אנו מודים א ריקיו להערות מועיל לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה במימון רפואי (MRC) מחקר ליחידת ביולוגיה של התא ועל ידי האדם Frontier Science Program גרנט (RGP0048/2009-C).

1. תגובת אנזימתי - יום 1 (1 שעה אחר הצהריים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הראשון הוא להכין 10-20 תגובות אנזימטיות עצמאית שבה IP 6 K1 או VIP1 להמיר IP 6 ל isoforms pyrophosphorylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים ב-IP שלו 6 K1 ו-GST Vip1 אנזימים מטוהרים מן E. coli לפי הפרוטוקול קודם לכן תיאר 17,18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 תגובות μL המכיל 1X חיץ תגובה (30 mM Hepes pH 6.8, 50 mM NaCl, 6 מ&quot;מ MgSO 4, 1 mM DTT), 6 PhosphoCreatine מ&quot;מ (PCR), 25 U / mL CreatinePhosphoKinase (CPK), 5 mM ATP (Mg מלח), 0.3 mM IP6, 0.05-0.1 מיקרוגרם-IP שלו 6 K1 או GST-Vip1. כוונן את עוצמת הקול עם MiliQ DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה ספין התגובה לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה. </li></ol> 2. ג&#39;ל polyacrylamide הליהוק וטעינה - יום 2 (4 שעות אחר הצהריים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל polyacrylamide מוכן באמצעות 24 ס&quot;מ אורך, 18 ס&quot;מ צלחות זכוכית רחב 1.5 מפרידי רחב מ&quot;מ. בדרך כלל בסמטה 16 או מסרק נתיב יחיד preparative משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת (50 mL / ג&#39;ל) המכיל את הדברים הבאים: 35.5% (w / v) Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:01, 1X טריס / borate / EDTA (TBE), 0.05% (w / v) persulfate אמוניום (APS ), 0.05% (w / v) Temed. יוצקים את תערובת בין טרום casted לוחות זכוכית, הכנס את המסרק ולתת לפלמר במשך 30-60 דקות בכל RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל יש polymerized, להעביר את מנגנון לחדר קר מראש לרוץ TBE 1X למשך כ 30-60 דקות ב 200-300 וולט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1X של OrangeG צבען (10 mM טריס-HCl pH7.0, 1 mM EDTA, גליצרול 30%, 0.1 OrangeG%) לתגובה כל אחד. הכן מדגם המכיל 2 nmol IP של 6 כדי לטעון כביקורת רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו ביסודיות עם כל טוב מפעיל המאגר באמצעות מזרק ומחט 21G להסיר כל המשקע, ואז לטעון את הג&#39;ל. הימנע טעינה על בארות לוואי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ג&#39;ל לילה בבית 450-550 וולט (7 mAmp / ג&#39;ל), עד שהלהקה לצבוע OrangeG הוא בתוך 10 ס&quot;מ האחרונה מתחתית הג&#39;ל. </li></ol> 3. בידוד ה-IP של 7 - יום 3 (4 שעות) יום 4 (07/06 SpeedVac שעה תהליך הייבוש) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את המנגנון ג&#39;ל ובזהירות להסיר את אחד צלחת זכוכית עוזב את הג&#39;ל על השני. חותכים חלק קטן מן הג&#39;ל מעל הלהקה לצבוע OrangeG לתחתית המכיל את תקן ה-IP 6 ואחד במסלול מדגם, כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם לחתוך את החלק של הג&#39;ל עם Toluidine כחול (0.1% (w / v) toluidine כחול, 20% (w / v) מתנול, 2% (w / v) גליצרול) במשך כמה דקות (1-3 דקות) או עד pyrophosphate אינוסיטול הלהקה מופיעה. שים את צלחת זכוכית הוסרו בעבר חזרה על גבי ג&#39;ל כדי למנוע את הג&#39;ל בלא כתם מהתייבשות. </li></ol> להקת ה-IP 7 צריך להיות גלוי מאז הוא פועל מעט איטי יותר מאשר תקן ה-IP 6. ה-ATP, אשר פועל מהר יותר מאשר 6 IP, צריך גם להיות גלוי (איור 1). מעבירים את החלק המוכתם של הג&#39;ל בתמיסה דה מכתים (20% (w / v) מתנול) במשך כמה דקות, לשטוף את כל העולה על Toluidine כחול למקם את הג&#39;ל עם הג&#39;ל בלא כתם. אם להדמיה של יותר isoforms אינוסיטול pyrophosphorylated (IP ו-IP 8 9) נדרש, הכתם ג&#39;ל עם פתרון מכתים כחול Toluidine במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את בלו Toluidine עם פתרון דה מכתים במשך כ -15 דקות. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סכין גילוח לחתוך את להקת ה-IP 7 על החלק בלא כתם של ג&#39;ל באמצעות כהפניה את עמדת ה-IP 7 נודדות נקבע עם הג&#39;ל צבעונית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את להקת ה-IP 7 כי נחתך מן הג&#39;ל על שפופרת 15 מ&quot;ל והוסף 10 מ&quot;ל של MilliQ DDH 2 O. שים צינורות סיבוב במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מחק את הנוזל כדי להסיר עודף של חלקיקי acrylamide TBE ו מיקרוסקופיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לבצע שתי התייבשות-הידרציה מחזורים. הוסף 5 מ&quot;ל של 50% (w / v) מתנול אל הצינור עם ג&#39;ל המכיל 7 IP ולסובב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. מעבירים את הפרוסה ג&#39;ל לצינור חדש 15 מ&quot;ל המכיל 5 מ&quot;ל של MilliQ DDH 2 O ולסובב בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות. אין להשליך את מתנול MilliQ H 2 O מן הצינורות. חזור על מחזור התייבשות-הידרציה עוד פעם מחדש על ידי העברת ג&#39;ל polyacrylamide ב 15 צינורות מ&quot;ל השתמשו בעבר. אחד שוטף יכול להתבצע במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכז את ה-IP eluted 7, יבש 10 מ&quot;ל יחד (5 מ&quot;ל MilliQddH 2 O ו - 5 מ&quot;ל 50% (w / v) מתנול) באמצעות SpeedVac מחומם על 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגימות הם כמעט יבש, להעביר את הנוזל הנותר (300-600 μl) אל צינור a1.5 מ&quot;ל צנטריפוגות ספין 2 דקות בסל&quot;ד 5000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatant ולהעביר לתוך צינור צנטריפוגות טריים 1.5 מ&quot;ל; לעזובμL התחתונה 20-30 שכן הוא עשוי להכיל חלקיקים acrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך להמשיך את תהליך הייבוש באמצעות SpeedVac מוסק. ההתאוששות של ה-IP 7 מצטמצם באופן דרמטי אם הדגימות להתייבש לחלוטין, ולכן לסיים את תהליך הייבוש כאשר הדגימות להגיע נפח μL 100-300. </li></ol> 4. קביעת ריכוז 7 טוהר ה-IP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2-5 μL של המדגם התאושש IP 7 לרוץ על ג&#39;ל דף, בדומה סעיפים 2.2-2.5. טען דילולים מספר 6 של ה-IP (כלומר, 0.5, 1, 2, 4 nmol) כסטנדרט ריכוז 4 nmol של סמן Poly-P. לאחר הפעלת ג&#39;ל, לדמיין את isoforms pyrophosphate אינוסיטול ידי מכתים ו-de מכתים את הג&#39;ל שלם עם פתרון Toluidine כחול, בעקבות ההליך המתואר בסעיף 3.2 (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכתים Toluidine, ריכוזי ניתן לקבוע על ידי סריקת הג&#39;ל ומשווה את ההבדלים בעוצמת בין 6 IP ו-IP 7, באמצעות תוכנת הדמיה כגון J-תמונה, כפי שמוצג באיור 2B. </li></ol> 5. נציג תוצאות: ההמרה preparative האנזימטית של ה-IP ל-IP 6 7 IP באמצעות אנזימים 6 K1 ו VIP1 ניתן לפתור בקלות באמצעות ניתוח PAGE (איור 1). הטעינה של 6 IP כביקורת גודל יחד עם מכתים ג&#39;ל כחול Toluidine מאפשר זיהוי derivates pyrophosphorylated, שכן הם לרוץ לאט בהתאם למספר קבוצות פוספט הנוכחי על הטבעת אינוסיטול. ההליך המתואר לעיל מאפשרת טיהור קל של 7 IP. ניתוח pyrophosphate אינוסיטול מטוהרים על ידי גילה את הטוהר של ה-IP שלנו 7 (איור 2 א). מעניין, 5 1/3PP-IP האיזומר של מוצר ה-IP של 7 VIP1 נודד מעט איטי יותר מאשר האיזומר 5 5PP-IP של 7 IP שנוצר על ידי ה-IP 6 K1. שימוש של 6 תקנים IP היתר כימות קל של ריכוז ה-IP מטוהרים 7 (איור 2B). לפני השימוש 7 IP עבור ניסויים נוספים, הפעילות הביולוגית שלו ניתן להעריך (איור 3). 5PP IP-5 הוא מודגרות עם VIP1 ועם phosphatase 7 IP DDP1 (phosphohydrolase diphosphoinositol polyphosphate). באופן שגרתי, את ה-IP מטוהרים 7 מומר IP 8 על ידי VIP1 ו-IP 6 על ידי DDP1 (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig1.jpg" /> איור 1:. מכתים Toluidine הדף ובידוד של הלהקה 7 IP החלק של ג&#39;ל המכיל את תקן (IP 6) נחתך ומוכתמת באמצעות פתרון כחול Toluidine. שלוש להקות מייצגים (מלמעלה למטה) IP 7, 6 ו - IP-ATP. החלק המוכתם של ג&#39;ל היה מיושר אז עם הנותרים של הג&#39;ל. זה מאפשר לוקליזציה של החלק של ג&#39;ל המכיל 7-IP, אשר לאחר מכן ניתן לחתוך מטוהרים (תיבת מקווקו). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig2.jpg" /> איור 2: ניתוח עמוד של מוצרים 6 K1 ו VIP1 IP התגובה. א) ניתוח של ה-IP 6 (4, 2, 1, 0.5 nmol) על ידי מכתים Toluidine כחול היה בשימוש על מנת לקבוע את ריכוז ה-IP 7 מטוהרים משני 6 K1 IP (IP 5PP-5) ו VIP1 (1/3PP-IP 5) התגובות. B) העלילה ניתוח פיזור כדי לקבוע את ריכוז ה-IP מטוהרים 7. ריכוזים נקבעו לפי עוצמת הלהקה, מחושב באמצעות תוכנת imageJ, לעומת מראש כמויות של 6 IP. ציר ה-X מייצג את עוצמות; ציר Y מייצג את ריכוזי לידי ביטוי nmol. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3027/3027fig3.jpg" /> איור 3:. ניתוח הפעילות הביולוגית 7-IP כדי לקבוע את איכות ה-IP מטוהרים 7 אנו מודגרות 5PP-IP 5 (IP 6 K1 IP שנוצר 7) עם VIP1 או עם phosphatase 7 IP DDP1 והחליט אז התגובה בדף. מכתים DAPI ו Toluidine חשף את הייצור הצפוי של 8 IP ידי VIP1 ואת ההמרה של ה-IP ל-IP 7 6 על ידי DDP1.

<ol>
	<li>Bennett, M., Onnebo, S. M., Azevedo, C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+metabolism+and+signaling.">Inositol pyrophosphates: metabolism and signaling.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 552-564 (2006).</li><li>Burton, A., Hu, X., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+inositol+pyrophosphates+signalling+molecules?.">Are inositol pyrophosphates signalling molecules?.</a> J Cell Physiol. 220, 8-15 (2009).</li><li>Barker, C. J., Illies, C., Gaboardi, G. C., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates:+structure,+enzymology+and+function.">Inositol pyrophosphates: structure, enzymology and function.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 3851-3871 (2009).</li><li>Shears, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diphosphoinositol+polyphosphates:+metabolic+messengers.">Diphosphoinositol polyphosphates: metabolic messengers.</a> Mol Pharmacol. 76, 236-252 (2009).</li><li>Saiardi, A., Erdjument-Bromage, H., Snowman, A. M., Tempst, P., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+diphosphoinositol+pentakisphosphate+by+a+newly+identified+family+of+higher+inositol+polyphosphate+kinases.">Synthesis of diphosphoinositol pentakisphosphate by a newly identified family of higher inositol polyphosphate kinases.</a> Curr Biol. 9, 1323-1326 (1999).</li><li>Draskovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+hexakisphosphate+kinase+products+contain+diphosphate+and+triphosphate+groups.">Inositol hexakisphosphate kinase products contain diphosphate and triphosphate groups.</a> Chem Biol. 15, 274-286 (2008).</li><li>Mulugu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+enzymes+that+phosphorylate+inositol+hexakisphosphate.">A conserved family of enzymes that phosphorylate inositol hexakisphosphate.</a> Science. 316, 106-109 (2007).</li><li>Fridy, P. C., Otto, J. C., Dollins, D. E., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+human+VIP1-like+inositol+hexakisphosphate+and+diphosphoinositol+pentakisphosphate+kinases.">Cloning and characterization of two human VIP1-like inositol hexakisphosphate and diphosphoinositol pentakisphosphate kinases.</a> J Biol Chem. 282, 30754-30762 (2007).</li><li>Illies, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+inositol+pyrophosphates+for+full+exocytotic+capacity+in+pancreatic+beta+cells.">Requirement of inositol pyrophosphates for full exocytotic capacity in pancreatic beta cells.</a> Science. 318, 1299-1302 (2007).</li><li>Saiardi, A., Resnick, A. C., Snowman, A. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+cell+death+and+telomere+length+through+phosphoinositide+3-kinase-related+protein+kinases.">Inositol pyrophosphates regulate cell death and telomere length through phosphoinositide 3-kinase-related protein kinases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1911-1914 (2005).