עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הקנדי מחקר (CIHR), משפחת טאונסנד, וג&#39;ק בראון מחקר משפחה אלצהיימר קרן (אליו היה). הוא היה בעל הקתדרה למחקר בקנדה מחלת אלצהיימר. PTTL נתמך על ידי למדעי הטבע יועצת הנדסה מחקר סמית מיכאל קרן מלגות מחקר בריאות.

1. קיבוע של מוח העכבר cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכברים הטרנסגניים מוקרבים באמצעות גז דו תחמוצת הפחמן, ואחריו עריפת ראש והמוח חילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא גזור longitudinally במרכז. מחצית המוח יהיה פלאש קפוא על קרח יבש לניתוח ביוכימיים. השני יהיה שקוע paraformaldehyde 4% (PFA) במשך לפחות 48 שעות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע PFA ב -4% במשך לפחות 48 שעות, המוח חמי מועבר ישירות לתוך תמיסה סוכרוז 30% והניח על 4 ° C. בשלב מסוים, המוח צריך להיות חמי צף הפתרון סוכרוז. כאשר המוח חמי שקעו לקרקעית, בדרך כלל המחייב 48 שעות, הוא מוכן להיות מוטבע אוקטובר עבור cryosectioning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני cryosectioning, הר שכבה דקה של אוקטובר על הידית ולאפשר להקפיא ב -20 ° C. הסר את המוח הקטן משאר המוח חמי מקום על גבי שכבה של אוקטובר קפוא. מיד לכסות את המוח עם חמי אוקטובר ולאפשר לאט להקפיא ב -20 ° C. לאחר הטבעה אוקטובר המוח הפך אטום, הוא מוכן להיות מחולק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את העובי של כל מקטע עד 30 מיקרומטר. איסוף כל פרוסה לתוך מיכל עם פתרון Olomos ד. </li></ol> 2. הליך אימונוהיסטוכימיה עבור הפלאק מדלקת עצבים (סעיפים צף חינם) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו כל הקטע חומצה פורמית 88% במשך 15 דקות. לאחר הטיפול חומצה פורמית, הסעיף באופן זמני להפוך אטום עשוי להופיע להתכווץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל חלק לתוך צלחת לשטוף עם TX-PBS (0.3% Triton X-100 ב PBS) במשך 5 דקות X 3 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החומר המחמצן אנדוגני בלוק חוסם 0.5% H 2 O 2 ב TX-PBS, RT 30 דקות עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם סעיף TX-PBS למשך 10 דקות X 3 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם סעיף 5% חלב דל שומן ללא שומן מומס TX-PBS בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מקטעים נוגדן ראשוני (Biotinylated 4G8, 1:500-1:2000, חותם) מדולל TX-PBS המכיל 5% חלב ב 4 ° C לילה עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם סעיף TX-PBS למשך 10 דקות X 3 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פרוטוקול היצרן ABC הפתרון הבא של (עלית ABC, וקטור מעבדות). דגירה סעיפים בתערובת ABC למשך 30 דקות עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם סעיף TX-PBS למשך 10 דקות X 3 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (Vector Laboratories) פרוטוקול היצרן הבא. דגירה סעיפים בתערובת DAB עבור 50-10 דקות. בשלב זה, תוכלו לצפות בצבע חום לפתח על כל קטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם סעיף TX-PBS למשך 10 דקות X 3 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Free-צפים חלקים במוח הם רכובים על שקופיות מצופה ג&#39;לטין, כדי לעזור עם הידבקות רקמות. מדורים מכן הם מיובשים באוויר ואחריו ניקוי עם סדרה של קסילן רכוב Entellen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוחות הם דמיינו תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של 