وتدعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة وDC052256 DC006015 ، وجبهة الخلاص الوطني 0324769 لQG - T32 وDC008072 لدرجة البكالوريوس.

1. إعداد هذا الإجراء هو السلامة الأحيائية المستوى 2 ، وبالتالي يتم إجراء جميع الاستعدادات التالية في غطاء بيولوجية حيث يتم تنفيذ الإجراء microinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وتسخين) أ (37 درجة مئوية اتربيد : تعبئة كيس من البلاستيك مع تخزين المياه -- الختم وتعيين على حاضنة التدفئة كتلة تفرغ. هذا سيسمح لاسترداد حقن الفئران التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حاوية نفايات بيولوجية مع التبييض 10 ٪ على حجم مناسب لغمر جميع النفايات الناتجة عن هذا الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق صغير مفتوح من الايثانول 70 ٪ والثاني مع طبق ddH2O تعقيمها ومكان في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم المحاقن a 5μL هاميلتون القدرات مع إبرة عيار 33 عن طريق الرش أسفل الجسم والإبرة مع 70 ٪ من الإيثانول مع المكبس انسحب كل وسيلة. نضح مرارا الايثانول من الطبق وطرد من كل وسيلة ما لا يقل عن 5 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف خرطوشة المحاقن المعقمة للمياه من قبل الشفط وطرد ما لا يقل عن 5 مرات. مكان الحقنة جانبا بأمان في غطاء المحرك والثقافة ، واتركه حتى يجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المخزونات الفيروسية من -80 درجة مئوية والتخزين المجمد مكان على الجليد للسماح للذوبان. Microinjection يتطلب 2μL المخزون الفيروس في الماوس في وحدات عيار 9 10 المعدية / مليلتر. ويمكن الحصول على Lentiviruses من مصادر تجارية أو المنتجة في المختبر وفقا لبروتوكول محدد (لويس وآخرون ، 2002). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد مرحلة الحقن التي توفر مساحة أثيرت فوق سطح القلنسوة -- يمكن استخدام طبق الثقافة 10cm مغطاة بغطاء من Kimwipe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب مناديل الكحول بالقرب من محطة ضخ. </li></ol> 2. Microinjection الجسيمات lentiviral في الظهارة الشمية تتم جميع الإجراءات الحيوانات التي أجريت في هذه الطريقة وفقا لمبادئ توجيهية IACUC المعتمدة. وسلالة العضلة المصحف C57BL/6J هو النموذج الحيواني المستخدمة في جميع التجارب أثبتت هنا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الجراء الماوس بواسطة حرارة الجسم عن طريق اتخاذ ماوس الجرو (P0 - P3) للخروج من قفص ووضع القفازات الجرو على خفض مفتوحة على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في انتظار أن الجرو تخدير كامل ، 2μL نضح من الأسهم الفيروسية في المحاقن المعقمة هاملتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على رأس الجرو المرحلة الحقن. برفق الجلد بعيدا عن الجزء العلوي من الرأس على الأذن نحو الجزء العلوي من الرقبة. هذا يجب أن توفر أكثر من سطح الجلد تدرس تجويف الأنف وسيخفف الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال ابرة من خلال الجزء العلوي من تجويف الأنف عن 3mm تحت سطح الجلد لتصل إلى الظهارة الشمية. Microinject 0.5μL حل الفيروس في النار ، واختيار موقعين لكل جانب ، كل من اليسار واليمين (أربع حقن في الماوس = مجموع 2μL فيروس الحاجة). وينبغي حقن مواقع متداخلة وبصرف النظر عن بعضها البعض. لاستهداف مواقع الحقن ، البحث في السطح الظهري للجمجمة الخطوط العريضة للالبصلة الشمية. هذا الخط هو بالكاد مرئية عند الولادة عن طريق الجلد شبه شفافة والجمجمة. لجعل حقنتين لكل جانب ، وتهدف حقنة واحدة فقط لمنقاري مخطط لمبة واحدة في كل محور وسطي. جعل الإدراج second الوحشي على مخطط لمبة ، بعد التأكد من زاوية حقن بذلك بشكل إعلامي التي قد تصل إلى الظهارة الشمية التي تتواجد ventrally تحت المصباح. تجنب اختراق البصلة الشمية! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الجافة أي حل الفيروس المتبقية أو الدم التي قد هرب من موقع الحقن أو فتحات الأنف باستخدام Kimwipe. التخلص فورا من Kimwipes في حاوية السائل التبييض المخفف بيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على حقن الحاضنة اتربيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1-4 لجميع الفئران ليتم حقنه ، وتذكر أنك سوف تحتاج حوالي 2μL المخزون الفيروس في الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الفئران على استعادة الحاضنة اتربيد لمدة 30 دقيقة قبل أن تعود لهم قفصهما تداخل الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخلص من المرحلة microinjection ، وتقضي على أي ورقة التعقيم والتنظيف منتجات إضافية في التخلص من السائل تبييض بيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف حقنة هاملتون التي تطلع المتكررة وطرد من الايثانول والماء ثم حدث في خطوات الإعداد. السماح للحقنة لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق الكفاءة القصوى تنبيغ تكرار هذا الإجراء مرة أخرى في 4 ساعات. ويمكن تصور OSNs المصابة في طول الخلية في عدد قليل من ثلاثة أيام. </li></ol> 3. المناعية تعويم المقاطع البصلة الشمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الماوس حقنه في نقطة الوقت المطلوب ونضح إصلاح الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4 ٪. تشريح خارج OB. في احتضان بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها ومن ثم السكروز 30 ٪ في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها. تضمين المتوسطة في تضمين أكتوبر على الجليد الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم الحصول على الاكليلية أقسام التوليد في 60μm في السمك باستخدام ناظم البرد. اكتساح المقاطع بصلة الى الثقافة 10cm الطبق مع 1X PBS 5mL (الرقم الهيدروجيني 7.4). ينبغي أن تظل أبواب العائمة في برنامج تلفزيوني للسماح للأكتوبر دissolve. نقل مقاطع العائمة وPBS إلى قارورة 50mL المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتسوية المقاطع في الجزء السفلي من القارورة. فراغ قبالة PBS دون امتصاص أي المقاطع. شطف أقسام الأنسجة مع PBS 20mL. كرر الخطوات تسوية وكنس. Resuspend الأنسجة مع PBS 10ML والمقاطع نقل العائمة إلى a قنينة مخروطية 15mL لimmunostaining. مرة واحدة وقد استقر أقسام الأنسجة ، وفراغ قبالة طاف PBS دون إزعاج الأنسجة. أقسام Resuspend مع 0.3 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني 1X ، ودرجة الحموضة 7.4 (PBS - TX) السماح لالمنظفات خرم أغشية الخلايا. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فراغ قبالة حضانة وطاف مع تكرار PBS - TX مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أقسام الأنسجة في 10ML عرقلة الحل (5 ٪ مصل الخيل في برنامج تلفزيوني - TX) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف حل حجب مرتين على الأقل مع PBS - TX لمدة 15 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2mL حل الضد الرئيسي في برنامج تلفزيوني - TX. انظر الكواشف والمعدات اللازمة لقسم الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال برنامج تلفزيوني second - TX تغسل بمحلول حجب الأضداد الابتدائي. احتضان على منصة ببطء هزاز (~ 30rpm) في 4 درجات مئوية لمدة 24-48 ساعة لضمان تغلغل شامل في أقسام عائمة 60μm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة ، يمكن استرجاع الحل الضد الأولية باستخدام ماصة بعناية وتخزينها في 4 درجات مئوية لإعادة استخدام ما يصل الى اثنين مرات أكثر في غضون اسبوعين من دون أي خسارة كبيرة في كثافة تلوين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات في أقسام PBS - TX لمدة 20 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة مع دوران طيف (~ 30rpm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2mL التخفيف الضد الثانوية في برنامج تلفزيوني - TX. فراغ قبالة تغسل الماضي والثانوية إضافة إلى أبواب الحل الضد الأنسجة. التفاف خارج القنينة في تلطيخ رقائق الألومنيوم لمنع الخفيفة ، التي يمكن أن تسبب photobleaching fluorophore. قنينة ملفوفة مكان على منصة هزاز ببطء واحتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الثانوية حل الضد من قبل كنس بعيدا. يغسل مرة واحدة مع أقسام PBS - TX لمدة 20 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة. شطف مرتين إضافية مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 20 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة. تحميل المقاطع نسيج ملون على الزجاج باستخدام الشرائح Fluoromount G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشاشة من خلال المقاطع الملون لالمحاوير OSN المصابة بشكل إيجابي ومصطلحات محوار مع المجهر الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء عرض ثلاثية الأبعاد من محور عصبي OSN وصفت والشجرة المحطة ، وجعل سلسلة من المقاطع البصرية من خلال 60μm عمق النسيج شريحة المستهدفة اوبي (على طول المحور z) باستخدام المجهر مبائر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن في وقت لاحق هذا كومة من الصور ذات مقطع Z المتوقع أن تكون معا لاعادة بناء 360 درجة منظور الدورية للمحور عصبي واحد OSN المكتوب ، بما في ذلك التفاصيل محطة الشجرة بكاملها. يمكن التقاط أي واحد واحد وزاوية دوران تصديرها كملف صورة (أي JPG ، TIFF) لعرض شكل 2d. </li></ol> 4. ممثل النتائج مع الأساليب المذكورة هنا ، يمكننا أن الخلايا العصبية الحسية الشمية تنبيغ بواسطة الفيروسة البطيئة في الجسم الحي. وبالتالي لدينا تصور بعيد OSNs المصابين GFP والمراسلين mCherry الفلورسنت ، وكذلك مع myc الموسومة انصهار بروتين عبر كيمياء سيتولوجية مناعية. هذه التقنية توفر وفرة من OSNs المصابة. لا يزال ، تنبيغ يحدث بشكل متقطع بما يكفي لتوفير OSNs المسمى بشكل فردي ، وبالتالي السماح لتحليل مورفولوجيا خلية واحدة. يتم تصوير المحاور والمحطات محوار داخل أقسام النسيج OB وسط بيئتهم الأصلية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 1). ويمكن عادة بأكملها OSN محوار محطة جذع يكون أسيرا داخل القسم 40 50μm البصرية. التكبير عالية من المصابين محطات محوار OSN يسمح تحليل مفصل للمورفولوجيا جذع محواري في طبقة الكبيبي. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> الشكل 1. immunostained مسار واحد الشمية المحوار العصبية الحسية والشجرة في المحطة. أ) القسم الاكليل من البصلة الشمية من ماوس P7 تظهر طبقة العصب الشمي (y. قل) لالمرصد المغربي للسجون (الحمراء) ، وطبقة كبيبي (GL) immunostained مع كل من المرصد المغربي للسجون وVglut2 (الرمادي). وحيدة الخلايا العصبية الحسية الشمية محوار معربا عن GFP (الخضراء) داخل يسافر y. قل وتخترق بنية الكبيبي. B) ومورفولوجيا محوار شجرة داخل محطة الكبيبة أبرزت بوضوح من خلال التعبير GFP. Vglut2 شارك في تلوين باللون الرمادي تضيء مساحة إجمالية glomular ضمنه GFP إيجابية محوار يشرح abor المحطة. C) OSNs المصابة Lentiviral معربا عن GFP (الأخضر) في عمر الفاروق. يظهر cytostructure من الظهارة الشمية مع تلوين دابي (الأزرق). GFP التعبير التصور يسمح للهيئات OSN الخلية والعمليات الخلوية في عمر الفاروق. د) محوار OSN ومورفولوجية لها مع محطة Rap1GAP2 التعبير نهدم تلو shRNA. Lentiviruses كاسيت يحمل التعبير المزدوج مع shRNA Rap1GAP2 تحت المروج U6 الماوس وتحت GFPطبقت CMV المروج لعمر الفاروق. عرضت محطات المصابة محوار الشم أكثر مبسطة شجرة الطرفية عند مقارنة ذلك من السيطرة GFP فقط. = شريط 20μm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