</li><li>York, S. J., Armbruster, B. N., Greenwell, P., Petes, T. D., York, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+diphosphate+signaling+regulates+telomere+length.">Inositol diphosphate signaling regulates telomere length.</a> J Biol Chem. 280, 4264-4269 (2005).</li><li>Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+mediate+chemotaxis+in+Dictyostelium+via+pleckstrin+homology+domain-PtdIns(3,4,5)P3+interactions.">Inositol pyrophosphates mediate chemotaxis in Dictyostelium via pleckstrin homology domain-PtdIns(3,4,5)P3 interactions.</a> Cell. 114, 559-572 (2003).</li><li>Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+regulate+endocytic+trafficking.">Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14206-14211 (2002).</li><li>Auesukaree, C., Tochio, H., Shirakawa, M., Kaneko, Y., Harashima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plc1p,+Arg82p,+and+Kcs1p,+enzymes+involved+in+inositol+pyrophosphate+synthesis,+are+essential+for+phosphate+regulation+and+polyphosphate+accumulation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280, 25127-25133 (2005).</li><li>Azevedo, C., Burton, A., Ruiz-Mateos, E., Marsh, M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphate+mediated+pyrophosphorylation+of+AP3B1+regulates+HIV-1+Gag+release.">Inositol pyrophosphate mediated pyrophosphorylation of AP3B1 regulates HIV-1 Gag release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 21161-21166 (2009).</li><li>Bhandari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+pyrophosphorylation+by+inositol+pyrophosphates+is+a+posttranslational+event.">Protein pyrophosphorylation by inositol pyrophosphates is a posttranslational event.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15305-15310 (2007).</li><li>Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+InsP7+by+the+Inositol+Hexakisphosphate+Kinase+1+(IP6K1).">Synthesis of InsP7 by the Inositol Hexakisphosphate Kinase 1 (IP6K1).</a> Methods Mol Biol. 645, 73-85 (2010).</li><li>Otto, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+analysis+of+inositol+phosphate+kinases.">Biochemical analysis of inositol phosphate kinases.</a> Methods Enzymol. 434, 171-185 (2007).</li><li>Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+pyrophosphates+and+their+unique+metabolic+complexity:+analysis+by+gel+electrophoresis.">Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis.</a> PLoS One. 4, e5580-e5580 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השימוש pyrophosphate אינוסיטול בביוכימיה מוגבלת בשל זמינותו המסחרי של תרכובות כאלה רגישות העניים של שיטות זיהוי קיימות. השילוב של דף, המאפשר הפרדה של מולקולות בעלי מספר שונה של קבוצות פוספט, וכן Toluidine כחול (איור 1), צבע metachromatic אשר נקשר קבוצות פוספט, מאפשר זיהוי קל של isoforms pyrophoshate אינוסיטול פתיחת אפיקים חדשים של מחקר 20. השימוש בטכנולוגיה המתוארת PAGE לטהר מוצרים pyrophosphate אינוסיטול התגובה האנזימטית נשאו outby או 6 IP K1 או VIP1 היא שיטה פשוטה, כלכלית אמינה המאפשרת ייצור של כמויות גדולות של ה-IP באיכות גבוהה 7. השיטה שתוארה לעיל אינה מוגבלת טיהור הפשוט של ה-IP 7 אבל שינויים קלים של פרוטוקול המתואר עשוי לאפשר טיהור של מגוון שונה של pyrophosphates אינוסיטול. פוספורילציה גבוהה isoforms pyrophosphate אינוסיטול, המכיל יותר משמונה קבוצות פוספט ניתן לאתר באמצעות IP 7 או כמויות שונות של 6 IP כמו מצע 20,6. Pyrophosphates אינוסיטול אלה ניתן לאתר על ידי הגדלת אורך ההליך מכתים ולאחר מכן מטוהרים (סעיף 3.2). יתר על כן, השימוש 5 IP כמו המצע של התגובה האנזימטית תאפשר טיהור PP-IP ו 5 pyrophosphates אינוסיטול אחרים המכילים קבוצת הידרוקסיל על הטבעת אינוסיטול. לסיכום, שיטה זו מאפשרת תובעני לטיהור אמין של כמויות מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול עם מכשירים זמינים באופן נרחב, ובכך פותח אפיקים חדשים בתחום מחקר זה מרגש.