אנו מודים בני הזוג. SP-דינש קומאר חג המולד ליו עבור TRV-VIGS וקטורים, ואת בני הזוג. צ&#39;אק Kenerley, טרי וילר, ג&#39;ים סטר ו Bayer CropScience למתן זרעי כותנה. עבודה זו מומנה על ידי LS-NSF ו-NIH ל PH

1. לגדול שתילי גפן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעו את זרעי הכותנה הגבעות (Gossypium hirsutum) מגוון Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR ו Deltapine 90 בעציצים (7 ס&quot;מ קוטר) המכיל מערבבים מטרו 700 (SunGR, Beavile, WA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסירים על מגש מכוסה כיפה פלסטיק ב 23 ° C, 120 μE מ -1 S -2 קל, עם photoperiod 12 light/12 שעה שעה חשוך בחדר צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכיפה כאשר שני cotyledons צמחו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשבועיים לאחר מכן, השתמש צמחים עם שתי cotyledons הרחיב באופן מלא עבור assay VIGS. בשלב זה, את העלים האמיתיים עדיין לא הופיעו (איור 1). </li></ol> 2. Construct VIGS וקטור נושאת GrCLA1 ​​גן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את alterados Cloroplastos 1 גן של כותנה (GrCLA1) על ידי PCR עם פריימרים GrCLA1 ​​F-5&#39;-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 &#39;ו GrCLA1-R, 5&#39;-CTCTAGGGGCATTGAAG-3 &quot;מספריית cDNA של G. raimondii עלה רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר המוצרים PCR של GrCLA1 ​​עם EcoRI ו KpnI ולהכניס לתוך pYL156 (pTRV-RNA2) וקטור ידי קשירת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך שיבוטים על צלחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Kanamycin. בדוק את המבנים על ידי אנזים העיכול הגבלה וסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הפלסמיד לתוך Agrobacterium tumefaciens GV3101 ידי electroporation ולשחזר במדיום נוזלי LB ב 28 ° C. בחר את transformants על צלחות עם LB + Kanamycin (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) + Gentamycin (25 מיקרוגרם / מ&quot;ל). החיידק יכול להיות מאוחסן גליצרול 25% ב -80 ° C לשימוש לטווח ארוך. </li></ol> 3. בצע VIGS חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לפני, חיסון פס מניות גליצרול קפוא של tumefaciens Agrobacterium נושאת pYL192 (TRV): RNA1, pYL156 (TRV): RNA2 (וקטור לבד) ו pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​על צלחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Gentamycin. דגירה צלחות ב 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני חדירת VIGS, בחר לבנות מושבת יחיד עבור כל אחד מן הלוחות לעיל לחסן אותו לתוך 5 מ&quot;ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Gentamycin; לגדל את תרבית החיידקים על 28 ° C עבור לילה תוף הרים במהירות של 50 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התרבות לעיל כדי בקבוקון עם 50 מ&quot;ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Kanamycin ו 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של Gentamycin, בתוספת 10 mM MES (2 - (4 morpholino), אתאן חומצה sulfonic) ו 20 acetosyringone מיקרומטר. לגדול התרבות ב 28 מעלות צלזיוס למשך לילה שייקר עם מהירות של 50 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, ספין