פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר תנועות שונות בחרקים, פונקציות של חלבוני חרקים, ואינטראקציות בין וירוס וחרק וקטורי in vivo. שיטה זו יעילה ואינפורמטיבית. המבנים של מעי החרק ותאי העזר מוצגים בבירור כאשר מסתכלים עליהם במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר.
מי שידגים את ההליך יהיה לו ג'אנג, דוקטור מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, העבירו חרקים לא אלימים מכוסות זכוכית לנגיף ננסי טרי מפוספס שחור אורז דרומי, SRBSDV, צמחי אורז נגועים המכוסים ברשת חסינת חרקים לתקופת גישה של יומיים לרכישת וירוסים. לאחר מכן לאסוף את החרקים בכוסות זכוכית המכילות שתילי אורז טריים.
לאחר יומיים, אספו את החרקים מכוסות הזכוכית באמצעות שאיפה ידנית לנתיחה וכריתה של המעיים. הכינו PBS מולארי 0.01, 4% פרפורמלדהיד ו-2% טריטון X-100 כמתואר בכתב היד של הטקסט. השתמש בפיטר כדי להניח 100 מיקרוליטר PBS על מגלשת זכוכית ומקם את המגלשה על הבמה של מיקרוסקופ אופטי.
השתמש בשואב ידני כדי לאסוף את המבוגרים הנגועים ב- SRBSDV מכוסות הזכוכית ולהניח אותם בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח כדי לשתק את החרקים. העבר מבוגר משותק לתוך 100 מיקרוליטר של PBS על המגלשה עם הבטן למעלה. השתמש פינצטה כדי להדק את הגוף ולהסיר את הראש עם קבוצה אחרת של פינצטה.
עם קבוצה אחת של פינצטה, להדק את הצדדים של הבטן להדק את ovipositor או את האיבר copulatory של הזנב עם קבוצה אחרת, ולאחר מכן בזהירות למשוך את הקרום intersegmental של קטע בטן אחד כדי לחשוף לאט את המעיים בבטן. ממשיכים לקרוע את הקרום ולשלוף בהדרגה את כל המעיים מהבטן. משכו בעדינות את הזנב המחובר לקצה המעי כדי להסיר את כל המעי.
הכניסו את המעיים שנכרתו לתוך צינור צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר. הוסף 200 מיקרוליטר של PBS לצינור ולהשתמש פיפטה כדי לשטוף היטב את המעיים. השתמש בפיטר כדי להניח 100 מיקרוליטר PBS על מגלשת זכוכית ומקם את המגלשה על הבמה של מיקרוסקופ אופטי.
השתמש בשואב ידני כדי לאסוף את הנימפות הנגועות SRBSDV מכוסות זכוכית והניחו אותן בצינור 1.5 מיליליטר המונח על קרח כדי לשתק את החרקים. העבירו נימפה משותקת לתוך 100 מיקרוליטר החיץ במגלשה כשהבטן פונה כלפי מעלה. נתקו את זנב הנימפה, ואז הדקו את גוף החרק כדי לתקן אותו בעדינות והשתמשו בזוג השני כדי להדק את הראש.
משכו בעדינות את הראש הרחק מהגוף תוך שמירה על חיבורו למעיים כך שהראש מנותק מהגוף, אך המעיים עדיין מחוברים לבית החזה ולבטן. כאשר הפינצטה עדיין מהדקת את הגוף, השתמש בזוג השני כדי להזיז את הראש בזהירות ולשלוף בהדרגה את המעיים. נתקו את המעיים מהראש כדי לקבל מעי שלם מבלי לפגוע בגוף.
הכניסו את המעיים שנכרתו לתוך צינור. מוסיפים PBS לצינור ומוצצים בעדינות לשחרר את התמיסה עם פיפטה כדי לשטוף את המעיים ביסודיות. הכינו את הנוגדנים ואת אמצעי ההרכבה כמתואר בכתב היד של הטקסט.
הניחו את מעי ה-WBPH שזה עתה נכרת ושטוף PBS ב-100 מיקרוליטר של 4% פרפורמאלדהיד בצינור צנטריפוגה של 200 מיקרוליטר בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים, להחליף את הפתרון paraformaldehyde עם 200 מיקרוליטר של PBS. לאחר 10 דקות, הסר את PBS כדי לסלק כל paraformaldehyde וחזור על שלב השטיפה PBS פעמיים.
לאחר שתי שטיפות PBS, הוסיפו 200 מיקרוליטר של חומר ניקוי לא יוני Triton X-100 כדי לחדור את הדגימות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, הסירו את Triton X-100 ושטפו את שאריות חומר הניקוי בשלוש שטיפות של 10 דקות עם PBS. לדלל את הנוגדנים המסומנים אחד עד 50 עם 50 מיקרוליטר של אלבומין בסרום שור.
מוסיפים את הנוגדנים המדוללים לצינורית ודגרים על הדגימות במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקר לאחר הסרת הנוגדן, שטפו את שאריות הנוגדנים המדללות בשלוש שטיפות של 10 דקות עם PBS. לדלל מיקרוליטר אחד של DyLight 633-Phalloidin עם 50 מיקרוליטר של PBS ולהוסיף 50 מיקרוליטר של phalloidin מדולל לצינור עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר הסרת הפלואידין, שטפו היטב את יתרת הפלואידין בשלוש שטיפות של 10 דקות עם PBS. הניחו טיפה של אמצעי הרכבה המכילים DAPI על שקופית מיקרוסקופ. מעבירים את המעיים למדיום ומניחים בעדינות את זכוכית הכיסוי על הדגימה מבלי ליצור בועות.
המיקרוגרף הקונפוקלי המייצג לסריקת לייזר של מעי WBPH שנכרת ממבוגרים לאחר התיוג עם פאלואדין הראה שלושה חלקים: המעי הקדמי, המעי התיכון והמעי האחורי. בין אלה, אמצע המעי הוא אתר הזיהום הראשוני של SRBSDV. מבנה תאי האפיתל החד-שכבתי של המעי מאפשר את חקר הלוקליזציה התאית של חלבוני חרקים וקולוקליזציה של חלבונים נגיפיים וחרקים.
מעי WBPH שנכרת עם DyLight 488 המסומן כנוגדן אנטי-VAMP-7 ו-SRBSDV עם נוגדן DyLight 549 המסומן נגד SRBSDV מוצגים כאן. נגיפי VAMP-7 ו-SRBSDV הוכחו כבעלי מיקום משותף בציטופלסמה, דבר המצביע על כך ש-VAMP-7 עשוי למלא תפקיד בהעברת וירוסים in vivo. מעיים חדירים יש לנקות ביסודיות לאחר הדגירה עם נוגדנים מצומדים luciferin כדי להפחית את הרקע ואת מחייב לא ספציפי.
זוהי שיטה אמינה לצפייה בלוקליזציה של וירוסים, פתוגנים אחרים וחלבוני חרקים בחרקים. הוא מספק את הבסיס למחקרים נוספים על הקשר בין פתוגנים וחרקים.