40X הם לכמת על ידי בחינה של מספר לוחית מתכוון לכל פרוסה על כל עכבר. </li></ol> 3. Thioflavin S מכתים הליך זיהוי של הפלאק מדלקת עצבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכבר מיצוי הליך המוח כפי שצוין בסעיפים 1.1-1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 4-5 סעיפים חמי המוח לשקופית כוס ולאפשר לחלוטין האוויר היבש לפני מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות עם אתנול 70% למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות עם אתנול 80% למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות פתרון מסוננים (0.2 מיקרומטר מסנן) S thioflavin (1% ב 80% אתנול) במשך 15 דקות. (פתרון S Thioflavin צריך להיות מסוננים לפני כל שימוש). הערה: להגן thioflavin S מן האור ולהגן שקופיות מוכתמים מן האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות עם אתנול 80% למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם שקופיות דקה 70% אתנול 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים מזוקקים פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות הר בתקשורת הרכבה מימית ולאפשר שקופיות יבש בחושך לפחות 2 שעה, ואחריו coverslip איטום עם לק ברור. קטעים ויטראז יש לאחסן בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלאק ירוק מוכתם הקרינה יכולה להיות דמיינו עם microscropy ניאון. ניתוח שקופיות בתוך שבוע כי מכתים את ידהו עם הזמן. </li></ol> 4. נציג תוצאות במחקר האחרונות שלנו על היעילות של תרופה אנטי אפילפטית לבין מייצב מצב רוח חומצה ולפרואית (VPA) לעכב היווצרות הפלאק מדלקת עצבים, השתמשנו immunostaining שתואר לעיל thioflavin S מכתים נהלים כדי לזהות פלאק מדלקת עצבים במודל עכברי אלצהיימר (3). איור 1 מייצג טיפוסי בן 9 חודש APP23 עכבר מהונדס, מוכתם אנטי Aβ 4G8 biotinylated שימוש ו לאתר באמצעות שיטת ה-ABC. הפלאק מדלקת עצבים מסומנים בבירור עם הנוגדן ו מסומנים על ידי החצים הלבנים. שימוש מכתים S thioflavin, זיהינו בתצהיר פלאק מדלקת עצבים 2 בן חודש APP23xPS transgenic עכברים (איור 2). Aβ המכילים מחויב S Thioflavin הפלאק מדלקת עצבים מופיע תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק (מסומנת בחצים לבנים). הראינו כי עם טיפול VPA, היווצרות הפלאק מדלקת עצבים מצטמצם משמעותית (3). במחקר אחר, למדנו היפוקסיה הקישור המולקולריים שבבסיס הפתוגנזה ו לספירה. שוב, הן באמצעות מכתים 4G8 אנטי Aβ אימונוהיסטוכימיה ו מכתים S thioflavin, מצאנו היפוקסיה שאפשרו את היווצרות הפלאק Aβ המכיל מדלקת עצבים (4). <img src="/files/ftp_upload/2831/2831fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. ניתוח immunohistochemical של היווצרות הפלאק מדלקת עצבים בעכברים הטרנסגניים לספירה. APP23 עכברים בגיל 9 חודשים הוקרבו והיו גזור, קבוע, מחולק. הפלאק מדלקת עצבים ב בהיפוקמפוס התגלו באמצעות 4G8 אנטי Aβ נוגדן ו פותחו תוך שימוש בשיטות ABC ו-DAB. הפלאק היו דמיינו ידי מיקרוסקופ אור עם 40X. החצים הלבנים הצבע הפלאק מדלקת עצבים Aβ. <img src="/files/ftp_upload/2831/2831fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. מכתים S Thioflavin של הפלאק מדלקת עצבים בעכברים לספירה הדגם. APP23xPS45 העכברים הטרנסגניים כפול 8 שבועות הוקרבו והיו גזור, קבוע, מחולק. המכות מדלקת עצבים ב בהיפוקמפוס הם אושרו באמצעות מכתים פלורסנט S thioflavin ו דמיינו ידי מיקרוסקופית בהגדלה של 40X. החצים מצביעים על הפלאק הלבן מוכתם S thioflavin מדלקת עצבים.

