מצופה. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של אצטט uranyl 2% למשך דקה 1 על מיקרוסקופ אלקטרונים (פיליפס EM 410). </li></ol> 3. הזרקה תוך ורידי של חלקיקים נגיפיים fluorescently שכותרתו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 16, להרכיב מיקרו ההזרקה כפי שתואר לעיל. צייר את העוצמה הרצויה של nanoparticle ויראלית דרך צינורות לתוך המזרק (&gt; 200 μL). בזהירות להסיר את כל בועות האוויר. הכנס זכוכית מחט microinjection בסוף הצינור. ודא כי המחט היא עוד והצרות ככל האפשר (איור 2 א). אם המחט היא בוטה מדי, הוא לא יוכל לחדור מבעד האאקטודרם ו ייכשל לחדור אל הספינה. אם המחט היא חדה מדי, טיפ תקרוס כאשר חודר לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק לווריד 100 μl של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​והעמסת dextran (MW 70,000 דא, Invitrogen) לתוך העובר הנושאת גידול דיסטלי מאתר הרצוי להיות דמיינו (איור 3d). Cannulation מוצלח של וריד CAM ניכר ידי ניקוי הדם בנתיב הזרימה הזרקה (איור 2b). הערכת כלי דם דליפה 1 שעה לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק לווריד 50 μl של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון של CPMV-Alexa פלואוריד 647 (CPMV AF-647) או PEGylated CPMV-Alexa פלואוריד 647 (CPMV-PEG-AF 647) לעוברי המכיל גידולים עם כלי דם דליפה דיסטלי מהאתר הרצוי להיות דמיינו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה גידולים מיד וכל שעה לאחר ההזרקה באמצעות בוחן Zeiss Z1 מיקרוסקופ זקוף מצויד בדיסק Yokogawa ספינינג, Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD המצלמה. </li></ol> 4. בזמן אמת הדמיה intravital <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרכיב את יחידת ההדמיה העובר, למרוח שכבה דקה של שומן ואקום סביב היקף של הנמל הדמיה על החלק התחתון של המכסה של יחידת ההדמיה העובר, ובכושר 18 מ&quot;מ זכוכית coverslip על הנמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר כך coverslip יכסה את האזור הרצוי עבור הדמיה. לאט לאט להוריד את המכסה עד coverslip רק יוצר קשר עם העובר, ולאחר מכן להבריג את המכסה על היחידה כדי להחזיקו במקום (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים מחוממת 37 מעלות צלזיוס ליחידה העובר הדמיה מחוץ מאכל המכיל את העובר, ולאחר מכן למקם את היחידה כולה על הבמה של מיקרוסקופ confocal זקוף עם תא סביבתיים בתוך equilibrated עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום הדמיה היחידה המכילה את העובר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ספינינג דיסק confocal (2e איור). יחידת הדמיה תחזיק את העובר במקום לשמור את שדה הראיה קבוע בעת לכידת תמונות, המאפשרת גם תלת מימדי ערימות Z ו - זמן לשגות תמונות כדי ליפול בפח. אנו לרכוש ולנתח תלת ממדי זמן לשגות תמונות באמצעות פרקין אלמר של (לשעבר אימפרוביזציה) Volocity חבילת תוכנה (איור 3a). לרכוש ברזולוציה גבוהה תלת ממדי ערימה של הגידול ואת כלי הדם שמסביב לדמיין detaileד מנתח מבניים בזמן נקודות ספציפיות. רוכשת תלת ממדי ערימות בזמן נקודות קבוע למפות השינויים המבניים המפורטים בכלי הדם של הגידול. גידולים תמונה כל שעה לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ספיגת של חלקיקים נגיפיים על ידי חישוב ממוצע אלקסה פלואוריד (AF) 647 אות בתוך אזורים נבחרים הגידול או את התוכנה stroma (שאינם סרטניים באזור) באמצעות תמונה quantitation כגון Volocity (פרקין אלמר). הגידול יחס stroma היה מחושב על ידי חלוקת אומר AF 647 אות בגידול מעל האות כלומר 647 AF ב stroma. יחס הגידול / stroma גבוה יותר מאשר 1 מציין כי nanoparticle הוא נלקח על ידי הגידול. </li></ol> 5. נציג התוצאות: בדוגמה המתוארת כאן, אנו מזריקים HT-29 בתאי סרטן המעי הגס כדי ליצור בולוס כ 1mm בגודל בתוך CAM של 9 יום עוברי תרנגולת (איור 1b). לאחר חיסון, העוברים היו בתרבית למשך 7 ימים בתוך חממה humidified להתיר הגידול כלי דם מספקת (איור 1 ג&#39;). עוברים היו מוזרק לווריד עם משקל מולקולרי נמוך dextran לאשר כלי דם סרטניים, גידולים היו דמיינו תחת מיקרוסקופ AxioExaminer Z1 Zeiss זקופה (איור 2). לאחר עירוי לוריד של CPMV AF-647 או CPMV-PEG-AF 647 חלקיקים (איור 3 א ו - ב), ברזולוציה גבוהה חשף בזמן אמת confocal הדמיה (2e איור) כי הן CPMV CPMV ו-PEG חלקיקים שכותרתו במהירות vasculature כולו, אבל את ספיגת של CPMV-PEG על ידי הגידול היה כ 3 פעמים גבוה יותר מאשר CPMV לאחר 12 שעות (איור 3 א). ספיגת הגידול היחסי של חלקיקים נקבע באמצעות ניתוח התמונה תוכנה (Volocity מן פרקין אלמר). אזורים של עניין נבחרו ומחוצה הגידול (בתא סטרומה) ​​ואת עוצמת הקרינה הממוצע של כל אחד נקבע. נתונים מבוטא יחס הגידול / stroma. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Microinjection של גידולים תוך CAM של העובר העופות. (א) מנגנון microinjection מורכב מן הרכיבים כפי שצוין. (ב) עוברי העופות ביום 9 מוכנים להיות מחוסן עם הגידול כאשר CAM התפשט לכסות את כל פני השטח. (ג) בשעה 16 יום, הגידול יהיה גדלו עד 1 ס&quot;מ קוטר (קו מקווקו) והוא מוכן להזרקה עם חלקיקים. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הזרקה Nanoparticle הדמיה intravital. הזרקה תחת מיקרוסקופ לנתיחה מראה (א) את קצה המחט microinjector מוכן להיות מוזרק לווריד CAM ו (ב) את המחט microinjector המוחדרת לווריד (מסומן בחץ) חלקיקים מוזרק זרימת הדם (ראו ידי ניקוי של דם). (ג) העובר המכיל יחידת דימות עם העופות coverslip interfaced ישירות עם רמ&quot;א. (ד) לפני הזרקת nanoparticle, כלי הדם הגידול הוערכה באמצעות הדמיה intravital לאחר ההזרקה של והעמסת dextran. (ה) יחידת ההדמיה העובר המכיל את מיקומו על הבמה של מיקרוסקופ confocal זקוף בתוך קבוצת בטמפרטורה מוסדר המתחם עד 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. להדמיה Intravital של ספיגת nanoparticle בגידולים אנושיים. גידולים הם דמיינו 7 שעות לאחר ההזרקה של (א) CPMV-AF647 ו (ב) CPMV-PEG-AF647. ד) כריתה של הגידול מעובר העופות לניתוח שלאחר מכן.