למטה אגרו תאים חיידקיים בסל&quot;ד 4000 למשך 5 דקות; מחדש להשעות את התרבות חדירה למאגר המכיל 10 mM MgCl 2, 10 mM ו - MES acetosyringone 200 מיקרומטר. התאם את OD 600 של התרבות על 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את התרבות על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני חדירת Agrobacterial, אגרוף התחתון של cotyledons של צמחי הכותנה עם מחט 25 G בלי פירסינג דרך cotyledons. אחד או שני חורים (תלוי הרכות של רקמה) היו אגרופים על כל מקטע של טבורית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ההשעיה תרבות Agrobacterial של pYL192 (TRV): RNA1 ו pYL156 (TRV): RNA2 או pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​ביחס 1:1; יד לחדור את התערובת מן החלק התחתון של cotyledons באמצעות אתרי ופצע באמצעות 1 מ&quot;ל מזרק מחטים (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצמחים עם כיפה הפלסטיק ולהשאיר את הצמחים שחדרו בטמפרטורת החדר בתנאי אור עמום במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צמחים לחדר עם צמיחה בטמפרטורה של 23 ° C, 120 מ &#39;אור μE -1 S -2 עם במחזור אור / 12 שעות 12 שעות חושך. </li></ol> הערה: VIGS עובד כאשר הצמחים נמצאים תחת או 23 ° C או החממה (25-28 ° C). כאשר הטמפרטורה נמוכה יחסית (23-25 ​​מעלות צלזיוס), קל יותר עבור חיסון לבין פנוטיפ הוא יותר אחיד, לעומת יותר (28-30 מעלות צלזיוס) או הטמפרטורה נע. כיסוי הצמחים עם כיפה גם עושה VIGS יעיל יותר. <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הפנוטיפ השתקה ב 7 ימים חדירה ~ 8 לפרסם. העלים של צמחים נכון מושתקים על ידי pYL156 (TRV): RNA2-GrCLA1 ​​החלו להציג את הפנוטיפ לבקן (איור 4). הצמחים שחדרו עם נושאים Agrobacteria pYL156 (TRV): RNA2 לשמש כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את היעילות להשתקת גנים באמצעות בחינת רמת הביטוי של גנים אנדוגניים באמצעות שעתוק לאחור polymerase תגובת שרשרת (RT-PCR) עם RNA שבודד מלאה צמחי הכותנה השתיק. </li></ol> הערה: VIGS-ed צמחים צריך להישמר בתנאי הסגר צמחים הכלול צריך להיות autoclaved שצריך להיפטר לאחר מבחני כמו TRV יש מגוון רחב מארח הוא פתוגן רשומות. 4.נציג תוצאות: כשבועיים לאחר חדירה ביד עם תערובת Agrobacterial, הפנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 ​​נצפתה בבירור על העלים נכון. יעילות ההשתקה מגיע כמעט 100% בניסויים רבים עם יותר מ 50 צמחים. הצמחים השתיק להציג פנוטיפ לבקן מפוזרים באופן אחיד וחזק מאוד לאחרונה על פיתוח עלים בפסיפס על העלים הבכור (איור 4). <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. שתיל גפן על הבמה שבועיים הישן עם שני cotyledons הרחיב באופן מלא המשמש חדירה Agrobacterial. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ניקוב חורים זעירים על החלק התחתון של cotyledons של צמחי הכותנה באמצעות מחט 25 G כדי להקל על חדירת Agrobacterial. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הסתננות יד של תערובת Agrobacterial לתוך cotyledons כותנה באמצעות אתרי ופצע באמצעות מזרק מחטים <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. פנוטיפ אלבינו הופיע VIGS השתיק צמחי הכותנה. ארבעה זנים מוצגים. א) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR: C) Phytogen 425RF: D) Deltapine 90.