<ol>
	<li>Glenner, G. G., Wong, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease:+initial+report+of+the+purification+and+characterization+of+a+novel+cerebrovascular+amyloid+protein.">Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).</li><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer's+disease:+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics.">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li><li>Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid+inhibits+Abeta+production,+neuritic+plaque+formation,+and+behavioral+deficits+in+Alzheimer's+disease+mouse+models.">Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models.</a> J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).</li><li>Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+facilitates+Alzheimer's+disease+pathogenesis+by+up-regulating+BACE1+gene+expression.">Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).</li></ol>

כל הניסויים נערכו בהתאם מאוניברסיטת קולומביה Animal Care הבריטית ועדה השימוש והנחיות CIHR.

אימונוהיסטוכימיה באמצעות biotinylated כתמים שכותרתו נוגדן 4G8 הפלאק מדלקת עצבים לספירה מודל עכברים עם סגוליות. התוצאה מכתים מאפשרת כימות והשוואה של עומס פלאק בין קבוצות הטיפול השונות. ישנם צעדים מכריעים שיכולים להשפיע על התוצאה. מכיוון שכל חמי אינם perfused לפני מיצוי מהגולגולת, טיפול אמור לשמש במהלך תהליך החילוץ, כדי למנוע נזק למוח חמי. יתר על כן, מאחר שהמוח הוא חמי perfused פסיבי, אנו ממליצים דוגרים אותו PFA 4% עבור 48 שעות לפחות ב 4 ° C לפני הצללה בפתרון סוכרוז 30%. לחלופין, זלוף transcardial יכול להיעשות לפני לחילוץ המוח. אם המוח הוא קבוע כראוי, זה צריך להיות מרקם צמיגי. במקרה שבו המוח אינו קבוע כהלכה, קטעי יהיה בקלות לקרוע בפתרון ד Olomos או במהלך ההליכים מכתים. נוגדן חד שבטי 4G8 היא תגובתי שאריות חומצת אמינו 17-24 של Aβ והכיר epitope ברצף הליבה (VFFAE). מאז 4G8 נגזר מינים העכבר, הוא נוטה לתת מכתים רקע גבוהה יותר. לפיכך, בחרנו דגירה בסעיפים בדילול המצוין עם שיקולים להשגת אות נכון, תוך מזעור מכתים רקע. בנוסף immunostaining לאיתור פלאק מדלקת עצבים באמצעות נוגדן 4G8, שיטה מכתים S thioflavin משמש גם כדי לזהות את הפלאק. Thioflavin S הוא תערובת הומוגנית לצבוע הנובעת מתילציה של dehydrothiotoluidine עם חומצה sulfonic. Thioflavin S הלא סלקטיבי נקשר תוכן גיליון בטא של חלבונים, כגון אלה oligomers עמילואיד. לאחר מחייב, thioflavin עובר שינוי כחול אופייני של ספקטרום הפליטה שלו. לעומת זאת מחייב S thioflavin לצורות monomeric לא לעורר שינוי כחול ולא ניתן היה לזהות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מכתים S Thioflavin מספק אלטרנטיבה מהירה המסך עמילואיד כמו עוצמת הקרינה מאפשר ראיה טובה של כמויות קטנות של משקעים עמילואידיים. עם זאת, חיסרון אחד על מכתים S thioflavin היא חוסר ייחוד. רבים מרכיבים רקמות אחרות המכילות כולל הסדינים בטא נרחב, כגון fibrinoids, hyaline, קרטין, וכו &#39;, יש זיקה ולא עבור צבע זה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב וציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P6148-1 ק&quot;ג </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidene </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> PVP40-100 גרם </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> S5-3 </td></tr><tr><td> אתילן גליקול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 324558-2L </td></tr><tr><td> רקמות-Tek מתחם אוקטובר </td><td> סאקורה </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> חומצה פורמית 88% </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> A118P-500 </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td> 807426 </td></tr><tr><td> H2O2 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> H-1009 </td></tr><tr><td> ביוטין תווית 4G8 נוגדן </td><td> Cedarlane </td><td> SIG-39240-500 </td></tr><tr><td> עלית ABC ערכת </td><td> וקטור </td><td> PK-6100 </td></tr><tr><td> Imm PACT DAB </td><td> וקטור </td><td> SK-4105 </td></tr><tr><td> קסילן </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> X4-4 </td></tr><tr><td> Entellan </td><td> א.מ. מדע </td><td> 65037-71 </td></tr><tr><td> Superfrost * Plus שקופיות מיקרוסקופ </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> לייקה </td><td> CM-3050-S </td></tr><tr><td> MX35 פרמייר microtome להב </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3052835 </td></tr><tr><td> Thioflavin S </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T1892-25 גרם </td></tr></tbody></table>

detection of neuritic plaques in alzheimer's disease mouse model

מחלת אלצהיימר (AD) הינה ההפרעה השכיחה ביותר ניווניות המוביל לדימנציה. היווצרות הפלאק מדלקת עצבים הוא אחד מסימני ההיכר הפתולוגי של מחלת אלצהיימר. המרכיב המרכזי של הפלאק מדלקת עצבים הוא חלבון קטן המכונה אמילואיד β פילמנטיות חלבון (Aβ) 1, אשר נגזר מחשוף proteolytic רציפים של החלבון בטא עמילואיד המבשר (APP) על ידי secretase-β ו - γ-secretase. ההשערה עמילואיד כרוך כי Aγ המכילים הפלאק כמנגנון רעילים הבסיסית לספירה הפתולוגיה 2. ניתוח שלאחר המוות של נוכחות של פלאק מדלקת עצבים מאשרת את האבחנה של א&quot;ד. כדי לקדם את ההבנה שלנו של Aγ לנוירוביולוגיה בפתוגנזה לספירה, עכבר זנים שונים להביע את AD-הקשורים מוטציות בגנים APP האדם נוצרו. בהתאם לחומרת המחלה, עכברים אלו יפתחו הפלאק מדלקת עצבים בגילאים שונים. עכברים אלה משמשים כלי רב ערך לחקר התפתחות בפתוגנזה סמים העלולים להשפיע על עיבוד APP מסלול ורובד היווצרות מדלקת עצבים. בפרוטוקול זה, אנחנו מעסיקים immunohistochemical שיטה לגילוי ספציפי של הפלאק מדלקת עצבים בעכברים מודל AD. אנו במיוחד לדון הכנה לחילוץ מן המוח וחצי, קיבעון paraformaldehyde, cryosectioning, ואת שתי שיטות לאיתור פלאק נוירוטי בעכברים הטרנסגניים לספירה: זיהוי immunohistochemical באמצעות ABC ו-DAB שיטת זיהוי פלורסנט באמצעות שיטת מכתים S thiofalvin.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model at JoVE.com

