עבודה זו מומנה על ידי המוסד הלאומי לבריאות הלב, ריאות ודם המכון מענק RO1 HL81248.

1. התרבות של תאים אבי העורקים שור אנדותל (BAEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכניקות אספטיים ראויים היו במעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב בינוני אמבטיה, מים חמים ללא אנטיביוטיקה ב 37 ° C. </li></ol> הערה: בינוני מורכב בינוני פנול חינם שונה Dulbecco של הנשרים (DMEM) עם 4.5 גלוקוז-D גר &#39;/ ל&#39;, 4 מ&quot;מ L-גלוטמין, 1% לא חיוניות חומצות אמינו, בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו - 2.5 מ&quot;ג / ל &#39;צמיחה האנדותל גורם. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את T75 תאים בקבוק שהכיל מן החממה ולנקות את פני השטח של הבקבוק עם אתנול 70% לפני הצבתו בתוך מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום הישן באמצעות aspirator ולשטוף פעמיים עם 5 מ&quot;ל של חיץ פוספט Dulbecco של מי מלח (DPBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של טריפסין ולחכות 4-5 דקות עבור תאים לנתק תוך מעת לעת לבדוק תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של מדיום שוב ושוב מערבבים בעזרת פיפטה כדי לא נפרדהוא התאים וליצור אפילו השעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 מ&quot;ל של מדיום עם טריפסין לצינור 15 מ&quot;ל ו - 121 גרם צנטריפוגות ב 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant באמצעות aspirator. הוסף 5 מ&quot;ל של DPBS ומערבבים היטב. סרכזת ב 121g במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant מחדש להשעות את התא גלולה ידי הוספת 6 מ&quot;ל של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על צלחת 6-היטב, להוסיף 1 מ&quot;ל של תרחיף תאים זה טוב ולאחר מכן להוסיף 1 מ&quot;ל של המדיום. מערבבים את ההשעיה באמצעות פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג את הצלחת דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 2 א. זיהוי של NO עם תא BAEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכניקות אספטיים ראויים היו במעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 6-היטב החממה ואת לשאוב מבאר בינוני 1. שוטפים את התאים פעמיים עם 1 DPBS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 210 של 1.9 mM heptahydrate ברזל סולפט (ב) (4 FeSO 0.7 H 2 O, להכין טרי על ידי המסת 0.8 מ&quot;ג1 DPBS מ&quot;ל עם CaCl 2 ו MgCl 2) ו 210 μl של N-methyl-D-glucamine אמוניום dithiocarbamate (MGD, להכין טרי על ידי המסת 2.7 מ&quot;ג ב -500 DPBS μl עם CaCl 2 ו MgCl 2) באמצעות יחס של 1:07 . (הערה:. זה היחס שבו MGD עודף משמש הועסק כמקובל להכנת Fe 2 +-MGD מורכבת בשל העובדה כי התשואה עבור Fe 3 +-MGD מוגדל בנוכחות MGD עודף תוספת של ascorbate בפתרון לייצב את Fe 2 +-MGD אין צורך מאז 3 NO-Fe +-MGD נוצר מצטמצם endogenously כדי להבחין EPR NO-Fe 2 +-MGD ידי ascorbate, הידרוקינון, או ציסטאין עם יעילות המרה של עד ל 99.9% .. ספין נמוך diamagnetic מדינת Fe 2 + מאפשר איתור של NO באמצעות תאים שטוח או צינור נימי ללא צורך במכשיר בטמפרטורה נמוכה) 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ההשעיה וכתוצאה מכך גם ולהוסיף 4.6 μאני ionophore של סידן (Cai) (מוכן מפתרון מלאי של mM 1.9 ידי המסת 1 מ&quot;ג 1 מ&quot;ל DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון מערבולת שוב דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות על מנת להמשיך לאפשר הפחתה של NO-Fe 3 +-MGD כדי להבחין EPR NO-Fe 2 +-MGD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant (425 μl) בצינור Eppendorf והעברת לתא EPR שטוח (או צינור נימי 50 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים EPR הרכישה הם: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3427 G, אפנון אמפליטודה: 6.0 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 1 x 10 5: כוח מיקרוגל: 10 mW, המספר הכולל של סריקות: 121; זמן סריקה: 10 שניות, וזמן קבוע: 20 ms (הערה: מאז פרמטרים משתנים ממכשיר אחד למשנהו תנאי הניסוי, אם כן, רק את מרכז המגרש, תדירות אפנון משרעת הם הפרמטרים החשובים ביותר שיש להביא בחשבון.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ספקטרום בטמפרטורת החדר ספקטרה 2-D היו integדורג להפחית את רעשי הרקע ואת הבסיס לתקן באמצעות Bruker WinEPR תוכנת עיבוד נתונים או תוכנה אחר לעיבוד נתונים. על כימות של היווצרות adduct, מגרשים סטנדרטיים של ריכוז העוצמה מול אות (או אזור) ניתן לבנות באמצעות SNAP NO התורם. </li></ol> 2B. אינס ניסוי שיחררה את סוגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת 6-היטב החממה ואת לשאוב מבאר בינוני 2 ולשטוף פעמיים עם 1 DPBS מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התורם peroxynitrite, 5-אמינו-3-(4-morpholinyl) -1,2,3-oxadiazolium כלוריד (SIN-1) שימש ניתקת אינס 16. הוסף 100 μl של 0.5 מ&quot;מ Sin-1 (M-R 206.6 g / mol, מפתרון 10 mM המניות מוכן טרי על ידי המסת 1 מ&quot;ג SIN-1 ב 500 μl של PBS עם יוני אין CA / מ&quot;ג) כדי לדלל 2 מ&quot;ל עם DPBS ו 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף פעמיים עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 210 של2.8 מ&quot;מ FeSO 4 0.7 H 2 O ו - μl 210 מ&quot;מ 19.6 MGD מוכן טרי על פי הנוהל הנ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון לערבל ומוסיפים 4.6 μl של צאי mM 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון מערבולת שוב דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 36 