נתמכים על ידי NIH / ניסויי 011582. הדמיה NIDCD R01 DC בוצעו באוניברסיטת קולורדו אנשוץ הרפואי קמפוס האור מתקדם מיקרוסקופית Core נתמך בחלקו על ידי NIH / NCRR קולורדו CTSI גרנט מספר UL1 RR025780 והפרעות Rocky Mountain Neurlogical Core מרכז גרנט NIH P30NS048154. ד&quot;ר Sascha du Lac ממכון סאלק סיפק לנו עכברי GlyT2-GFP.

1. Genotyping האופטי 1. האופטי Genotyping של גורי עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו ביטוי של סמן פלואורסצנטי המתאים באמצעות מצביע לייזר של גל העירור המתאים (405 ננומטר בניסויים שתוארו כאן) ומתאימים משקפי מסנן חוסמים את גל העירור אבל עובר את אורך גל הפליטה (450-700 ננומטר בניסויים שתוארו כאן) . כוון את מצביע הלייזר בחלק האחורי של הראש או בחוט השדרה של גור העכבר (ראה איור 1). הימנע זורח הלייזר בעיניים והחשיפה ממושכת של העור לאור הלייזר. </li></ol> 2. האופטי Genotyping של בעלי חיים ישנים יותר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים את העכבר (P14 הגיל לp138 בניסויים שתוארו כאן) עם מנת יתר של pentobarbital באמצעות זריקת intraperitoneal (120 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף). אשר הרדמה תקינה על ידי בדיקת הרפלקסים של החיה (לצבוט את הקצה של ה בקצרהאוזן דואר או באחד מרגליו האחוריות כדי לעורר את רפלקס הנסיגה של האוזן או רגל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: למרות השימוש במנת יתר של pentobarbital (120 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף) אנו מתייחסים להליך ההזרקה כ&quot; הרדמה עמוקה &quot;במקום המתת חסד, כי בעלי החיים הוא באופן אידיאלי עדיין בחיים (כלומר לבו עדיין פועם), כאשר ניתוח ולהתחיל זלוף. הדבר מבטיח זלוף יעיל יותר של האיברים הפנימיים כולל המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שבעלי החיים לא מראים שום רפלקסים, להסיר בזהירות את העור שמעל הגולגולת (איור 2 א) על ידי ביצוע חתך בעור המכסה את החלק האחורי של הראש וחיתוך לבטן של הגולגולת. לחשוף את הגולגולת שנחשפה לאור הלייזר ולבחון את הקרינה באמצעות משקפי המסנן כמתואר לעיל. אם אות ה- GFP חיובית הוא ציין, המשך לשלב 2, אם לא, להקריב בעלי החיים באמצעות עריפת הראש (שני / הבטחת צורה של המתת חסד הבאה שלנותקנות IACUC). </li></ol> הערה: בעכברים אפילו מבוגרים (&gt; 1 חודש) ניתן לראות את הקרינה דרך עיניו של בעל החיים. 2. Transcardial זלוף ומוח הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse transcardially עם פוספט קר כקרח שנאגרו (PBS; NaCl: 137 מ&quot;מ, KCl: 2.7 מ&quot;מ, KH 2 PO 4: 1.76 מ&quot;מ, Na 2 HPO 4: 10 מ&quot;מ) באמצעות מחט מזרק 30 G כדי להסיר במידה רבה את הדם מ החיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לפתוח בזהירות את כלוב הצלעות עם מספריים חדים ולאחר מכן דחף את המחט לתוך החדר השמאלי של הלב. להתחיל לשאוב PBS לתוך הלב ואב העורקים ומייד לאחר שלב זה לפתוח את אטריום ימין של הלב עם המספריים כדי לאפשר לדם כדי לצאת מהגוף. הערה: זלוף לוקח 5 - 10 דקות, תלוי בגודל של החיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר exsanguination באמצעות זלוף, לערוף את החיה, לאבטח את ראשה עם n הסיכהeedles (או 30 מחטי מזרק G) על ידי הפירסינג דרך ארובות עיניים בצלחת הכנה ולהסיר את המוח מהגולגולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להשתמש במספריים חדים לחתוך את העור שכיסה את הגולגולת: לעשות חתך קטן בחלק האחורי של הראש, ואז לחתוך לאורך קו האמצע בצד הגב של הראש, לחתוך לצדדים רק caudally של העיניים של בעלי החיים ולבסוף חתך לכיוון הזנב להסיר לחלוטין את הדשים של עור בחלק האחורי של הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, לחזור על אותה תבנית החיתוך לגולגולת עצמה, הקפד להסיר את שני cochleas בתהליך, כי זה יהיה משמעותי לפשט את ההסרה של גזע המוח בסופו של הדבר. לאחר הליך זה חצי הזנב של המוח צריך לשקר חשוף לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להשתמש בסכין גילוח חד או אזמל כדי לחתוך את כל המוח הקדמי בזווית של 45 מעלות ועל כ -2 מ&quot;מ מקורי מהמוח הקטן. לגרוף את החלק הקדמי של המוח המופרד עם abמרית אף אוזן גרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במרית כדי להעלות את מחצית הזנב של המוח בסוף מקורי שלה ולאחר מכן לחתוך את עצבי גולגולת שעדיין מחוברים לגזע המוח בצד הגחון שלה. כתוצאה סופית, חצי הזנב של המוח כולל גזע המוח צריך ליפול באופן חופשי את שאר ראש החיה מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את מחצית הזנב הוסרה מהמוח כדי לחשוף צד הגחון שלה ולחתוך לאורך מישור העטרה מקורי רק (לזריקות אנטרוגרדית) או רק הזנב (לזריקות מדרדר) של &quot;נורות&quot; ממוקם ventrally מכיל גוף הטרפז (ראה שלב 2.3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תמיד בסכין גילוח חד או אזמל להליך החיתוך כדי למזער מוות של תאים הנגרם על ידי לחץ מכאני מוגזם ברקמות. כתוצאה סופית, צריך התקבלו explant המוח פורש