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

אחד המאפיינים הפתולוגיים של אלצהיימר היא היווצרות של חלבון הפלאק עמילואיד β חיובי מדלקת עצבים. בפרוטוקול זה נתאר שתי שיטות לאיתור פלאק מדלקת עצבים בעכברים הטרנסגניים מודל AD: זיהוי immunohistochemical באמצעות ABC ו-DAB שיטת זיהוי פלורסנט באמצעות שיטת מכתים S thioflavin.

איתור של הפלאק מדלקת עצבים במודל מחלת אלצהיימר עכבר

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

detection-of-neuritic-plaques-in-alzheimer-s-disease-mouse-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

36.4K Views.  The University of British Columbia. אחד המאפיינים הפתולוגיים של אלצהיימר היא היווצרות של חלבון הפלאק עמילואיד β חיובי מדלקת עצבים. בפרוטוקול זה נתאר שתי שיטות לאיתור פלאק מדלקת עצבים בעכברים הטרנסגניים מודל AD: זיהוי immunohistochemical באמצעות ABC ו-DAB שיטת זיהוי פלורסנט באמצעות שיטת מכתים S thioflavin.

Video: Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis difficult1. Definite AD diagnosis is achieved only postmortem, thus establishing presymptomatic, early diagnosis of AD is crucial for developing and administering effective therapies2,3.
Amyloid &beta;-protein (A&beta;) is central to AD pathogenesis. Soluble, oligomeric A&beta; assemblies are believed to affect neurotoxicity underlying synaptic dysfunction and neuron loss in AD4,5. Various forms of soluble A&beta; assemblies have been described, however, their interrelationships and relevance to AD etiology and pathogenesis are complex and not well understood6. Specific molecular recognition tools may unravel the relationships amongst A&beta; assemblies and facilitate detection and characterization of these assemblies early in the disease course before symptoms emerge. Molecular recognition commonly relies on antibodies. However, an alternative class of molecular recognition tools, aptamers, offers important advantages relative to antibodies7,8. Aptamers are oligonucleotides generated by in-vitro selection: systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)9,10. SELEX is an iterative process that, similar to Darwinian evolution, allows selection, amplification, enrichment, and perpetuation of a property, e.g., avid, specific, ligand binding (aptamers) or catalytic activity (ribozymes and DNAzymes).
Despite emergence of aptamers as tools in modern biotechnology and medicine11, they have been underutilized in the amyloid field. Few RNA or ssDNA aptamers have been selected against various forms of prion proteins (PrP)12-16. An RNA aptamer generated against recombinant bovine PrP was shown to recognize bovine PrP-&beta;17, a soluble, oligomeric, &beta;-sheet-rich conformational variant of full-length PrP that forms amyloid fibrils18. Aptamers generated using monomeric and several forms of fibrillar &beta;2-microglobulin (&beta;2m) were found to bind fibrils of certain other amyloidogenic proteins besides &beta;2m fibrils19. Ylera et al. described RNA aptamers selected against immobilized monomeric A&beta;4020. Unexpectedly, these aptamers bound fibrillar A&beta;40. Altogether, these data raise several important questions. Why did aptamers selected against monomeric proteins recognize their polymeric forms? Could aptamers against monomeric and/or oligomeric forms of amyloidogenic proteins be obtained? To address these questions, we attempted to select aptamers for covalently-stabilized oligomeric A&beta;4021 generated using photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP)22,23. Similar to previous findings17,19,20, these aptamers reacted with fibrils of A&beta; and several other amyloidogenic proteins likely recognizing a potentially common amyloid structural aptatope21. Here, we present the SELEX methodology used in production of these aptamers21.