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant (425 μl) בצינור Eppendorf והעברת לתא שטוח EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים EPR הרכישה הם: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3427 G, אפנון משרעת: 6 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 1 x 10 5: כוח מיקרוגל: 10 mW, המספר הכולל של סריקות: 121; זמן סריקה: 10 שניות, וזמן קבוע: ms 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את ספקטרום ו ספקטרה 2-D שולבו כדי להפחית את רעשי הרקע ואת הבסיס לתקן כאמור לעיל. </li></ol> 3. זיהוי של O 2 • - מ נויטרופילים Polymorphonuclear (PMNs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נויטרופילים בודדו דגימת דם האדם כפי שתואר קודם לכן 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את פתרון מלאי של 1 M DMPO * ב PBS המכיל 0.1 מ&quot;מ diethylenetriamine-pentaacetic חומצה (DTPA). DMPO יש נקודת התכה של 25-29 מעלות צלזיוס כל כך נוח יותר פיפטה DMPO נוזלי (~ 1.02 גרם / מ&quot;ל צפיפות של 25 מעלות צלזיוס) כדי בקבוקון זכוכית (הערה: אין להשתמש צלוחיות פלסטיק במשקל מאז DMPO טהור מגיב עם פלסטיק). קפוא DMPO ניתן נמס על ידי מים זורמים פושר על הבקבוקון (הערה: לא להפעיל את המים החמים כמו DMPO עלול להתפרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להשתמש טוהר DMPO גבוהה (&gt; 99%) מאז כמה מלכודות ספין זמינים מסחרית מכילים זיהומים פאראמגנטיים, ועל כן, חובה להפעיל מגוון EPR של פתרון פשוט DMPO בלבד (10 מ&quot;מ במקרה זה). זה קריטי, כי אין אות הרקע ניכר (ראה איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) של phorbol-12-myristate אצטט-13 (PMA) ב DMSO. הפוך את aliquots ידי דילול הפתרון מיקרוגרם 10 / מ&quot;ל ​​ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 1.5 מ&quot;ל צינור Eppendorf, להכין את הפתרון עם נפח כולל של 0.6 מ&quot;ל על ידי ביצוע רצף בנוסף: ~~~HEAD=NNS 10 6 תאים לכל מ&quot;ל של PMN, D-גלוקוז (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ואלבומין (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 10 DMPO mM ו 0.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל של PMA. (הערה: PMA הוא activator הרדיקלי יש להוסיף אחרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון לתא שטוח EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EPR רכישה תנאי פרמטרים: תדר מיקרוגל: 9.8 GHz, מרכז המגרש: 3486 G, אפנון אמפליטודה: 0.5 G, רוחב סריקה: 100 גרם; רווח מקלט: 5 X 10 5, המספר הכולל של סריקות: 10, זמן סריקה: 30 שניות ; כוח מיקרוגל: 20 mW, וזמן קבוע: ms 81. על כימות של היווצרות adduct, מגרשים סטנדרטיים של ריכוז העוצמה מול אות (או אזור) ניתן לבנות באמצעות nitroxides יציבים כגון קצב או 3-carboxylic חומצה PROXYL. </li></ol> * הערה חשובה על השימוש DMPO: באמצעות תא שטוחה, ניתן להגדיל את צפיפות התאים ועל ידי כך להגדיל את האותעוצמת adduct ספין אבל מחצית חיים של O 2 • - adduct של DMPO קצר (t 1/2 ~ 1 דק &#39;), אשר מתפרק כדי DMPO-OH. DMPO ניתן להחליף באמצעות ריכוזים של אותו EMPO, BMPO או DEPMPO אשר זמינים מסחרית ליציבות adduct מוגברת עם T 1/2 ~ 8 ו - 14 דקות, בהתאמה. 4. נציג תוצאות ספין לכידה של NO הרדיקלי בוצעה באמצעות Fe 2 +-MGD. איור 2a ו-2b להראות שום סימן EPR מ Fe 2 +-MGD או תערובת של Fe 2 +-MGD עם קאי, המציין כי אין אות NO רקע מקורו ריאגנטים אלה. BAEC על גירוי עם צאי משחרר NO אשר מגיב עם Fe 2 +-MGD ליצירת adduct ספין, NO-Fe 2 +-MGD, ומראה אות שלישיה אופיינית עם פיצול הערך hyperfine (hfsc) קבוע של 12.66 = N ו - G G-גורם של G = 2.040. (איור 2 ג). HFערך SC נקבע באמצעות תוכנת סימולציה WINSIM שניתן להורדה באתר NIEHS EPR מסד נתונים תוכנה. Hfsc הניסוי עולה בקנה אחד עם הערך בספרות של N = 12.70 G ו-G = 2.041 18 עבור NO-Fe 2 +-MGD adduct. כמו כן, ההשפעה של SIN-1 על BAEC הוריד את ייצור NO בשל אינס קשירה והתרה כפי שמוצג באיור 2 ד. מלכודת DMPO ספין שימש O 2 • - זיהוי. DMPO לבד לא נתן אות כפי שמוצג באיור 3 א המאשרת כי במלכודת הספין הוא ללא זיהומים פאראמגנטיים. איור 3 ב הוא הספקטרום של DMPO ו PMNs בלבד, כמו כן, אין כל סימן לזיהוי המצביע על כך DMPO אינו גורם הפעלת האנזים NADPH אוקסידאז. איור 3 ג מראה את האות EPR שנצפה על ידי גירוי של PMN PMA. הערכים hfsc לאות זה נקבעו להיות N = 14.71 G, A &amp;בטא;-H = 11.40 G ​​ו-H γ = 1.25 G, עולים בקנה אחד עם ערכי הספרות של N = 14.3 G, β-H = 11.7 G ו-H γ = 1.3 גרם 19 עבור DMPO-O 2 H adduct. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תרשים זרימה לצורך זיהוי של רדיקלים של נויטרופילים BAEC באמצעות השמנה ספין EPR. (א) PMNs היו מעורבים עם DMPO ו PMA, ואת התערובת וכתוצאה מכך הועבר לתא שטוח EPR לרכישת נתונים. (ב) BAEC גדלו על צלחת, ושטפה עם DPBS. מלכודת ספין פה (MGD) 2 נוספה יחד עם קאי. הפתרון היה מעורב באופן יסודי מודגרות. תערובת הועבר לתא שטוח EPR לרכישת נתונים EPR. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור EPR זיהוי של NO מ-BAEC. (א) ספקטרום של Fe 2 +-MGD רק (ב) ספקטרום של Fe 2 + +-MGD צאי בלבד. (ג) קשת שלישיה כתוצאה השמנה NO על ידי Fe 2 +-MGD באמצעות צאי, גירוי התאים. (ד) ספקטרום מראה ירידה בייצור NO בשל 0.5 מ&quot;מ SIN-1 טיפול של תאים. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="איור 3" /> 3. איור EPR זיהוי של DMPO-O 2 H מ נויטרופילים הופעלו. (א) ספקטרום של DMPO 10 מ&quot;מ בלבד. (ב) ספקטרום של PMN לבד בנוכחות DMPO 10 מ&quot;מ. (ג) ספקטרום של PMN מופעל על ידי PMA בנוכחות DMPO 10 מ&quot;מ.