כ 1 סנטימטר באורך ומכיל קומפלקס olivary מעולה המלא לאורך אזורים אחרים במוח. </li></ol></li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> הערה: פרוטוקול זה מדגים את הליך הזרקה נותב לתוך גוף הטרפז ממוקם בגזע המוח השמיעתי. להתאים את המיקום וכיוון של מטוסי החיתוך ואתרי הזרקה בהתאם לצורך. אם האזורים במוח fluorescing של שקר הריבית קרוב מספיק למשטח המוח, כך שהם יכולים להיות מזוהים והזריקו בלי לחתוך את המוח (ראו איור 2), ולאחר מכן ניתן להשמיט את צעד חיתוך העטרה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את גוף הטרפז כשני &quot;נורות&quot; בולט הגחון המכיל את גרעין הגחון של גוף הטרפז (VNTB). </li></ol> הערה: התייחסות אנטומיים נוספת בדבר מיקום stereotactic המשוער של מטוסי חיתוך אלה, ראה פרנקלין ופקסינוס, 2008. לוח 78 לאטלס, גבחת ~ -5.7 מ&quot;מ מראה את הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (= MNTB) שכותרתו &quot;צ &quot;. לוח 69 מציג את גרעין הגחון של bo הטרפזdy (VNTB) שכותרתו &quot;MVPO&quot; (גרעין periolivary medioventral) 19. 3. אנטרוגרדית / מדרדר איתור הערה: בצע את כל הנהלים הבאים ב RT (25 מעלות צלזיוס). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החיתוך, למקם את explant גזע המוח בצלחת הכנה מכיל חומץ (95% O 2, 5% CO 2) לנתח פתרון (NaCl: 125 מ&quot;מ, KCl: 2.5 מ&quot;מ, MgCl 2: 1 מ&quot;מ, CaCl 2: 0.1 מ&quot;מ, גלוקוז : 25 מ&quot;מ, Nah 2 PO 4: 1.25 מ&quot;מ, NaHCO 3: 25 מ&quot;מ, חומצה אסקורבית: 0.4 מ&quot;מ, מיו-אינוזיטול: 3 מ&quot;מ, פירובט: 2 מ&quot;מ), המאבטחת אותו עם 30 מחטי מזרק G. ודא שהאזור של הזרקה פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך טפטפות הזרקה מהזכוכית בורוסיליקט ולמלא אותם באחד משלושת הפתרונות הבאים: א) פתרון 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר של choleratoxin מקטע-ב מצומדות לfluorophore Alexa 555 ב PBS 12-13 (משמש בעיקר לתחבורה מדרדר), ב ) -d 1%ilution מלוחים 0.9% מtetramethylrhodamine dextran 555 (3,000 מגוואט, המשמש בעיקר לתחבורה מדרדר) או ג) -dilution 1% בתמיסת מלח 0.9% 10,000 מגה וואט dextran-TRITC 555 (משמש בעיקר לתחבורת אנטרוגרדית). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח טווח התנגדויות פיפטה ההזרקה ש2.5-3.5 mOhm וכי הם מיוצרים ב 3 - 4 מחזורים מושכים. לניסויים שתוארו כאן, להשיג זאת על ידי בחירת אלגוריתם מושך מתוכנתים מראש על חולץ פיפטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאיר את explant המוח באמצעות מצביע לייזר רכוב סטטי של אורך הגל המתאים (פריט מס &#39;2 באיור 3 א; 405 אורך גל בניסויים שתוארו כאן). השתמש במצביע הלייזר כמדריך לזריקות, ולכוון את קרן הלייזר בגרעין המוח שכותרתו fluorescently או תאים של ריבית שהוזרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא ולבחון את אזור היעד המואר באמצעות מיקרוסקופ משקפת בעת לובש משקפי מסנן התואמים (450-70מסנן להקה עוברת 0 ננומטר בניסויים שתוארו כאן). הכנס את האלקטרודה ההזרקה באמצעות micromanipulator לאזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את החומר נותב. הזריקות מורכבות של 2 - 10 פעימות בלחץ 15 PSI 50 msec כל, שימוש במכשיר הזרקה בלחץ, בבימויו בניצב לאזור של העניין (ROI) בתוך קטע המוח. לנהל דופק בכל לחץ במרווחים של 10 - 15 שניות כדי לאפשר לצבע להתפשט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של זריקות tetramethylrhodamine (TRITC), גם לעורר חשמלי כדי לשפר את ספיגת הצבע באמצעות electroporation עם אלקטרודה ממוקמת באזור המוח של עניין (MNTB וVNTB בניסויים שתוארו כאן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 8 פולסים TTL של 8 וולט עבור 50 אלפיות שניים עם 50 אלפיות שניים interpulse מרווחים, מונעים על ידי ממריץ ומוגבר ל -55 V עם יחידת בידוד גירוי (פריטי מס &#39;7 ו -9 באיור 3). השתמש 10 - 20 חזרות של פרוטוקול, מינהל זהtered על פני כמה דקות 7,8. הקפד להאריק את האלקטרודה כראוי - חוט ההארקה צריך להיות מחובר לפתרון האמבטיה! </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק להצלחה של ההזרקה. מאז נותב ניאון עם אורך גל פליטה יותר גם פולט אות ניאון על עירור לייזר עם אורכי גל קצרים יותר, מבחינה ויזואלית לבדוק את ספיגת הצבע / התפשטה באזור היעד המוזרק בעת מאיר את האזור עם הלייזר וההתבוננות דרך המשקפים מסננים. </li></ol> 4. דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, דגירה brainstems בנוזל השדרתי מלאכותי מחומצן (ACSF; NaCl: 125 מ&quot;מ, KCl: 2.5 מ&quot;מ, MgCl 2: 1 מ&quot;מ, CaCl 2: 2 מ&quot;מ, גלוקוז: 25 מ&quot;מ, Nah 2 PO 4: 1.25 מ&quot;מ, NaHCO 3: 25 מ&quot;מ, חומצה אסקורבית: 0.4 מ&quot;מ, מיו-אינוזיטול: 3 מ&quot;מ, פירובט: 2 מ&quot;מ, מבעבע עם 95% O 2 - 5% CO 2) בטמפרטורת חדר (RT, 25 מעלות צלזיוס) במשך 1 - 4 שעות, ואילוהצבע הוא להיות מועבר. בועת הפתרון במשך כל תקופת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, להעביר את brainstems paraformaldehyde 4% (PFA) מומס בPBS (כ -100 מיליליטר;. PH 7 לתמהיל PFA / PBS) דגירה אותם ב 4 ° C כדי לאפשר לאחר קיבוע-לילה (O / N). </li></ol> 5. רקמות חיתוך והרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את המוח שלוש פעמים PBS (5 דקות לכל שלב כביסה), לכסות אותו באגר 4% ואז לחתוך ל50-80 מיקרומטר פרוסות עבות על vibratome. פרוסות הר באמצעות הרכבה בינונית בשקופית זכוכית, וcoverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לתייג חלקים עם Nissl פלורסנט במשך 25 דקות (לדוגמא Nissl הכחול של 1: בתקשורת AB דילול 100). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תקשורת AB, לערבב 250 מיליליטר של 0.2 M חיץ פוספט (PB; 51 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 150 מ&quot;מ Na 2 HPO 4), 15 מיליליטר 5 M NaCl, 15 מיליליטר 10% Triton-X, 220 מיליליטר DDH 2 O וalbumine סרום שור 5 גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר דודדה ולהצליח צעד Nissl תיוג על ידי 3 שלבי כביסה בPBS (10 דקות כל אחד). </li></ol></li></ol> הערה: במקרים בהם חלקים עבים צריכים להיות מותקנים ונותחו (בניסויים שתוארו כאן פרוסות כזה היו 100-500 מיקרון העבה לשמר קשרי axonal על פני מרחקים גדולים יותר), הטכניקה יכולה להיות משולבת עם סליקת רקמה. מצאנו ClearT2 12 כדי להצליח 20. כאשר צעד סליקת רקמה כלול, לבצע אותו לפני ההרכבה החלקים.

<ol>
	<li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+sections+of+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog+and+observations+of+the+alterations+produced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibers.">Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).</li><li>Fink, R. P., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+selective+silver+impregnation+of+degenerating+axons+and+their+synaptic+endings+in+the+central+nervous+system.">Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system.</a> Brain Res. 4, 369-374 (1967).</li><li>Nauta, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+silver+impregnation+of+degenerating+axons+in+the+central+nervous+system.">Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system.</a> Stain Technol. 27, 175-179 (1952).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologie+du+syst&#232;me+nerveux+de+l'Homme+et+des+vert&#233;br&#233;s.">Histologie du syst&#232;me nerveux de l'Homme et des vert&#233;br&#233;s.</a> , (1911).</li><li>Kristensson, K., Olsson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+and+retrograde+transport+of+peroxidase+in+hypoglossal+neurons.+Electron+microscopical+localization+in+the+neuronal+perikaryon.">Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon.</a> Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).</li><li>Kristensson, K., Olsson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+transport+of+protein.">Retrograde axonal transport of protein.</a> Brain Res. 29, 363-365 (1971).</li><li>Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+superior+olivary+nucleus+provides+divergent+inhibitory+input+to+parallel+auditory+pathways.">Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways.</a> J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).</li><li>Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fenestration+of+the+calyx+of+Held+occurs+sequentially+along+the+tonotopic+axis,+is+influenced+by+afferent+activity,+and+facilitates+glutamate+clearance.">Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance.</a> J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).</li><li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dextran+amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+chicken+embryo.">Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li><li>Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugates+of+horseradish+peroxidase+(HRP)+with+cholera+toxin+and+wheat+germ+agglutinin+are+superior+to+free+HRP+as+orthograde+transported+markers.">Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers.</a> Brain Res. 223, 381-385 (1981).</li><li>Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxsidase+(HRP)+conjugates+of+cholera+toxin+and+lectins+are+more+sensitive+retrograde+transported+markers+than+free+HRP.">Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP.</a> Brain Res. 231, 33-50 (1982).</li><li>Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+projections+of+lateral+posterior+thalamus+with+cingulate+and+medial+agranular+cortex+in+relation+to+circuitry+for+directed+attention+and+neglect.">Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect.</a> Brain Res. 1240, 87-95 (2008).</li><li>Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+neuroanatomical+tract-tracing+using+fluorescent+Alexa+Fluor+conjugates+of+cholera+toxin+subunit+B+in+rats.">Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats.</a> Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo-+from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Zeilhofer, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycinergic+neurons+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein+in+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice.">Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice.</a> J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).</li><li>Poyatos, I., Ponce, J., Arag&#246;n, C., Gim&#233;nez, C., Zafra, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glycine+transporter+GLYT2+is+a+reliable+marker+for+glycine-immunoreactive+neurons.">The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons.</a> Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).</li><li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bac+to+the+future:+the+use+of+BAC+transgenic+mice+for+neuroscience+research.">Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).</li><li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140, 1364-1368 (2013).</li><li>Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine:+comparison+with+the+tracer+PHA-L+in+preparations+for+electron+microscopy.">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy.</a> J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).</li><li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing.">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li><li>Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+development+of+the+calyx+of+Held+synapse.">Dynamic development of the calyx of Held synapse.</a> PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).</li><li>Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+projections+from+the+ventral+nucleus+of+the+trapezoid+body+to+the+medial+nucleus+of+the+trapezoid+body+in+the+mouse.">Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse.</a> Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).</li><li>Benson, D. A., Teas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+unit+of+binaural+interaction+in+the+auditory+cortex+of+the+chinchilla.">Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla.</a> Brain Res. 103, 313-338 (1976).</li><li>Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+pressure+transformations+by+the+head+and+pinnae+of+the+adult+Chinchilla+(Chinchilla+lanigera).">Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera).</a> Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).</li><li>Ryan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+sensitivity+of+the+mongolian+gerbil,+Meriones+unguiculatus.">Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus.</a> J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li><li>Zwicker, E., Fastl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Psychoacoustics Facts and Models. , (1990).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).</li><li>Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis.">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains.">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

כוח כללי של במבחנה electroporation נותב, בניגוד למחקרי in vivo מעקב, הוא שזה נותן לחוקרי גישה טובה יותר לאזור במוח של עניין ולכן, אינו כרוך stereotactic יקרה (ולעתים קרובות אלקטרו) ציוד. בנוסף, תקופת ההישרדות נדרשת לexplants המוח משתרעת רק כמה שעות (1 - 4) במקום ימים או אפילו שבועות במקרה של in vivo זריקות נותב (ראה סקירה מפורטת על השימוש באמיני dextran וקליעים נותבים אחרים ב בזריקות vivo על ידי Lanciego וWouterlood, 2011 22, אלא גם רודריגז-קונטררס, et al., 2008 23), כך שיכולות להיות מזוהות זריקות לא מוצלחות כבר בבמהלך הליך ההזרקה או לכל המאוחר, ביום שלמחרת, כך כי יכולים להיות מותאמים הפרמטרים ההזרקה בהתאם. תקופת ההישרדות הקצרה לexplants המוח גם אומרת שבדרך כלל יש הבדל קטן בין &lt;em&gt; יעיל לכאורה (האזור שבו הצבע שנשפך, מבלי שנלקח) אתר הזרקה (אזור, שבו הצבע נלקח על ידי תאי עצב באנטרוגרדית או מסופי axonal בזריקות מדרדר), ולמרות שהבדל זה אף פעם לא יכול לשלול לחלוטין וניתן לכמת רק / מבוקר לפוסט-הוק, אשר במקרים מסוימים יכול להיות בלתי אפשרית לחלוטין (ראה אלברכט et al., 2014 לדיון