<ol>
	<li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Judenhofer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+PET-MRI:+a+new+approach+for+functional+and+morphological+imaging.">Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging.</a> Nat Med. 14, 459-465 (2008).</li><li>Weissleder, R., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+the+era+of+molecular+oncology.">Imaging in the era of molecular oncology.</a> Nature. 452, 580-589 (2008).</li><li>Chambers, A. F., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+for+experimental+metastatic+ability+of+heterologous+tumor+cells+in+the+chick+embryo+after+DNA-mediated+transfer.">Selection for experimental metastatic ability of heterologous tumor cells in the chick embryo after DNA-mediated transfer.</a> Cancer Res. 44, 3970-3975 (1984).</li><li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+rat+glioma+growth,+invasion,+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model.">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li><li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151.">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer cell. 13, 221-234 (2008).</li><li>Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging.">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nature medicine. 12, 354-360 (2006).</li><li>Leong, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles.">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nature protocols. 5, 1406-1417 (2010).</li><li>Chatterji, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock;+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus.">New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chemistry &#38; biology. 11, 855-863 (2004).</li><li>Brunel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting.">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).</li><li>Steinmetz, N. F., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEGylated+viral+nanoparticles+for+biomedicine:+the+impact+of+PEG+chain+length+on+VNP+cell+interactions+in+vitro+and+ex+vivo.">PEGylated viral nanoparticles for biomedicine: the impact of PEG chain length on VNP cell interactions in vitro and ex vivo.</a> Biomacromolecules. 10, 784-792 (2009).</li><li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells.">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