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconciling+the+chemistry+and+biology+of+reactive+oxygen+species.">Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).</li><li>Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+chemistry+and+specificity+in+redox+signaling.">Thiol chemistry and specificity in redox signaling.</a> Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).</li><li>Clerch, L. B., Massaro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. , (1997).</li><li>Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants:+Molecules,+medicines,+and+myths.">Antioxidants: Molecules, medicines, and myths.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).</li><li>Sumimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+regulation+and+evolution+of+Nox-family+NADPH+oxidases+that+produce+reactive+oxygen+species.">Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species.</a> FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).</li><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , (2009).</li><li>Moreau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alkyl-+and+arylguanidines+on+the+stability+and+reactivity+of+inducible+NOS+heme-dioxygen+complexes.">Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes.</a> Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).</li><li>Vasquez-Vivar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+generation+by+endothelial+nitric+oxide+synthase:+the+influence+of+cofactors.">Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).</li><li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+by+EPR+spin+trapping.">Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping.</a> Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).</li><li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+trapping+of+superoxide+and+hydroxyl+radical:+practical+aspects.">Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects.</a> Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).</li><li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+(DEPMPO):+a+new+phosphorylated+nitrone+for+the+efficient+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals.">5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).</li><li>Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide:+Evaluation+of+the+spin+trapping+properties.">2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties.</a> Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).</li><li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+trapping+and+spin+adduct+decay+of+5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+(BocMPO):+kinetics+and+theoretical+analysis.">Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).</li><li>Tsuchiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide-forming+reactions+of+the+water-soluble+nitric+oxide+spin-trapping+agent,+MGD.">Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD.</a> Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).</li><li>Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+iron-dithiocarbamates+ensure+detection+of+nitric+oxide+in+cells+and+tissues.">Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues.</a> Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).</li><li>RojasWahl, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decomposition+mechanism+of+3-N-morpholinosydnonimine+(SIN-1):+A+density+functional+study+on+intrinsic+structures+and+reactivities.">Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities.</a> J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).</li><li>Klempner, M. S., Gallin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+functional+characterization+of+human+neutrophil+subpopulations.">Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations.</a> Blood. 51, 659-669 (1978).</li><li>Pou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+trapping+of+nitric+oxide+by+ferro-chelates:+kinetic+and+in+vivo+pharmacokinetic+studies.">Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).</li><li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+trapping.+Kinetics+of+the+reaction+of+superoxide+and+hydroxyl+radicals+with+nitrones.">Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones.</a> J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).</li><li>Britigan, B. E., Rosen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin-trapping+and+human+neutrophils.+Limits+of+detection+of+hydroxyl+radical.">Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical.</a> J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).</li><li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide:+A+new+efficient+phosphorylated+nitrone+for+the+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals.">5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).</li><li>Snyrychova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+sensitivity+of+EPR+spin+trapping+in+biological+systems+by+cyclodextrins:+A+model+study+with+thylakoids+and+photosystem+II+particles.">Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles.</a> Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+beta-cyclodextrin+cyclic-nitrone+conjugate:+Synthesis+and+spin+trapping+studies.">Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies.</a> J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).</li><li>Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+spin+trapping+properties+by+beta-cyclodextrin-cyclic+nitrone+conjugate.">Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate.</a> J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).</li><li>Hardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization,+and+decay+kinetics+of+ROS+and+thiyl+adducts+of+mito-DEPMPO+spin+trap.">Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap.</a> Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).</li><li>Kim, S. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+reactivity+of+a+cyclic+nitrone-calix[4]pyrrole+conjugate+with+superoxide+radical+anion:+Theoretical+and+experimental+studies.">Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