<ol>
	<li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+sequencing+cotton+(Gossypium)+genomes.">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li><li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing.">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li><li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants.">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li><li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants.">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li><li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-induced+gene+silencing+in+tomato.">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li><li>Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+expression+of+CLA1,+a+gene+that+encodes+the+1-deoxyxylulose+5-phosphate+synthase+of+the+2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate+pathway+in+Arabidopsis.">Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).</li><li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLA1,+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development,+is+highly+conserved+in+evolution.">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li><li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt.">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

VIGS הוכח להיות כלי רב עוצמה לניתוח גנומיקה תפקודית על ידי transiently מפילה את הביטוי של גנים אנדוגניים. במחקר זה, פיתחנו Agrobacterium בתיווך VIGS ידי ניצול וקטור TRV מבוססי בינארי. כותנה CLA1 (GrCLA1) גן פותחה כסמן ויזואלי כדי לעקוב אחר יעילות ההשתקה. השגנו בעקביות 100% יעילות השתקת הג...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם של ריאגנטים וציוד </th><th> חברה </th><th> קטלוג / מספר סידורי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> רולר תוף </td><td> גלאס, קול, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> אגרו חיידק תרבות </td></tr><tr><td> מדגרה </td><td> שלדון ייצור, Inc </td><td> 01046209 </td><td> אגרו חיידק תרבות </td></tr><tr><td> UV / Vis ספקטרופוטומטר </td><td> Beckman Coulter </td><td> דגם: DU530 </td><td> מדידת OD </td></tr><tr><td> ג&#39;ין Pulser </td><td> BioRad </td><td> דגם: 1652076; סידורי: 154BR3880 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> Pulser Controller </td><td> BioRad </td><td> דגם: 1652098; סידורי: 232BR4833 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> Micropulser electroporation קובט </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל מזרק </td><td> BD Biosciences </td><td> 30962 </td><td> הרכבה של החיידק-אגרו </td></tr><tr><td> מטרו מערבבים 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> גידול שתיל </td></tr><tr><td> טרה קוטה סיר </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> גידול שתיל </td></tr><tr><td> MES monohydrate </td><td> USB </td><td> 18886 </td><td> הסתננות חיץ </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> סיגמא </td><td> D134406 </td><td> הסתננות חיץ </td></tr></tbody></table>

agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing assay in cotton

כותנה (Gossypium hirsutum) הוא אחד הגידולים החשובים ביותר בעולם. מאמצים רבים נעשו על הריבוי המולקולרי של זנים חדשים. ניתוח בקנה מידה גדול גן תפקודית כותנה כבר פיגרה רוב מיני הצמחים המודרנית, ככל הנראה בשל גודלו של הגנום, שכפול גנטי polyploidy, מחזור צמיחה סרבנות ארוך לשינוי גנטי 1. כדי להקל על מחקר גנטי גבוה התפוקה / גנומית פונקציונלית כותנה, אנו מנסים לפתח מבחני חולף מהיר ויעיל כדי להעריך את גן פונקציות כותנה. Virus-induced להשתקת גנים (VIGS) היא טכניקה רבת עוצמה אשר פותחה על בסיס לארח את הפוסט תעתיק להשתקת גנים (PTGS) לדכא התפשטות ויראלית 2,3. Agrobacterium בתיווך VIGS יושם בהצלחה במגוון רחב של מינים dicots כגון Solanaceae, ארבידופסיס ומינים קטניות, מינים monocots כולל שעורה, חיטה, תירס, עבור מחקרים שונים גנומית תפקודית 3,4. כפי גישה זו מהיר ויעיל ימנע שינוי הצמח מתגבר יתירות פונקציונלית, הוא אטרקטיבי במיוחד ומתאימה המחקר הגנומי תפקודית מינים כמו יבול הכותנה לא ניתנות לשינוי. במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט של מערכת VIGS Agrobacterium בתיווך כותנה. בין וקטורים ויראליים VIGS מספר, טרטור טבק וירוס (TRV) פולש מגוון רחב של המארחים, והוא מסוגל להתפשט נמרצות ברחבי המפעל כולו עדיין לייצר סימפטומים קלים על hosts5. כדי לבדוק את יעילות השתקה, GrCLA1, גן homolog של Cloroplastos ארבידופסיס alterados 1 גן (AtCLA1) כותנה, כבר משובטים ונוסף וקטור בינארי VIGS pYL156. CLA1 גן עוסקת בפיתוח הכלורופלסט 6, מחקרים קודמים הראו כי ההפסד-of-פונקציה של AtCLA1 הביא פנוטיפ לבקן על העלים נכון 7, מתן סמן ויזואלי מצוין השתקה יעילות. בסביבות שבועיים שלאחר חדירת Agrobacterium, את הפנוטיפ לבקן החלו להופיע על העלים נכון, עם יעילות ההשתקה של 100% כל הניסויים משוכפל. השתקה של ביטוי גנים אנדוגניים אושרה גם על ידי ניתוח RT-PCR. ראוי לציין, השתקה potently יכול להתרחש בכל הזנים שנבדקו, כולל זנים מסחריים שונים גדל בטקסס. זה מהיר ויעיל Agrobacterium בתיווך assay VIGS מספק כלי רב עוצמה עבור ניתוח בקנה מידה גדול מהירה של פונקציות גן ברמת הגנום כולו כותנה.