מפורט יותר 24). יש לציין את זה, כי קשרים של כמעט כל אורך ניתן ללמוד בשיטה זו, כל עוד הניסוי הוא מסוגל לשמור על שניהם באזור המוזרק ואזור היעד או מקורו של תחזיות axonal בחתיכה אחת של רקמת המוח. ההדמיה של חיבורים כאלה יכול להיות מושגת באמצעות שני השחזור של ערימות confocal תמונה שנרכשו לאחר חיתוך והרכבת המוח (כפי שמתואר כאן) או המוח כולו / טכניקות הדמיה לוח מוח לאחר ביצוע רקמה ברורהפרוטוקולי ing (ראה סעיף 5 בפרוטוקול זה לדוגמא). היתרון העיקרי של הטכניקה של בelectroporation המבחנה מונחת לייזר שלנו הוא הגידול המשמעותי במיקוד דיוק בזריקות נותב. השיטה המקורית של במבחנה electroporation מסתמכת על שליטה רק חזותית על ידי מיקוד סמנים טופוגרפיים מסוימים או להשתמש בהם מדריכים משוערים כלאזור הזרקה. הדבר נכון גם להתפשטות הצבע באזור היעד: ניתן לראות את הצבע מתפשט, אבל זה לא קל לשלוט על התפשטות הצבע בצורה עדינה יותר. עם השינוי בלייזר בשיטה זו, חוקר יכול למצוא בקלות גרעינים ותאים של עניין ולבחון את התפשטות הצבע באוכלוסיית גרעין / התא של עניין דרך האינטראקציה של הקרינה מונעת גנטי ילידים והקרינה של הצבע. לפיכך, רווחי חוקר יותר שליטה על הניסוי שלו / שלה מעקב על ידי צמצום תוצאות חיוביות שגויות בantero- או מדרדרסתימות, כי תאים / מסופים axonal מחוץ לגרעין / שטח של העניין היו מלאים במהלך ההזרקה, כמו גם. ברור, זה לא אומר ששליטה מוחלטת על האתר היעיל של הזרקה, אשר, כאמור, יכול להיות שונה מהאתר הנראית לעין. אזהרה של טכניקה זו היא כמובן הזמינות של אורגניזמים מהונדסים גנטי. עכברים הם אורגניזם מודל גנטי בשימוש נרחב במחקרים של יונקים, שהוא גם נכון לשדה השמיעה, אבל בחלק מהדגמים יונקים יכולים להיחשב טובים יותר, כי הם דומים audiogram האנושי מדויקים יותר. לפיכך, טכניקות אחרות יכולות להיות מועסקות לתייג אוכלוסיות נוירונים בבעלי החיים wildtype של מינים אחרים מתאימים יותר לסוג מסוים של שדה מחקר (למשל גרבילים או צ&#39;ינצ&#39;ילות במחקרים של מערכת השמיעה 25-28): זה יכול לכלול זריקות נגיפיות מנצלות יזמים מסוימים מיקוד רק תאים מסוימים של מוח fluoresc ולהביעסמנים אף אוזן גרון וברק קבוצת משנה של תאי מוח. באופן טבעי, טיפול נוסף צריך לנקוט כדי להבטיח את תוקפו של בונה הגנטית המתבטאת בתת-האוכלוסייה תקין של תאי עצב, לא משנה אם מבנים אלה באים לידי ביטוי באופן ויראלי בבעלי החיים wildtype או indigenously בנוק-בקווי עכבר. כפי שציין קודם לכן, את היתרון של מוטציות עכבר לבטא חלבוני ניאון בתת אוכלוסיות מסוימות של תאי עצב גם מאפשר לאפיון הפונקציונלי של מערכת חשמלית במוח (במקרה שלנו היינו יכול לאפיין תחזיות מעכבות מגרעין גזע המוח שמיעתי אחד לעוד 24 על ידי הדמיה טהורה של התוצאות של ניסויי ההתחקות שלנו). שוב, את תוקפו של בונה הגנטית הביעה צריכה להיות אישר לפני כל פרשנות של תוצאות ניסויי המעקב יכולה להתקיים. כוח כללי נוסף של electroporation במבחנה הוא התאימות שלה עם othשיטות אה אנטומיים, כגון היסטוכימיה (החיסונית) וסליקת המוח. כפי שהודגם בעבר 24, הוא אינו מושפע על ידי היישום של טכניקות צביעה נוספות כגון Nissl, או שיטת סליקת מוח הנקראת ClearT2 12 20,24. החסרון העיקרי שצריך לזכור הוא שעומק החדירה של Nissl וכתמי נוגדן יקטן עם עובי רקמה גובר, לכן יש לשקול את האפשרויות של שימור תהליך axonal בפרוסות עבות לעומת עוצמת אות של נוסף (חיסוני) histochemical צביעה בניסויים שבם יש צורך בשני שיטות התיוג אנטומיים. כמובן, גורם נוסף שיש לשקול היא הפרדת רוחב פס עירור / פליטה של ​​תוויות ניאון השונות, מאז המספר המינימלי של תוויות מתחיל בשלושה סמנים בשלב זה (ביטוי חלבון פלואורסצנטי ילידים, נותב וNissl / תיוג נוגדן). ברור, השיטה המתוארת ניתן להרחיב לזריקות של כל סוג של סמני ניאון (כוללים חרוזים קוונטים) לexplants המוח או אפילו פרוסות מוח של עכברים מהונדסים. מאז דיוק ההזרקה תלוי בשניהם, זיהוי ברור יעד (התצפית של גרעינים שכותרתו fluorescently ותאים) ושליטה עדינה יותר על הדליפה של צבע הניאון, רק אחד משני גורמים אלה צריכים להספיק לדיוק הזרקה מוגבר, גם כאשר אחר נעדר. משמעות הדבר היא כי סמנים שאינם ניאון שונים (כמו מבנים נגיפיים או וקטורים / RNA אחרים DNA) ניתן להזריק בדייקנות רבה יותר לגרעיני מוח של עניין, כל עוד גרעיני היעד גלויים לעין לנסיין. יישום זה אחרון הוא מעניין במיוחד, משום שאין electroporation כמו גם 29-30 לאפשר לספיגה יעילה של חומר DNA,, מה שהופך את השיטה שלנו כמעט אידיאלית עבור סוג זה של זריקות. החסרון היחיד שצריך להתחשב בו הוא שבונת DNA לקחת את הזמן כדי לבטא והבעיה של TI החישימור ssue מתעורר. זה להיות יכול להתגבר על ידי הקמת תרבויות פרוסה מוח organotypic 31-32 מבוסס על פרוסות מוזרקות מוח (או בלוקים רקמת המוח-פרוס מחדש), המאפשרים לשימור רקמת חיה בסדר הגודל של שבועות. וכמובן ניתן להשתמש מוטציות עכבר מהונדסים אחרות לחקור את הקישוריות של סוגים עצביים אחרים כמו תאי עצב כולינרגית (למשל בעכברי צ&#39;אט-GFP 33), מה שהופך את שיטה זו כלי תכליתי ללמוד קישוריות ופונקציונליות של מוח מעגלים (מיקרו).