השמנה EPR ספין כבר המועסקים במגוון רחב של יישומים ביו לכימות וזיהוי רדיקלים חופשיים. השמנה ספין הוא רגיש במיוחד, מסוגל לאתר רדיקלים בריכוזים הנעים בין ננומטר ל מיקרומטר ובכך מתאים ליישום במערכות ביולוגיות. היווצרות adduct פאראמגנטיים, NO-Fe 2 +-MGD, הוא הבסיס של זיהוי ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (לא חובה) </td></tr><tr><td> פנול בינוני ללא DMEM גלוקוז גבוה 1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> ממ ללא חומצות האמינו החיוניות </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> אטלנטה ביולוגיות </td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td> צמיחה האנדותל גורם </td><td> Millipore </td><td> 02-102 </td><td></td></tr><tr><td> צאי </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> A-23187 </td><td> להמיס DMSO </td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td> Dojindo מעבדות </td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td> FeSO 4 0.7 H 2 O </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 215422-250 גרם </td><td> להמיס PBS עם Ca ו Mg </td></tr><tr><td> MGD </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> ALX-400-014-M050 </td><td> להמיס PBS עם Ca 2 + ו - Mg 2 + </td></tr><tr><td> BAEC תאים </td><td> מערכות תא </td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS עם CaCl 2 ו MgCl 2 </td><td> סיגמאldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol-myristate אצטט (PMA) </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> 79346-במינון של 1 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of nitric oxide and superoxide radical anion by electron paramagnetic resonance spectroscopy from cells using spin traps