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton at JoVE.com

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור Agrobacterium בתיווך וירוס-Induced assay השתקה (VIGS) גנים כותנה. רעשן טבק וירוס (TRV) הנגזרות וקטורים VIGS נפרסו לגרום RNA השתקת GrCLA1 ​​כותנה, Cloroplastos alterados 1 הגן. פנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 ​​נצפתה בשלב שתיל בתוך 2 שבועות לאחר חיסון.

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

agrobacterium-mediated-virus-induced-gene-silencing-assay-in-cotton

Research

JoVE Journal

Biology

24.3K Views.  Texas A&M University. אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור Agrobacterium בתיווך וירוס-Induced assay השתקה (VIGS) גנים כותנה. רעשן טבק וירוס (TRV) הנגזרות וקטורים VIGS נפרסו לגרום RNA השתקת GrCLA1 ​​כותנה, Cloroplastos alterados 1 הגן. פנוטיפ לבקן הנגרמת על ידי השתקת GrCLA1 ​​נצפתה בשלב שתיל בתוך 2 שבועות לאחר חיסון.

Video: Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins with the ability to inhibit the host plant RNA silencing pathway. Unlike virus effector proteins, only several secreted effector proteins have showed the ability to suppress RNA silencing in bacterial, oomycete, and fungal pathogens, and the molecular functions of most effectors remain largely unknown. Here, we describe in detail a slightly modified version of the co-infiltration assay that could serve as a general method for observing RNA silencing and for characterizing effector proteins secreted by plant pathogens. The key steps of the approach are choosing the healthy and fully developed leaves, adjusting the bacteria culture to the appropriate optical density (OD) at 600 nm, and observing green fluorescent protein (GFP) fluorescence at the optimum time on the infiltrated leaves in order to avoid omitting effectors with weak suppression activity. This improved protocol will contribute to rapid, accurate, and extensive screening of RNA silencing suppressors and serve as an excellent starting point for investigating the molecular functions of these proteins.

Here, we present a modified screening method that can be extensively used to quickly screen RNA silencing suppressors in plant pathogens.

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Genetics

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has been developed and applied for various plant species including Nicotiana benthamiana, tomato, Arabidopsis, cotton, and monocot plants such as wheat and maize. Here, we describe a detailed protocol using PVX-based VbMS vectors to silence endogenous miRNAs in potato. To knock down the expression of a specific miRNA, target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are designed, integrated into plant virus vectors, and expressed in potato by Agrobacterium infiltration to bind directly to the endogenous miRNA of interest and block its function.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

We present a detailed protocol for potato virus X (PVX)-based microRNA silencing (VbMS) system to functionally characterize endogenous microRNAs (miRNAs) in potato. Target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are integrated into the PVX vector and transiently expressed in potato to silence the target miRNA or miRNA family.

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

Environment

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Immunology and Infection

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

ייצור יעיל של שורשים שעירים מהונדסים, פולי סויה

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

מחבר זרקור: טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Bioengineering

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג'ין השתקת Assay כותנה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

הקרנת גנטיקה קדימה VIGS בתיווך לזיהוי גני המעורבים בהתנגדות Nonhost

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

אופטימיזציה וניצול