קרום chorioallantoic (רמ&quot;א) של העובר העופות הוא מודל שימושי כדי להעריך את הדינמיקה של כלי הדם והפרמקוקינטיקה של גידולים אנושיים. המבנה והמיקום של CAM מאפשרת רכישת תמונה באיכות גבוהה מתאים של סוגים רבים של סרטן xenografts ללא ניתוחים פולשניים. יתר על כן, הגידול xenografts סרטן מושתלים לתוך קרום chorioallantoic להיות vascularized בתוך 7 ימים, המציע מהיר, אמצעי זול למחצה תפוקה גבוהה כדי להעריך את הצטברות של חלקיקים רקמת הגידול. מאז xenografts סרטן מושתל CAM של פגז פחות עוברי תרנגולת נגישים ברזולוציה גבוהה אופטיקה של מיקרוסקופ epifluorescence או confocal זקוף, מידע הקשרי ובזמן לגבי ספיגת nanoparticle ב vasculature הגידול ניתן להשיג בקלות. Xenografts סרטן במודל זה נוטים לגדול רוחבית לאורך CAM, וכתוצאה מכך גידולים גדולים תוך שמירה על פחות מ -200 מ &#39;עומק. זה עושה להם טוב במיוחד מתאים הדמיה intravital כי מיקרוסקופים epifluorescence רגיל יכול למעשה לחדור את המסה הגידול כולו. לעומת זאת, גידולים מושתל או אתרי שטחית או orthotopic בתוך העכבר להתרבות בשלושה ממדים, ולכן קשה למקם במדויק חלקיקים עמוק בתוך גידולים אלו על ידי טכניקות פולשנית. אנחנו צריכים לנצל את המודל הזה כדי להעריך את ספיגת הנקודות, ליפוזומים הקוונטים, תחמוצת ברזל חלקיקים במספר xenografts הגידול האנושי, המדגיש את פוטנציאל עבור דגם זה להיות מתאים לניתוח vivo של מגוון רחב של ניסוחים nanoparticle.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב שם / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> ביצים מופרות וליבורנו </td><td> המדרגה פריי ג `, סנט ג&#39;ייקובס </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dremel רוטרי כלי </td><td> Dremel </td><td></td><td> אפשר להשתמש בכל דגם </td></tr><tr><td> Dremel גלגלי החיתוך לא. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> ספורטסמן האצ&#39; </td><td> ברי היל </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> ספורטסמן חממה </td><td> ברי היל </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td></td><td></td><td> 70% (כרך / כרך) </td></tr><tr><td> פוליסטירן לשקול סירות </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> כיכר פטרי מנות </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid גומי מיכל עם מכסה </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> חורים שנקדחו לתוך הצדדים </td></tr><tr><td> אנכי פיפטה חולץ </td><td> דוד Kopf מכשירים </td><td> דגם 720 </td><td> הגדרות: 16.3 (דוד) ו - 2.3 (סולנואיד) </td></tr><tr><td> נתרן בורוסיליקט צינורות זכוכית נימי </td><td> סאטר Instrument </td><td> BF100-58-10 </td><td> (OD, 1.0 מ&quot;מ; מזהה 0.58 מ&quot;מ; 10 ס&quot;מ אורך) </td></tr><tr><td> 1X Dulbecco של הנשר השתנה בינוני (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco של </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7.4 </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים (D-PBS) (1X), נוזל </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> טריפסין, 0.05% (1X) עם EDTA 4Na, נוזל </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> מחממים להשבית </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> האוסר מדעי, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Eppendorf דגם 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> פיין נקודות מלקחיים </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603 צינורות </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50 מטר (קוטר פנימי 1/32-inch, קוטר חיצוני 3/32-inch, עובי דופן 1/32-inch </td></tr><tr><td> המזרק מחטים זריקות 18-מד מחטים </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> קופסא של 100 </td></tr><tr><td> 1 מזרקים מ&quot;ל זריקות </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> קופסא של 100 </td></tr><tr><td> סיבים אופטיים מיקרוסקופ המאייר </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V. זרעים unguiculata (קליפורניה שחור עיניים לא. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> צמיחה אורות מקורה </td><td> SunLite, אספקה ​​של הגנן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methyl-PEO4-NHS אסתר </td><td> לנקב </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> MPEG-NHS, PEG succinimidyl אסתר, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 647 חומצה carboxylic (succinimidyl אסתר) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> אורגון גרין 488 אסתר succinimidyl * 6-האיזומר * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfoxide דימתיל (DMSO) </td><td> סיגמא </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibasic monohydrogen פוספט </td><td> סיגמא </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (עבור חיץ phopshate) </td></tr><tr><td> Monobasic dihydrogen פוספט </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (עבור חיץ phopshate) </td></tr><tr><td> Superose 6 גודל הדרה עמודה </td><td> GE Healthcare מדעי החיים </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> אקטע Explorer 100 כרומטוגרף </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> אקטע ערכת תזרים גבוה </td><td> GE Healthcare מדעי החיים </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> סיגמא </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge </tד&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Ti הרוטור </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Swing דלי </td></tr><tr><td> 50.2 Ti הרוטור </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> זווית קבועה </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 יחידות סינון צנטריפוגלי </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa מנותקים </td></tr><tr><td> Gradient לשעבר </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> dextran, והעמסת, 70,000 מגוואט, anionic </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> ספינינג מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal דיסק </td><td> מניין; Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ Epifluorescence רחב בתחום </td><td> מניין; Zeiss Axio בוחן, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD המצלמה </td><td> מניין; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> המתחם טמפרטורה יחידת המיקרוסקופ </td><td> Precision פלסטיקה </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> אבק גריז </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית עגול coverslips לא. 1 (18 מ&quot;מ) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity תוכנה </td><td> פרקין אלמר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צ&#39;יק המתחם העובר </td><td></td><td> מנהג מפוברק </td><td></td></tr><tr><td> עדין מספריים </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> פורמלין </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> השתמש ב fumehood </td></tr><tr><td> חיתוך אופטימלי </td><td> פישר; רקמות Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> טמפרטורה (אוקטובר) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> תבניות פלסטיק </td><td> דיג </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond דבק שקופיות </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך זהב עם DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> להבי פנויה עבור cryostat </td><td> דיג </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> לייקה CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluation of nanoparticle uptake in tumors in real time using intravital imaging