חנקן מגיב / מינים חמצן (ROS / RNS) בריכוזים נמוכים יש תפקיד חשוב בוויסות תפקוד התא, איתות, ואת התגובה החיסונית, אך בריכוזים לא מוסדרים ופוגעים כדאיות התא 1, 2. בעוד מערכות החיים התפתחו עם מנגנוני ההגנה אנדוגני נוגדי חמצון תזונתיים להסדרת ROS דור, ROS מיוצרים ללא הרף טבעי תוצרי לוואי של חילוף החומרים הנורמלי של חמצן יכול לגרום נזק חמצוני ביומולקולות וכתוצאה מכך אובדן תפקוד החלבון, מחשוף ה-DNA, או שומנים בדם peroxidation 3, ובסופו של דבר סטרס חמצוני שמוביל לפציעה או מוות התא 4. אניון קיצוני superoxide (O 2 • -) הוא המבשר העיקרי של כמה מינים ביותר ביותר חמצון הידועים קיימות במערכות ביולוגיות כגון peroxynitrite ו הידרוקסיל הרדיקלי. דור של O 2 • - מסמל הסימן הראשון של פרץ חמצוני, ולכן, אניTS ו איתור / או התפיסה במערכות ביולוגיות חשוב. בהפגנה זו, O 2 • - נוצר מ נויטרופילים polymorphonuclear (PMNs). באמצעות גירוי chemotactic עם phorbol-12-myristate אצטט-13 (PMA), PMN מייצר O 2 • - באמצעות הפעלת nicotinamide אדנין מונואמין פוספט (NADPH) dinucleotide 5. תחמוצת החנקן (NO) synthase אשר מגיע בשלושה isoforms, כמו מושרה-, עצבי ו-האנדותל-NOS, או אינוס, nNOS או אינס, בהתאמה, מזרז את ההמרה של L-ארגינין ל L-Citrulline, באמצעות NADPH לייצר NO 6 . הנה, אנחנו שנוצר NO מתאי אנדותל. בתנאי סטרס חמצוני, אינס למשל יכול לעבור מייצור אין O 2 • - בתהליך הנקרא שיחררה את סוגר, אשר ככל הנראה נגרם על ידי חמצון של heme 7 או שיתוף גורם, tetrahydrobiopterin (BH 4) 8. יש רק מעטיםשיטות אמינות לגילוי של רדיקלים חופשיים במערכות ביולוגיות, אלא מוגבלים על ידי סגוליות ורגישות. השמנה ספין משמש בדרך כלל לצורך זיהוי של רדיקלים חופשיים כרוך התגובה תוספת של קיצוני במלכודת הספין ויוצרים adduct ספין מתמשך, אשר ניתן לאתרם באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה אלקטרונים (EPR) פאראמגנטיים. את adducts קיצוניים שונים מציגים מגוון ייחודי אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות את הרדיקלים הנוצרים והוא יכול לספק מידע רב על הטבע ועל קינטיקה של ייצור רדיקלי 9. Nitrones את מוט ההיגוי, 5,5-דימתיל-pyrroline-N-אוקסיד, DMPO 10, DEPMPO phosphoryl-להחליף 11, אסתר, להחליף, EMPO 12 ו BMPO 13, היה בשימוש זמן רב כמו מלכודות ספין - הספין האחרון מלכודות להציג עוד מחצית חיים של O 2 • - adduct. ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) 2 &lt;/&gt; תת הוא נפוץ ללכוד NO בשל שיעור גבוה של היווצרות adduct ויציבות גבוהה של adduct ספין 14.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps at JoVE.com

