באמצעות פרוטוקול זה, נדידת תאים ופלישה ניתן לחשוף בתנאים בזמן אמת המאפשר קינטיקה התא תחת אובדן או רווח של תפקוד גנים וסמים להיקבע. שלא כמו שיטות אחרות, אין צורך בכתמים, נזק לתאים מכניים או סמנים פלואורסצנטיים. והכי חשוב, קינטיקה התא בזמן אמת ניתן לקבוע בצורה יעילה.
כאשר תרבות קו התאים U-118MG מגיעה ל- 70 עד 80%,confluency, שטף את התאים עם PBS לפני שתטפל בתאים עם שני מיליליטר של 0.5% טריפסין-EDTA. לאחר 30 שניות ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של מדיום תרבות טרי ולהעביר את התאים מנותקים צינור חרוט 15 מיליליטר. לאחר הספירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש את גלולה בשש פעמים 10 לתאים החמישי לכל ריכוז מצב בנפח המתאים של מדיום טרי.
מעבירים שש פעמים 10 לתאים החמישיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה אחד לכל מצב ומוסיפים 800 מיקרוליטרים של PBS של Dulbecco לכל צינור. לאחר צנטריפוגה, תן שימוש חוזר בכל גלולה ב-60 מיקרוליטרים של מאגר רב-הון R ושישה מיקרומולרים של ה-siRNA של העניין. מערבבים כל צינור עם הקשה עדינה לפני electroporating 10 aliquots microliter של כל מתלה תא עם שלושה 10 אלפיות שנייה 1, 350 פולסים וולט.
לאחר כל טיפול, בריכת התאים electroporated מכל מצב בודד חמישה aliquots מיליליטר של מדיום תרבות טרי. לאחר מכן לזרוע את התאים לתוך שתי מנות תרבות 35 מילימטר לכל מצב ולמקום את התאים בחממה תרבות התא במשך שלושה ימים. חמש עד שש שעות לפני ניתוח התא בזמן אמת, מקם את מערכת ניתוח התאים בזמן אמת בהמה לתרבות התאים.
כדי להקים בדיקה פלישה, להשתמש pipetting הפוך למקם 50 microliters של DMEM בתוספת 0.1 מיקרוגרם למיליליטר של ג'ל מטריצה חוץ תאית לתוך כל באר של התא העליון של צלחת פלישה לתא. מיד לאחר הציפוי, להסיר 30 microliters של פתרון מטריצה חוץ תאית מכל באר ולהמקם את הצלחת לתוך החממה תרבות התא במשך ארבע שעות. כדי להקים תוכנית מדידת מכשולים, שש שעות לפני המדידה, החלף את המדיום בכל תרבות התאים האלקטרופו מדורגים במדיום סרום נמוך.
תחת הכרטיסיה פריסה בתוכנת מדידת ההימנעות המשויכת, בחר בארות מרובעות עבור כל מצב ביולוגי. תחת הכרטיסיה לוח זמנים, הגדר שלב ניקוי של מדידה בסיסית חד-זמנית עם מרווח זמן של דקה אחת והגדר שלב שני למדידת ההימנעות מהתא בעריסה בודדת בהתאמה עבור הניסוי עצמו. שעה לפני תחילת מדידת מבוי סם התא, להוסיף 160 microliters של בינוני בתוספת 10% נסיוב חזיר עוברי כמו chemoattractant לתוך הבארות של התא התחתון של פלישת התא וצלחת הנדידה.
כדי למדוד פלישה, להרכיב את התא העליון המכיל את ג'ל מטריצה חוץ תאי מצופה בארות. כדי למדוד הגירה, השתמש בארות לא צותתות בתא העליון. עבור כל סוג של ניסוי, למלא את בארות בתא העליון עם 50 microliters של מדיום סרום נמוך למקם את התאים לתוך העריסה של המערכת.
לחץ על הכרטיסיה הודעה בתוכנה כדי לקבוע אם כל הבארים מזוהים על-ידי יחידת הבקרה. אם ההודעה מוצגת כצפוי, הלוחית העריסה מוכנה לניסוי. לאחר מכן מניחים את הצלחות הארוזות לחלוטין לתוך החממה לתרבות התאים בעריסה בזמן אמת של מערכת ניתוח התאים למשך שעה כדי להתאקלם בצלחת לתנאי תרבות התאים.