Selection of Aptamers for Amyloid &amp;#946;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#039;s Disease

Aptamers are short ribo-/deoxyribo-oligonucleotides selected by in-vitro evolution methods based on affinity for a specific target. Aptamers are molecular recognition tools with versatile therapeutic, diagnostic, and research applications. We demonstrate methods for selection of aptamers for amyloid &beta;-protein, the causative agent of Alzheimer's disease.

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#39;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including acquisition of spatial memoryand long-term spatial memory 1. The MWM is a relatively simple procedure typically consisting of six day trials, the main advantage being the differentiation between the spatial (hidden-platform) and non-spatial (visible platform) conditions 2-4. In addition, the MWM testing environment reduces odor trail interference 5. This has led the task to be used extensively in the study of the neurobiology and neuropharmacology of spatial learning and memory. The MWM plays an important role in the validation of rodent models for neurocognitive disorders such as Alzheimer&#x2019;s Disease 6, 7. In this protocol we discussed the typical procedure of MWM for testing learning and memory and data analysis commonly used in Alzheimer&#x2019;s disease transgenic model mice.

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#039;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze is a behavioral task to test hippocampal-dependent learning and memory. It has been widely used in the study of neurobiology, neuropharmacology and neurocognitive disorders in rodent models.

מוריס מבוך המים מבחן גירעונות למידה וזיכרון במודל של מחלת אלצהיימר עכברים

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of correlation of the BOLD signal in spatially independent regions of the brain defines the functional connectivity of those regions. During a cognitive fMRI task, a psychophysiological interaction (PPI) analysis can be used to examine changes in the functional connectivity during specific contexts defined by the cognitive task. An example of such a task is one that engages the memory system, asking participants to learn pairs of unrelated words (encoding) and recall the second word in a pair when presented with the first word (retrieval). In the present study, we used this type of associative memory task and a generalized PPI (gPPI) analysis to compare changes in hippocampal connectivity in older adults who are carriers of the Alzheimer's disease (AD) genetic risk factor apolipoprotein-E epsilon-4 (APOE&#949;4). Specifically, we show that the functional connectivity of subregions of the hippocampus changes during encoding and retrieval, the two active phases of the associative memory task. Context-dependent changes in functional connectivity of the hippocampus were significantly different in carriers of APOE&#949;4 compared to non-carriers. PPI analyses make it possible to examine changes in functional connectivity, distinct from univariate main effects, and to compare these changes across groups. Thus, a PPI analysis may reveal complex task effects in specific cohorts that traditional univariate methods do not capture. PPI analyses cannot, however, determine directionality or causality between functionally connected regions. Nevertheless, PPI analyses provide powerful means for generating specific hypotheses regarding functional relationships, which can be tested using causal models. As the brain is increasingly described in terms of connectivity and networks, PPI is an important method for analyzing fMRI task data that is in line with the current conception of the human brain.

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer&#039;s Disease

This manuscript describes how to implement a psychophysiological interaction analysis to reveal task-dependent changes in functional connectivity between a selected seed region and voxels in other regions of the brain. Psychophysiological interaction analysis is a popular method to examine task effects on brain connectivity, distinct from traditional univariate activation effects.

ניתוח אינטראקציות בין פסיכופיזיולוגיות מוכללת (PPI) של זיכרון הקשורות קישוריות אצל אנשים בסיכון גנטית למחלת אלצהיימר

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Neurobehavioral הערכות במודל של עכברים של פגיעה מוחית לפציעה Hypoxic-איסכמי Neonatal

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Stereological Estimation of Cholinergic Fiber Length in the Nucleus Basalis of Meynert of the Mouse Brain

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a useful method to quantify neuronal profiles of various brain structures. Here we provide a software-based stereology protocol to estimate the total length of cholinergic fibers in the nucleus basalis of Meynert (NBM) of the basal forebrain. The method uses a space ball probe for length estimates. The cholinergic fibers are visualized by choline acetyltransferase (ChAT) immunostaining with the horseradish peroxidase-diaminobenzidine (HRP-DAB) detection system. The staining protocol is also valid for fiber and cell number estimation in various brain regions using stereology software. The stereology protocol can be used for estimation of any linear profiles such as cholinoceptive fibers, dopaminergic/catecholaminergic fibers, serotonergic fibers, astrocyte processes, or even vascular profiles.

Neuronal fiber length within a three-dimensional structure of a brain region is a reliable parameter to quantify specific neuronal structural integrity or degeneration. This article details a stereological quantification method to measure cholinergic fiber length within the nucleus basalis of Meynert in mice as an example.

הערכה סטריאוולוגית של אורך סיבים Cholinergic בגרעין באסליס של מיינרט של המוח עכבר

The length of cholinergic or other neuronal axons in various brain regions are often correlated with the specific function of the region. Stereology is a ...