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הועסק לזהות תחמוצת החנקן מתאי אנדותל העורקים שור ו אניון קיצוני superoxide של נויטרופילים האדם באמצעות ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD)<sub&gt; 2</sub&gt; ו - 5,5-דימתיל-1-pyroroline-N-אוקסיד, DMPO, בהתאמה.

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

detection-nitric-oxide-superoxide-radical-anion-electron-paramagnetic

Research

JoVE Journal

Biology

18.8K Views.  The Ohio State University. פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה (EPR) ספקטרוסקופיה הועסק לזהות תחמוצת החנקן מתאי אנדותל העורקים שור ו אניון קיצוני superoxide של נויטרופילים האדם באמצעות ברזל (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) 2 ו - 5,5-דימתיל-1-pyroroline-N-אוקסיד, DMPO, בהתאמה.

Video: Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in understanding the role of mitochondrial function in obesity, diabetes, aging, cancer, cardiovascular function and safety toxicity.
Cellular metabolism is the process of substrate uptake, such as oxygen, glucose, fatty acids, and glutamine, and subsequent energy conversion through a series of enzymatically controlled oxidation and reduction reactions. These intracellular biochemical reactions result in the production of ATP, the release of heat and chemical byproducts, such as lactate and CO2 into the extracellular environment.
Valuable insight into the physiological state of cells, and the alteration of the state of those cells, can be gained through measuring the rate of oxygen consumed by the cells, an indicator of mitochondrial respiration - the Oxygen Consumption Rate - or OCR. Cells also generate ATP through glycolysis, i.e.: the conversion of glucose to lactate, independent of oxygen. In cultured wells, lactate is the primary source of protons. Measuring the lactic acid produced indirectly via protons released into the extracellular medium surrounding the cells, which causes acidification of the medium provides the Extra-Cellular Acidification Rate - or ECAR.
In this experiment, C2C12 myoblast cells are seeded at a given density in Seahorse cell culture plates. The basal oxygen consumption (OCR) and extracellular acidification (ECAR) rates are measured to establish baseline rates. The cells are then metabolically perturbed by three additions of different compounds (in succession) that shift the bioenergetic profile of the cell.
This assay is derived from a classic experiment to assess mitochondria and serves as a framework with which to build more complex experiments aimed at understanding both physiologic and pathophysiologic function of mitochondria and to predict the ability of cells to respond to stress and/or insults.

A description of a method for profiling mitochondrial function in cells is provided. The mitochondrial profile generated provides four parameters of mitochondrial function that can be measured in one experiment: basal respiration rate, ATP-linked respiration, proton leak, and reserve capacity.

פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each other at the biochemical level1. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is one of several technologies, including gas chromatography&#x2013;mass spectrometry (GC-MS), with considerable promise for such studies. Advantages of NMR are that it is suitable for untargeted analyses, provides structural information and spectra can be queried in quantitative and statistical manners against recently available databases of individual metabolite spectra2,3. In addition, NMR spectral data can be combined with data from other omics levels (e.g. transcriptomics, genomics) to provide a more comprehensive understanding of the physiological responses of taxa to each other and the environment4,5,6. However, NMR is less sensitive than other metabolomic techniques, making it difficult to apply to natural microbial systems where sample populations can be low-density and metabolite concentrations low compared to metabolites from well-defined and readily extractable sources such as whole tissues, biofluids or cell-cultures. Consequently, the few direct environmental metabolomic studies of microbes performed to date have been limited to culture-based or easily defined high-density ecosystems such as host-symbiont systems, constructed co-cultures or manipulations of the gut environment where stable isotope labeling can be additionally used to enhance NMR signals7,8,9,10,11,12. Methods that facilitate the concentration and collection of environmental metabolites at concentrations suitable for NMR are lacking. Since recent attention has been given to the environmental metabolomics of organisms within the aquatic environment, where much of the energy and material flow is mediated by the planktonic community13,14, we have developed a method for the concentration and extraction of whole-community metabolites from planktonic microbial systems by filtration. Commercially available hydrophilic poly-1,1-difluoroethene (PVDF) filters are specially treated to completely remove extractables, which can otherwise appear as contaminants in subsequent analyses. These treated filters are then used to filter environmental or experimental samples of interest. Filters containing the wet sample material are lyophilized and aqueous-soluble metabolites are extracted directly for conventional NMR spectroscopy using a standardized potassium phosphate extraction buffer2. Data derived from these methods can be analyzed statistically to identify meaningful patterns, or integrated with other omics levels for comprehensive understanding of community and ecosystem function.

A method for metabolite extraction from microbial planktonic communities is presented. Whole community sampling is achieved by filtration onto specially prepared filters. After lyophilization, aqueous-soluble metabolites are extracted. This approach allows for application of environmental metabolomics to trans-omics investigations of natural or experimental microbial communities.

ריכוז מטבוליטים של צפיפות נמוכה עבור קהילות Planktonic metabolomics הסביבה באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into nitrite and nitrate by interactions with various oxy-heme proteins and other still not well known pathways. The reverse process, reduction of nitrite and nitrate into NO had been discovered in mammals in the last decade and it is gaining attention as one of the possible pathways to either prevent or ease a whole range of cardiovascular, metabolic and muscular disorders that are thought to be associated with decreased levels of NO. It is therefore important to estimate the amount of NO and its metabolites in different body compartments &#8212; blood, body fluids and the various tissues. Blood, due to its easy accessibility, is the preferred compartment used for estimation of NO metabolites. Due to its short lifetime (few milliseconds) and low sub-nanomolar concentration, direct reliable measurements of blood NO in vivo present great technical difficulties. Thus NO availability is usually estimated based on the amount of its oxidation products, nitrite and nitrate. These two metabolites are always measured separately. There are several well established methods to determine their concentrations in biological fluids and tissues. Here we present a protocol for chemiluminescence method (CL), based on spectrophotometrical detection of NO after nitrite or nitrate reduction by tri-iodide or vanadium(III) chloride solutions, respectively. The sensitivity for nitrite and nitrate detection is in low nanomolar range, which sets CL as the most sensitive method currently available to determine changes in NO metabolic pathways. We explain in detail how to prepare samples from biological fluids and tissues in order to preserve original amounts of nitrite and nitrate present at the time of collection and how to determine their respective amounts in samples. Limitations of the CL technique are also explained.

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

מדידת הניטריט ו חנקתי, מטבוליטים במסלול תחמוצת החנקן, חומרים ביולוגיים באמצעות שיטה chemiluminescence

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

יישום של תחמוצת החנקן פלורסנט מקודדים גנטית (NO •) בדיקות, את geNOps, הדמיה בזמן אמת של אותות NO • ב תאים בודדים

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...