על מנת להגדיר מעגל מסוים עצבי (מיקרו), יש להתחיל על ידי מציאת המשתתפים השונים של מעגל אמר, ודפוס הקשר שלהם. מאז הפרסום של וולר על neurofiber התחקות דרך lesioning 1 מגוון רחב של טכניקות מעקב neuroanatomical כבר נקבע. חלק מטכניקות אלה ניתן ליישם בנתיחה שלאחר מות רקמות קבועות 2-4, אחרים מסתמכים על התחבורה הפעילה של הצבע בתאי עצב חי, כפי שהתגלו בשנת 1971 5-6. האחרון יכול להיות מחולק חלוקה נוספת בשתי קבוצות להפלות בין שיטות ניצול של מדרדר פעיל (מהאזור המוזרק למקור של הקרנה נתון, כלומר. Somata של נוירונים שמקרינים לאמר אזור) ואנטרוגרדית הפעילה (מהזריק אזור ליעד של הקרנה נתון, כלומר. תחזיות axonal ומסופי axonal של התחבורה) נוירונים שכותרת. כמו כן, במקרים מסוימים traחומר מוזרק לתוך CER בעלי חיים שלאחר מכן לשרוד את הזריקה בכמה ימים או שבועות (בזריקות נותב vivo), ואילו במקרים אחרים מוח explanted מוזרקים ודגירה במשך כמה שעות לאחר ההזרקה בנוזל השדרתי מלאכותי (במבחנה זריקות נותב) . בפרוטוקול זה אנו שונה קיימים בטכניקת electroporation מבחנה 7-8 לתייג somata ותהליכים עצביים בניסויי אנטרוגרדית ומעקב מדרדר באמצעות dextran choleratoxin מקטע-ב וtetramethylrhodamine כחומרי התחקות. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק מדעני מוח עם כלי יעיל כדי לעקוב אחר דפוסי קישוריות עצביים בין גרעינים שונים במוח, תוך ניצול קווים זמינים מהונדסים עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק מיקוד במהלך זריקות נותב. למרות שהשיטה של ​​אנטרוגרדית ומעקב מדרדר באמצעותcholeratoxin והאמין dextran וconjugates שכותרתו fluorescently שלהם הוא לא חדש 9-13 (כמו השיטה של electroporation, למשל. et al האס. 14), השילוב של זריקות נותב עם electroporation בהכנה במבחנה מעורב בלוקים של רקמת המוח הוא התפתחות האחרונה יותר 7. היתרון העיקרי שלה על פני שיטות מעקב עצביות באמצעות אותו הסוג של צבעים נותב בבעלי חיים הוא עוצמת התיוג המוגברת, בשל היעילות גבוהה יותר שבה צבע electroporated הוא נלקח על ידי תאי עצב. יתרון נוסף הוא התקופה המקוצרת הדגירה (הנדרשת להובלת הצבע) ודיוק היעד המוגבר שלה במהלך ההזרקה נותב, כי הנסיין יש שליטה חזותית על אזור היעד של ההזרקה. האחרון גם אומר שאין צורך בציוד יקר stereotactic למצוא את אזור הגרעין או מוח של עניין. לaddiלהגדיל tionally מיקוד דיוק, אנו ניצלנו קו עכבר מהונדס, המבטא GFP בתת-אוכלוסיית glycinergic של נוירונים 15 וציוד אופטי בסיסי בהיקף של מצביע לייזר כף יד של משקפי סינון אורך גל והתאמת להקה עובר 405 ננומטר (450 - 700 ננומטר). כך, השגנו גידול משמעותי נוסף במיקוד דיוק בזיהוי אזור ההזרקה באמצעות אות הניאון שלה ועל ידי מתן דרך עדינה יותר כדי לשלוט על התפשטות הצבע בתוך אזור ההזרקה באמצעות ההתבוננות באינטראקציה בין אות ה- GFP ילידים ונותבו פלוּאוֹרסצֵנצִיָה. הטכניקה שלנו גם מאפשרת לחשוף את הפונקציונליות של מעגל יחד עם הקישוריות שלה על ידי זיהוי נוירונים מעכבים GFP החיובי (או מעוררת בקווי עכבר אחרים) שהיו מלא בנותבה. לסיכום, אנו נוספים משופרים כלי נירולוגית מדעי רב עוצמה כדי לחקור connectome של מוח החוליות ולהעריך tהוא תכונות neuroanatomical שונות של neurocircuit נתון. על ידי שימוש בעכברים מהונדסים יחד עם ציוד אופטי זול וזמין באופן נרחב הצלחנו להגביר את דיוק המיקוד שלנו באופן משמעותי הזריקות. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים אפשרו לנו לזהות את סוג הקשרים לייחס, שסייעו לחשוף את הפונקציונליות של microcircuit מעכב בגזע המוח השמיעתי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td></td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate di-basic</td>
			<td></td>
			<td>S907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td></td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td></td>
			<td>A2153</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td></td>
			<td>X100</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td>
			<td></td>
