מחקר זה נתמך על ידי NIH DC052256 ו DC006015, ו-NSF 0324769 עד QG ו-T32 DC008072 ל BS.

1. הכנה הליך זה biosafety ברמה 2, לכן כל ההכנות הבאים עשויים במנדף Biohazard שבו נוהל microinjection מבוצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מחממים 37 ° C מיטת מים: מילוי שקית אחסון מפלסטיק עם מים - חותם ולהגדיר על חימום רוקנה לחסום חממה. זה יאפשר עכברים להתאושש הזרקת הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי מיכל פסולת Biohazard עם אקונומיקה 10% בנפח מתאים לטבילה של פסולת מתוך כל התהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת לפתוח קטנה של אתנול 70% ו צלחת שנייה עם ddH2O מעוקרים מקום בארון בטיחות ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מזרק קיבולת 5μL המילטון עם מחט 33-מד ידי ריסוס מטה את הגוף ואת המחט עם 70% אתנול עם הבוכנה שלף כל הדרך. שוב ושוב לשאוב אתנול מן הצלחת להוציא אותו ואת כל הדרך לפחות 5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המחסנית על ידי מזרק מים סטריליים aspirating ולהוציא לפחות 5 פעמים. המקום מזרק בבטחה בצד בשכונה תרבות ולאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מניות ויראלי מ -80 ° C אחסון במקפיא ומניחים על קרח על מנת לאפשר הפשרה. Microinjection דורש 2μL המניות וירוס לכל העכבר titre של 10 יחידות מדבק 9 / mL. Lentiviruses ניתן להשיג ממקורות מסחריים או המיוצרים במעבדה לפי הפרוטוקול הוקמה (לויס et al., 2002). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לשלב הזרקת המספק שטח מוגבה מעל פני השטח את מכסה המנוע - יכול להשתמש תרבות 10 ס&quot;מ צלחת מכוסה בסדין של Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדר מגבונים אלכוהול ליד תחנת ההזרקה. </li></ol> 2. Microinjection של חלקיקים לתוך lentiviral אפיתל ההרחה הנהלים כל חיה שבוצעה בשיטה זו נעשים בהתאם להנחיות שאושרו IACUC. המתח מ.א.ס. מאסכאלאס C57BL/6J המודל בעלי חיים המשמשים כל הניסויים הדגימו כאן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את הגורים העכבר על ידי היפותרמיה ידי לקיחת עכבר גור (P0-P3) מתוך הכלוב לשים את הגור על כפפה חתך פתוח על הקרח במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה הגור להיות בהרדמה מלאה, 2μL לשאוב מניות נגיפי לתוך המזרק המילטון מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על גבי הגור בשלב ההזרקה. משוך בעדינות עור מן החלק העליון של הראש ליד האוזן לכיוון החלק העליון של הצוואר. זה אמור לספק משטח העור לימד על חלל האף וגם יקל ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט דרך החלק העליון של חלל האף על 3mm מתחת לפני השטח של העור כדי להגיע אפיתל ההרחה. Microinject 0.5μL של פתרון וירוס לכל זריקה, בוחרים בשני אתרים לכל צד, הן על ימין ועל שמאל (ארבע זריקות בסך הכל לכל עכבר = 2μL של הנגיף הצורך). אתרי הזרקה יש כשל בנפרד אחד מהשני. עבור המיקוד של אתרי הזרקה נכונה, החיפוש פני הגולגולת הגב על קווי המתאר של הנורה חוש הריח. קו זה גלוי בקושי בלידה דרך העור שקופה למחצה לבין הגולגולת. כדי להפוך את שתי זריקות לכל צד, מטרת זריקה אחת מקורי רק להתוות נורה אחת על ציר המדיאלי. הפוך את הכניסה second לרוחב להתוות את הנורה, אך הקפד זווית זריקה מדיאלית, כך שאתה יכול להגיע אפיתל הריח שנמצא מתחת ventrally הנורה. הימנע חודר את הנורה חוש הריח! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם יבש כל פתרון וירוס שיורית או דם עלול להימלט מן הזריקה או פתחי הנחיריים באמצעות Kimwipe. מיד להיפטר Kimwipes את מיכל נוזל אקונומיקה מדוללת Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר מוזרק על מיטת מים בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1-4 עבור כל העכברים להיות מוזרק, נזכר תצטרך 2μL על מניות וירוס לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו עכברים להתאושש על החממה מיטת מים במשך 30 דקות לפני החזרה להם כלוב קינון המקורי שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את הבמה microinjection, מגבונים sanitizing ואת כל נייר מוצרים נוספים ניקוי לרשות נוזל אקונומיקה Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המזרק המילטון על ידי שאיפה חוזרות פליטה של ​​אתנול ואז מים כפי שנעשה בשלבים הכנה. אפשר המזרק לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת יעילות מקסימלית התמרה לחזור על הליך זה שוב 4 שעות. OSNs נגועים ניתן דמיינו בכל אורך של התא כמה כמו שלושה ימים. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה של צף סעיפים הנורה חוש הריח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכבר מוזרק בנקודת הזמן הרצוי זלוף לתקן את הרקמה עם paraformaldehyde 4%. לנתח את OB. מדגירים את paraformaldehyde הלילה ואז סוכרוז 30% PBS לילה. שבץ בינוני הטבעה אוקטובר על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העטרה סעיפים OB מתקבלים על 60μm עובי באמצעות cryostat. טאטא סעיפים הנורה לתוך צלחת 10 ס&quot;מ תרבות עם 5 מ&quot;ל 1x PBS (pH 7.4). מדורים צריכים להיות כל הזמן צף PBS לאפשר אוקטובר עד דissolve. העברת חלקים צפים PBS לתוך בקבוקון 50 מ&quot;ל קונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להסתפק בסעיפים לחלק התחתון של המכל. אבק את PBS בלי להתחנף כל הסעיפים. לשטוף חלקים עם רקמה PBS 20mL. חזור ליישב צעדים אבק. רקמה Resuspend עם 10 מ&quot;ל PBS וחתכים העברת צף חרוטי בקבוקון 15 מ&quot;ל עבור immunostaining. לאחר סעיפים רקמות התיישבו, האבק PBS supernatant מבלי להפריע רקמות. סעיפים Resuspend עם 0.3% טריטון X-100 ב 1x PBS, pH 7.4 (PBS-Tx) המאפשר ניקוי כדי לנקב קרום התא. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אבק את supernatant ו הדגירה לחזור עם PBS-Tx פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים רקמות 10 מ&quot;ל של תמיסת חסימה (נסיוב סוס 5% PBS-Tx) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פתרון חסימת לפחות פעמיים עם PBS-Tx במשך 15 דקות כל בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2ml של פתרון הנוגדן העיקרי PBS-TX. ראה ריאגנטים בסעיף ציוד נוגדנים השתמשו בניסוי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף לשטוף second PBS-Tx חסימת פתרון נוגדן ראשוני. לדגור על פלטפורמה מתנדנדת לאט (~ 30rpm) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות כדי להבטיח חדירה מעמיקה לתוך בסעיפים צף 60μm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, הפתרון נוגדן ראשוני ניתן לאחזר בזהירות בעזרת פיפטה ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש חוזר עוד פעמיים בתוך שבועיים ללא אובדן משמעותי של עוצמת מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS-Tx במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין (~ 30rpm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2ml של דילול נוגדנים משני PBS-TX. אבק מעל לשטוף האחרון ולהוסיף פתרון נוגדנים משני סעיפים רקמות. לעטוף את החלק החיצוני של הבקבוקון מכתים בנייר אלומיניום כדי לחסום את האור, אשר יכול לגרום photobleaching fluorophore. המקום עטוף הבקבוקון על פלטפורמה לאט הנדנדה דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל פתרון נוגדנים משני על ידי שאיבת אבק משם. לשטוף חלקים פעם עם PBS-Tx במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר. לשטוף פעמיים נוספות עם PBS (pH 7.4) במשך 20 דקות כל בטמפרטורת החדר. הר בסעיפים רקמה צבעונית על גבי שקופיות הזכוכית באמצעות Fluoromount G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך באמצעות סעיפים מוכתם עבור אקסונים OSN נגוע חיובי טרמיני האקסון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות תצוגה תלת מימדי של התווית OSN האקסון ואת מסוף ארבור, ליצור סדרה של קטעים אופטי דרך עומק 60μm של הפרוסה היעד רקמות OB (לאורך ציר z) באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסנית זו של Z-סעיף תמונות יכול להיות מוקרן יחד לאחר מכן לשחזר פרספקטיבה 360 מעלות של סיבוב אחד שכותרתו OSN האקסון, כולל פירוט סוכת מסוף בשלמותה. זווית סיבוב אחד כל אחד יכול ליפול בפח ו מיוצא כקובץ תמונה (כלומר, JPG, TIFF) עבור מצגת בפורמט 2D. </li></ol> 4. נציג תוצאות בעזרת השיטות שתוארו כאן, אנו יכולים transduce עצב סנסורי על ידי חוש הריח lentivirus in vivo. יש לנו אפוא OSNs נגוע דמיינו רחוק עם GFP וכתבים mCherry ניאון, כמו גם עם חלבון myc-tagged היתוך דרך immunocytochemistry. טכניקה זו מספקת שפע של OSNs נגועים. ובכל זאת, התמרה מתרחשת לסירוגין מספיק כדי לספק OSNs שכותרתו בנפרד, ובכך מאפשר לניתוח מורפולוגיה תא בודד. אקסונים מסופי האקסון הם צילמו בתוך קטעי רקמה OB בתוך סביבה מולדתם על ידי מיקרוסקופיה confocal (איור 1). כל OSN האקסון מסוף סוכת יכול בדרך כלל להיות שבוי בתוך סעיף 40-50μm אופטי. הגדלה גבוהה של נגוע מסופי האקסון OSN מאפשר ניתוח מפורט של מורפולוגיה סוכת axonal בשכבת גלומרולרי. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> באיור 1. מסלולו של נוירון יחיד חושי הריח האקסון ואת מסוף סוכת שלה.) קטע העטרה של הנורה חוש הריח של העכבר P7 מראה את שכבת עצב ההרחה (ONL) immunostained עבור OMP (אדום) ואת השכבה גלומרולרי (GL) immunostained עם שני OMP ו Vglut2 (אפור). האקסון יחיד הריח נוירון חושי להביע GFP (ירוק) עובר בתוך ONL וחודר לתוך המבנה גלומרולרי. ב) מסוף האקסון מורפולוגיה סוכת בתוך glomerulus המסומן בבירור על ידי ביטוי של GFP. Vglut2 שיתוף מכתים באפור מאירה את אזור glomular הכולל שבתוכו ה-GFP חיובי האקסון מרחיב abor סופנית. ג) OSNs נגוע lentiviral להביע GFP (ירוק) ב OE. Cytostructure של אפיתל הריח מוצג עם מכתים DAPI (כחול). ביטוי של GFP מאפשר הדמיה של גופים OSN התא תהליכים תאיים שלהם OE. ד) האקסון OSN ומורפולוגיה מסוף עם הביטוי Rap1GAP2 עקום על ידי shRNA. Lentiviruses נושא קלטת ביטוי כפול עם Rap1GAP2 shRNA תחת מקדם את העכבר U6 ו-GFP תחתהאמרגן CMV יושמו OE. אינפקטד מסופי האקסון הריח הציג מסוף סוכת פשוטה יותר בהשוואה לזו של פקד ה-GFP בלבד. בר = 20μm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