هذا البروتوكول هو السلامة البيولوجية المستوى 2 المتوافقة. وقد وضعت جميع احتواء النفايات مساحة العمل المناسبة ، والحماية الشخصية ، والفيروسية التدابير تبعا لذلك. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لمبادئ توجيهية الحيوانية IACUC.

Microinjection النتائج الفيروسة البطيئة في نقل الجينات ثوابت دائمة في الحمض النووي الجيني OSN. هذا الأسلوب يتيح لنا تأدية معالجات قصيرة الأجل أو طويلة الأجل من الجينات عبر مرشح أو overexpression shRNA بوساطة تدق إلى أسفل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا تسمية fluorescently OSNs واحد في خط الماوس الم...

Microinjection : تم microinjected الفئران حديثي الولادة باستخدام محقنة 5μL هاميلتون (هاميلتون # 7647-01) مزودة إبرة قياس 33 (هاميلتون # 7762-06). الكواشف كيمياء سيتولوجية مناعية : الأضداد الأساسي : GFP الأرنب الضد النسائل المتعددة (المسابر الجزيئية # A - 6455) ، الأجسام المضادة ضد متعدد النسائل الدجاج المرصد المغربي للسجون (المخصصة) (تشن وآخرون ، 2005) ، غينيا الخنازير الأجسام المضادة ضد متعدد النسائل VGlut2 (ميليبور # AB2251). الأجسام المضادة الثانوية : Cy2 - مترافق حمار المضادة للأرنب (جاكسون Immunolab # 711-225-152) ، حمار ، مترافق Cy3 - المضادة للدجاج (جاكسون Immunolab # 703-165-155) وCy5 مترافق الماعز المضادة للخنزير غينيا (جاكسون Immunolab # 106-175-008). وقد شنت المقاطع على الشرائح الزجاجية مع G Fluoromount (جنوب بيوتك # 0010-01) مع الحل 50ng/mL ونين دابي وصمة عار. وقد اتخذت Z - كومة الصور باستخدام المجهر أوليمبوس Flouview FV1000 مبائر والصور التي تم جمعها ومعالجتها في التوقعات 3D باستخدام أوليمبوس اقتناء 2.01 - FV10 ASW مبائر وبرامج التحليل : مبائر التصوير.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

تطوير دارة الشمية دقيق يعتمد على التوقع الدقيق لمحاور عصبية حسية شمية (OSN) عصبون إلى أهدافهم متشابك في البصلة الشمية (OB). ليست هي الآليات الجزيئية للنمو واستهداف محوار OSN مفهومة جيدا. التلاعب في الجينات وتصور لاحقة من المحاور OSN واحد والتشكل على جذع محطة حتى الآن كان تحديا. لدراسة وظائف الجينات على مستوى خلية واحدة ضمن إطار زمني محدد ، قمنا بتطوير تقنية lentiviral قائم على التلاعب في الجينات OSNs في الجسم الحي. يتم تسليم الجزيئات Lentiviral لOSNs بواسطة microinjection في الظهارة الشمية (OE). ثم يتم التعبير أشرطة متكاملة بشكل دائم في جينوم OSNs transduced. الأخضر التعبير بروتين فلوري يحدد الخطوط العريضة OSNs المصابين ومورفولوجيا بكاملها ، بما في ذلك محطة جذع محور عصبي. بسبب الفترة الزمنية القصيرة بين microinjection وكشف المراسل ، يمكن أن تركز دراسات وظائف الجينات خلال فترة ضيقة جدا من التنمية. مع هذا الأسلوب ، فقد اكتشفنا التعبير GFP ضمن عدد قليل من ثلاثة أيام ، وما دامت ثلاثة أشهر بعد الحقن. لقد حققنا كل من الإفراط في التعبير وshRNA بوساطة المغلوب بنسبة microinjection lentiviral. هذا الأسلوب يوفر morphologies مفصلة الهيئات الخلية OSN والمحاور على مستوى خلية واحدة في الجسم الحي ، ويسمح بالتالي توصيف وظيفة الجين مرشح خلال تنمية حاسة الشم.

Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo at JoVE.com

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

نقدم تقنية للتلاعب الجيني lentiviral والتصور وحيدة الخلية العصبية الحسية الشمية محوار في محطة وتشجر<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;.

الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K Views.  University of California, Davis. نقدم تقنية للتلاعب الجيني lentiviral والتصور وحيدة الخلية العصبية الحسية الشمية محوار في محطة وتشجر في الجسم الحي.

Video: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

تحليل الردود من الخلايا العصبية الحسية الشمية ماوس باستخدام تسجيل Electroolfactogram الهواء المرحلة

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

استهداف الخلايا العصبية عن طريق الجمع بين البصلة الشمية في فيفو Electroporation وGal4 محسن المستندة إلى خطوط مصيدة اسماك الزرد

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

كله من جبل Immunolabeling الشم مستقبلات الخلايا العصبية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الهوائي

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.