טכנולוגיות הדמיה נוכחית הגידול, כגון אולטראסאונד, MRI, PET ו-CT, אינם מסוגלים להניב תמונות ברזולוציה גבוהה להערכת ספיגת nanoparticle בגידולים ברמה המיקרוסקופית 1,2,3, המדגיש את התועלת של מודל xenograft מתאים שבו לבצע ניתוחים ספיגת מפורט. כאן, אנו משתמשים ברזולוציה גבוהה הדמיה intravital להעריך ספיגת nanoparticle ב xenografts סרטניים אנושיים במודל שונה, העובר פגז פחות עוף. המודל עובר העוף במיוחד היטב מתאים אלה מנתח vivo משום שהוא תומך צמיחה של גידולים אנושיים, הוא זול יחסית ואינו דורש הרדמה או ניתוח 4,5. תאים סרטניים בצורה מלאה xenografts vascularized בתוך 7 ימים, כאשר מושתלים לתוך קרום chorioallantoic (רמ&quot;א) 6. גידולים וכתוצאה מכך הם דמיינו ידי הדמיה לא פולשנית בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה אשר יכול להישמר לתקופה של עד 72 שעות עם מעט השפעה על המארח או מערכות גידול. חלקיקים עם מגוון רחב של גדלים ניסוחים מנוהל דיסטלי אל הגידול ניתן דמיינו לכמת כמו זרימת הם דרך מחזור הדם, extravasate מ vasculature הגידול דולפים, ולצבור באתר הגידול. אנו מתארים כאן את הניתוח של חלקיקים שמקורם וירוס פסיפס Cowpea (CPMV) מעוטרת קרוב אינפרא אדום צבעי ניאון ו / או פולימרים פוליאתילן גליקול (PEG) 7, 8, 9,10,11. עם עירוי לוריד, חלקיקים אלה הם הפנימו במהירות ויראלי ידי לתאי אנדותל, וכתוצאה מכך תיוג גלובלית של vasculature הן מחוץ ובתוך 7,12 הגידול. PEGylation של חלקיקים נגיפיים מגביר פלזמה שלהם זמן מחצית החיים, מרחיב את זמנם במחזור הדם, ובסופו של דבר משפר את הצטברות שלהם בגידולים באמצעות חדירות משופרת (EPR) אצירת אפקט 7, 10,11. השיעור וההיקף של הצטברות של חלקיקים הגידול נמדד לאורך זמן באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. טכניקה זו מספקת שיטה הן לחזות ולכמת הדינמיקה nanoparticle בגידולים אנושיים.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging at JoVE.com