פרוטוקול זה הוא ביו בטיחות ברמה 2 תואם. כל אמצעי הבלימה סביבת עבודה מתאימה, הגנה אישית, נגיפי פסולת הוקמו בהתאם. הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם להנחיות IACUC.

Microinjection תוצאות lentivirus בהעברת קבע בונה גנים לתוך הדנ&quot;א הגנומי OSN. גישה זו מאפשרת לנו לבצע מניפולציות לטווח קצר או לטווח ארוך של גנים מועמדים באמצעות overexpression או בתיווך shRNA עקום למטה. בנוסף, אנו יכולים fluorescently תווית OSNs יחיד בקו הקיים עכבר מהונדס לקיים שיתוף לוקליזציה של ...

Microinjection: עכברים יילוד היו microinjected באמצעות מזרק 5μL המילטון (Hamilton # 7647-01) מצויד במחט 33 מד (המילטון # 7762-06). Immunocytochemistry ריאגנטים: נוגדנים ראשי: נוגדן polyclonal ארנב GFP (בדיקות מולקולריות # A-6455), נוגדנים נגד עוף polyclonal OMP (מותאם אישית) (חן et al, 2005.) גיניאה חזיר polyclonal נוגדנים נגד VGlut2 (Millipore # AB2251). נוגדנים משני: Cy2-מצומדות חמור נגד ארנב (ג&#39;קסון Immunolab # 711-225-152), Cy3-מצומדות החמור נגד עוף (ג&#39;קסון Immunolab # 703-165-155) ו-Cy5 מצומדות נגד ניסיונות עז חזיר (ג&#39;קסון Immunolab # 106-175-008). מדורים היו רכוב על שקופיות הזכוכית עם Fluoromount G (דרום ביוטק # 0010-01) עם פתרון 50ng/mL הכרומטין DAPI הכתם. Confocal הדמיה: Z-ערימת התמונות צולמו באמצעות אולימפוס Flouview FV1000 מיקרוסקופ confocal ותמונות נאסף ומעובד על תחזיות 3D באמצעות אולימפוס FV10-ASW רכישת 2.01 confocal ותוכנה ניתוח.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

פיתוח מעגל חוש הריח המדויק מסתמך על תחזית מדויקת של חושי הריח נוירון (OSN) אקסונים מטרות הסינפטי שלהם הנורה חוש הריח (OB). מנגנונים מולקולריים של צמיחה האקסון OSN ומיקוד אינם מובנים היטב. ביטוי גנים מניפולציה ובעקבות חזותי של אקסונים OSN יחיד מסוף סוכת המורפולוגיה שלהם עד כה מאתגר. כדי לחקור תפקוד גנים ברמת תא בודד בתוך מסגרת הזמן המצוין, פיתחנו טכניקה המבוססת lentiviral לתפעל ביטוי גנים OSNs in vivo. חלקיקים lentiviral מועברות על ידי OSNs microinjection לתוך אפיתל ההרחה (OE). קלטות הביטוי אז הם משולבים באופן קבוע לתוך הגנום של OSNs transduced. חלבון הפלואורסצנט הירוק ביטוי מזהה OSNs נגוע מתאר מורפולוגיה כולו שלהם, כולל מסוף האקסון ארבור. בשל זמן אספקה ​​קצר בין microinjection זיהוי כתב, תפקוד לימודי הגן יכול להיות ממוקד בתוך פרק זמן צר מאוד של פיתוח. באמצעות שיטה זו, יש לנו לזהות ביטוי של GFP בתוך כמה כמו שלושה ימים עוד שלושה חודשים לאחר ההזרקה. השגנו גם יתר ביטוי shRNA בתיווך עקום על ידי microinjection lentiviral. שיטה זו מספקת מורפולוגיות מפורט של גופים OSN התא אקסונים ברמת תא בודד in vivo, ובכך מאפשר אפיון של פונקציה מועמד גנים במהלך התפתחות חוש הריח.

Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף שלה<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.6K Views.  University of California, Davis. אנו מציגים טכניקה lentiviral מניפולציה גנטית להדמיה של האקסון נוירון יחיד חושי הריח arborization מסוף שלה In vivo.

Video: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Developmental Biology

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video