בעוד הלוחות הם שיווי משקל, לקצור את התאים גליובלסטומה כפי שהוכח מחדש את התאים מכל מצב בשמונה פעמים 10 לתאים החמישי לכל 800 microliters של ריכוז בינוני בסרום נמוך. בנוסף, להפריש שלוש פעמים 10 לתאים החמישיים בשני מיליליטר של מדיום תרבות עבור זריעה בצלחת 35 מילימטר לניתוח כתם מערבי במורד הזרם. כדי למדוד את הקריאה הבסיסית לפני ההעברה, בסוף ההתאקלמות, לחץ על לחצן התחל עריסה.
לאחר המדידה הבסיסית נרכשה, להעביר את הנדידה ואת לוחות הפלישה מן עריסה בהתאמה שלהם לתוך ארון biosafety. היפוך פיפטה 100 microliters של תאים לתוך בארות התא העליון מרובע עבור כל מצב ביולוגי הבאר המתאימה של פלישת התא לוחות הגירה כפי מתוכנת ביחידת הבקרה של העריסה. לאחר הזריעה, לשמור את הצלחות בארון biosafety במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים להתיישב באופן שווה על צלחת התחתון לפני העברת הצלחות עריסות בהתאמה שלהם.
לחץ על לחצן התחל עריסה כדי להתחיל למדוד את מבוי סם התא. כדי להמחיש את השינויים בחוסר תום התא כאינדקס התאים באופן תלוי זמן במהלך הניסוי או אחריו, פתח את הכרטיסיה ניתוח נתונים. כדי להמחיש את הנתונים עבור כל אחד מהתנאים המתאימים בנפרד או כממוצעים ו/או סטיות תקן, לחץ על תיבות האפשרויות עבור סטיית תקן ממוצעת.
כדי לייצא את נתוני אינדקס התאים לקובץ גיליון אלקטרוני, מקם את הסמן באמצע חלון ניתוח הנתונים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני. בתיבת הדו-שיח שמופיעה, בחר באפשרות העתק נתונים לתוך תבנית רשימה והדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני פתוח. כדי לשחרר את הניסוי, לחץ על לחצן שחרר בכל עריסה.
נפילת חלבון מתאם Crk מפחיתה את רמות החלבון Crk1 ו- Crk2 ב- 85% ו- 86% בהתאמה מבלי לגרום לרמות חלבון כמו Crk. ההפלה של Crk כמו מפחית ביטוי חלבון דמוי Crk על ידי 85% עם הפחתה קלה ברמות החלבון Crk1 ו- Crk2. שילוב של שני siRNAs מפחית את הביטוי Crk1, Crk2 ו- Crk ב-80%, בעוד שהביטוי של וינקולין ואלפא-טובולין אינו מושפע מכל שילוב של נפילה דמוית קרק או קרק.
תאי גליובלסטומה במוח האנושי נודדים לאורך שיפוע בתגובה לריכוזי סרום גבוהים המגיעים לרמה המרבית של הגירה בשעה 13 שעות. בתאי נוקאאוט של Crk, למרות שהנדידה מתעכבת בתחילה, התאים המשיכו לנדוד עד 23 שעות. נפילה דמוית קרק מפחיתה באופן משמעותי את נדידת התאים כאשר קו התאים גליובלסטומה מאבד לחלוטין את יכולת הנדידה שלהם עם הפלתם של קרק ודומי קרק, מה שמרמז על כך ש-Crk ו-Crk ממלאים תפקידים חופפים חיוניים בנדידת תאים סרטניים.
עם זאת, כאשר פלישת תאים מנוטרת במשך מספר ימים, תאי הנוקאאוט של Crk מגיעים לרמה מקסימלית דומה של פלישה לתאים בהשוואה לתאי גליובלסטומה בשליטה ב-60 שעות עם תאים דמויי קרק המחלימים חלקית את יכולתם הפולשנית ב-90 שעות ותאי Crk-Crk כפולים המדגימים יכולת מופחתת לפלוש לאחר 40 שעות. התוצאות תומכות בבירור בהצעה שיש לנתח פלישת תאים לאורך כל תקופת הניסוי. זריעת המספר הנכון של תאים והימנעות בועות האוויר תוך רישום מטריצה חוץ תאית עבור פלישה assay ותאי זריעה הם נקודות מפתח להצלחת הניסוי הזה.
בעקבות הליך דומה אך באמצעות צלחות אלקטרוניות, הידבקות תאים וקינטיקה התפשטות תאים ניתן לקבוע.