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

אנו מציגים גישה חדשנית לכמת לוקליזציה nanoparticle ב vasculature של גידולים xenografted אנושי באמצעות דינמי, בזמן אמת הדמיה intravital במודל העובר העופות.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

evaluation-nanoparticle-uptake-tumors-real-time-using-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

18.2K Views.  University of Western Ontario. אנו מציגים גישה חדשנית לכמת לוקליזציה nanoparticle ב vasculature של גידולים xenografted אנושי באמצעות דינמי, בזמן אמת הדמיה intravital במודל העובר העופות.

Video: Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Multispectral הדמיה בזמן אמת Fluorescence לגילוי intraoperative של הצומת סנטינל הלימפה גניקולוגיות אונקולוגיה

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

בזמן אמת הדמיה דיגיטלית של אינטראקציה ליקוציט-אנדותל של פגיעה איסכמיה reperfusion (IRI) של השריר Cremaster עכברוש

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

תנועת סבה באמצעות משוב בזמן אמת של ביצועים

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

בעקבות כימותרפיה כלי דם רעילות - בזמן אמת<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של ירידת ערך כלי

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

בזמן אמת Cytotoxicity מבחני בדם כל אדם

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

הדמית רנטגן בזמן אמת של כרכי נוזל ריאות עובריות עכבר ריאות

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

הערכה של ריאות גרורה במודלי גידול עכבר החלב על ידי בזמן אמת כמותי PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...