			<td>P2139</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F84</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choleratoxin subunit-b</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-34776 (Alexa 555)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-7162 (Alexa 555)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Nissl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479 (blue)</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbi-tal</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>Fatal-Plus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass filaments</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>G150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Zeitz Instruments, Germany</td>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion setup</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser pointer&#160;</td>
			<td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td>
			<td>HK-88007294 (405 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter/safety goggles</td>
			<td>Dragon Lasers, China</td>
			<td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bionocular microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td>Wild M3</td>
			<td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with installed MC Stimulus software</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel stimulator</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td>
			<td>STG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I., Israel</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

אנו מציגים טכניקה המשלבת במבחנה פרוטוקול הזרקה נותב, אשר עושה שימוש בסדרה של פולסים חשמליים ולחץ כדי להגדיל את ספיגת צבע באמצעות electroporation בexplants המוח עם תאורת לייזר ממוקדת ומשקפי מסנן התאמה במהלך ההליך. הטכניקה המתוארת של electroporation במבחנה על ידי עצמו מניבה שליטה חזותית טובה יחסית לה ממוקדים באזורים מסוימים של המוח. על ידי שילוב של זה עם עירור לייזר של סמנים גנטיים ניאון וקריאה דרך המשקפים מסננים-עובר להקה, שיכול להרים את הפליטה של תאים / גרעינים שכותרתו גנטית וצבע איתור הניאון, חוקר יכול להגדיל באופן משמעותי את דיוקם של זריקות על ידי מציאת השטח של עניין ושליטה לצבע-התפשטות / הספיגה באזור ההזרקה ביעילות רבה יותר. בנוסף, טכניקת תאורת הלייזר מאפשרת ללמוד את הפונקציונליות של neurocircuit ניתנו על ידי providing מידע על הסוג של הנוירונים מקרינים לאזור מסוים במקרים שבהם הביטוי של GFP קשור לסוג של משדר מתבטא בתת-אוכלוסייה של תאי עצב.

נתונים מראה 1 ו -2 איך מצביע לייזר ומשקפי בלייזר יכולים לשמש לגנוטיפ במהירות ובזול חיות חיוביות GFP מהמלטה. במקרים של גורי עכבר צעירים, הטכניקה יכולה לשמש כדי לזהות noninvasively תווית ה- GFP במוח של החיה דרך הגולגולת והעור שמעליה (איור 1 א - ד). הקרינה נפלטת ניתן לראות דרך העור והגולגולת של גורי עכבר לפחות עד יום לידה 3 (איור 1 ג). ההליך מוצג באיור 1 לחלבון ירוק-הניאון שלנו (GFP) שכותרתו קו העכבר להביע GFP בתת-האוכלוסייה שלה glycinergic של נוירונים (GlyT2-GFP). בבעלי חיים מבוגרים עם גולגולות עבות יותר ועור פיגמנט, תווית GFP מציגה פחות טובה דרך עור ועצמות, ולכן העור על הראש ו / או צוואר צריך להסיר לפני genotyping האופטי (איור 2 א). לאחר מרוססבעלי החיים המוח נלקחים החוצה ומואר שוב כדי למצוא את הגרעינים שכותרתו fluorescently של עניין. המבנים הבהירים שמאירים קרוב לפני שטח הגחון של גזע המוח באיור 2 הם שני גרעיני הגחון של גוף הטרפז, שבו אנו משמשים כשני מדריך ויעד לזריקות נותב. איורים 4 ו -5 להראות תוצאות נציג הזרקת אנטרוגרדית לתוך גרעין הגחון של גוף הטרפז dextrane tetramethylrhodamine באמצעות (VNTB) (TRITC;. איור 4) ושתי זריקות מדרדר לתוך הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (MNTB) באמצעות מקטע-ב choleratoxin (CTB; 5A דמויות ו B) וTRITC (5C דמויות ו- D). תיוג axonal בהיר מצביע (במקרה זה מעכב) תחזיות מVNTB לMNTB ניתן לראות הבא הזרקת אנטרוגרדית לVNTB (איור 4). דמויות 5A ו5C להראות סקירה על האתרהזרקה (MNTB) עם הגרעין המכיל את תאי שכותרת retrogradely (VNTB) לידו. איורים תמונות מוגדלות מופע 5 ו5D של retrogradely כותרת somata של תאי VNTB glycinergic בהם החלקים כמוצגים באיור 5 א &#39;ו -5 ג. שים לב איך המעקב המדרדר עם CTB תוצאות בדפוס יותר punctate 12-13 (איור 5), ואילו תאי VNTB כותרת retrogradely עם TRITC להציג תיוג צפוף מאוד כמו Golgi-21 (איור 5D). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53333/53333fig1.jpg" /> איור 1:. עכברים האופטי Genotyping של GlyT2-GFP חיובי וGlyT2-GFP-שלילי עכברי GFP החיובי צולמו תחת () תנאי תאורה רגילים, (ב) על תאורת לייזר עם מצביע לייזר 405 ננומטר ללא ירוק משקפי סינון ו- (ג)על תאורת לייזר עם משקפי בטיחות הלייזר וUV. אות ה- GFP חזקה גלויה באזור שמעל המוח הקטן וגזע המוח. (ד), לעומת זאת, גורי GlyT2-GFP-שלילי מאותו קו העכבר והגיל (P2) לא מראים שום סימנים של הקרינה באותם האזורים ( חלק אחורי של הראש וחוט השדרה). אור הלייזר הכחול מסונן ביעילות על ידי המשקפים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53333/53333fig2.jpg" /> איור 2: האופטי Genotyping וexplant המוח הוכן. גולגולתו של גור עכבר () P4 GlyT2-GFP חשוף לתאורת לייזר ונצפתה דרך משקפי סינון להקה עוברת. GFP שזורח בניתן לצפות דרך הגולגולת. Explant המוח (ב &#39;) מאותו הגור בצלחת הכנה על תאורת לייזר, כפי שניתן לראות דרך משקפי הסינון. האקסונים Glycinergic וגרעינים מוח, כגון גרעין הגחון של גוף הטרפז (VNTB) ניתן לראות כVerמבני y בהירים קרובים למשטח המוח. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53333/53333fig3.jpg" /> איור 3: סקירה כללית במהלך במבחנה הזרקה בלחץ והתקנת Electroporation. stereoscope, 2: 1 () מצביע לייזר רכוב (אורך גל nm 405), 3: headstage עם פיפטה הזרקה רכובה על micromanipulator, 4: צלחת הכנה המכילה את explant המוח, 5: מחשב עם תוכנת Stimulus MC מותקן, 6: מכשיר לחץ הזרקה, מחובר לפיפטה ההזרקה דרך צינורות (ב) 7:. יחידת גירוי בידוד, 8: הפנס בעוצמה גבוהה, 9: ממריץ. ממריץ מחובר לאלקטרודה בפיפטה באמצעות יחידת בידוד גירוי ומונע על ידי המחשב. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53333/53333fig4.jpg" /> איור 4: איתור אנטרוגרדית של חיבורים מעכבים מVNTB לגרעין המדיאלי של גוף הטרפז (MNTB). מוצגת היא השלכה המרבית של מחסנית confocal נלקחה בפרוסה אופקית פורש כ -200 מיקרון בעומק במוח פינה של עכבר GlyT2-GFP P14. בעקבות הזרקת dextrane tetramethylrhodamine (TRITC) לחלק caudo-המדיאלי של VNTB, שכותרתו במאור קשרי axonal (ובמקרים מסוימים הסופים טרמינל) מVNTB לMNTB ניתן לצפות. בר סולם: 200 מיקרומטר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53333/53333fig5.jpg" /> איור 5:. מדרדר זריקות נותב לMNTB לחשוף מלאה תאי Glycinergic בVNTB מוצגים הם תחזיות המרביות של ערימות confocal נלקחו בפרוסות העטרה של P88 (A, B) וP80 (C, D (המשתרעות על כ -50 מיקרומטר.) הזרקה) עכבר GlyT2-GFP. (א) סקירה של choleratoxin מקטע-ב (CTB) לחלק המדיאלי של MNTB. (ב) תאי Glycinergic בVNTB מלאים CTB (puncta האדום בתוך somata התא) כתוצאה מההזרקה שמוצגת באיור 5 א. חלק מpuncta מופיע מחוץ לתאים, אשר יכול להצביע על סוגי תאי GFP-שלילי (לא glycinergic) אחרים בVNTB להיות מלאה, כמו גם (בגלל סיבים פצועים של מעבר באזור ההזרקה, למשל) . (ג) סקירה נוספת של הזרקת TRITC מדרדר מיקוד MNTB. הערה, איך מספר התאים מלא בTRITC בMNTB הבא electroporation (בניגוד לCTB הטהור-הזריק לחץ באיור 5 א &#39;). תיוג מדרדר של תאי VNTB glycinergic לאחר הזרקת TRITC בMNTB (אותו הזרקה (D) כפי שמוצג באיור 5 ג). רוב התאים להציג תיוג צהוב או כתום צפוף, בגלל התערובת של שני אותות ניאון (הביטוי של GFP ילידים והמילוי עם TRITC האדום). השווה עם תא GFP חיובי שמסיבה כלשהילא לקח את הצבע (חץ כחול) ותא ה- GFP-שלילי שכותרתו נותב מופיע עמוק אדום ואולי מלא, בגלל פציעת axonal באזור ההזרקה (חץ אדום). שים לב לדפוס הצביעה שונה של תאי סומא בזריקות נותב מדרדר באמצעות CTB (איור 5) וTRITC (איור 5D). ברים סולם: 5A דמויות ו5C: 200 מיקרומטר, איורים 5 ו5D: 20 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants at JoVE.com

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי בסיסי כדי להגדיל את דיוק תיוג.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  University of Colorado School of Medicine.  אנו מתארים טכניקה לתייג נוירונים והתהליכים שלהם באמצעות זריקות אנטרוגרדית או נותב מדרדר לגרעיני מוח באמצעות הכנה במבחנה. אנחנו שונה בשיטה הקיימת שלי n המבחנה electroporation נותב על ידי ניצול של שכותרתו fluorescently מוטציות עכבר וציוד אופטי ...

Video: Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

ניסויי נוירו-רובוטית לולאה סגורה כדי לבדוק את מאפיינים חישובית של רשתות עצבי

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

עקיבה Neuroanatomical רטרוגרדית של הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...