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Phytic חומצה (IP 6) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P8810 </td></tr><tr><td> Poly-P (hexametaphosphate נתרן) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P8510 </td></tr><tr><td> ATP-Mg 2 + מלח </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A9187 </td></tr><tr><td> OrangeG </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> O3756 </td></tr><tr><td> PhosphoCreatine (PCR) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P7936 </td></tr><tr><td> CreatinePhospho קינאז (CPK) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3755 </td></tr><tr><td> GST-Vip1 </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> שלו, IP6K1 </td><td> 18 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> שלו, Ddp1 </td><td> זמין במעבדה </td><td> זמין במעבדה </td></tr><tr><td> Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:01 (40%) </td><td> Flowgen </td><td> H16972 </td></tr><tr><td> אמוניום Persulfate (APS) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A9164 </td></tr><tr><td> טריס / borate / EDTA (TBE) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T 9060 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BDH </td><td> 43083G </td></tr><tr><td> Toluidine כחול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 198161 </td></tr><tr><td> SpeedVac </td><td> המשיח </td><td> 100218 </td></tr><tr><td> ג&#39;ל מנגנון </td><td> Hoefer </td><td> SE600 </td></tr><tr><td> אבק סעפת </td><td> המשיח </td><td> אלפא 2-4 </td></tr><tr><td> לשאוב אבק </td><td> ABM Greiffenberger </td><td> 4EKF63CX </td></tr></tbody></table>

preparation of quality inositol pyrophosphates

מיו-אינוסיטול נמצא בטבע ללא שינוי או יותר derivates phosphorylated מורכבים. מבין האחרונים, שני הנפוץ ביותר התאים האיקריוטים הם pentakisphosphate אינוסיטול (IP 5) ו hexakisphosphate אינוסיטול (חומצה phytic IP או 6). IP ו-IP 5 6 הם מבשרי של מולקולות pyrophosphate אינוסיטול המכילים אחד או יותר אג&quot;ח pyrophosphate 1. זירחון של ה-IP 6 מייצר diphoshoinositolpentakisphosphate (IP 7 או PP-IP 5) ו bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP או 8 (PP) 2-IP 4). Pyrophosphates אינוסיטול היה מבודד מכל אורגניזמים אוקריוטים למד עד כה. בנוסף, שני מעמדות שונים של אנזימים האחראים סינתזה pyrophosphate אינוסיטול שמורים לאורך האבולוציה מאוד 2-4. IP 6 קינאזות (IP 6 Ks) posses גמישות עצומה קטליטי, ממיר ה-IP ו-IP 5 6-4 PP-IP ו-IP 7 בהתאמה, ולאחר מכן, באמצעות מוצרים אלה מצעים, לקדם את הדור של מולקולות מורכבות יותר 5,6 . לאחרונה, בשיעור השני של אנזימים pyrophosphate יצירת זוהה בצורה של החלבון שמרים VIP 1 (התייחס גם PP-IP 5 K), אשר מסוגלים להמיר 6 IP ל-IP ו-IP 7 8 7,8. Pyrophosphates אינוסיטול להסדיר רבים בתהליכים תאיים שונים כגון הפרשת אינסולין 9, אורך הטלומרים 10,11, 12 chemotaxis, סחר שלפוחי 13, הומאוסטזיס פוספט 14 ו-HIV-1 לשחרר איסור פרסום 15. שני המנגנונים של פעולות הוצעו לסוג כזה של מולקולות. הם יכולים להשפיע על התפקוד התאי ידי allosterically אינטראקציה עם חלבונים ספציפיים כמו AKT 16. לחלופין, הקבוצה pyrophosphate יכול לתרום פוספט מראש phosphorylated חלבונים 17. הפוטנציאל העצום של תחום מחקר זה הוא הקשו על ידי בהעדר מקור המסחרי של pyrophosphates אינוסיטול, אשר מונע מדענים רבים ללמוד את המולקולות הללו ואת זה שינוי החדשה שלאחר translational. השיטות הקיימות כיום לבודד pyrophosphates אינוסיטול דורשים מנגנון מתוחכם chromatographic 18,19. נהלים אלה להשתמש תנאים חומציים שעשוי להוביל השפלה pyrophosphate אינוסיטול 20 ובכך התאוששות עניים. יתר על כן, מסורבלת פוסט טור נהלים desalting להגביל את השימוש שלהם במעבדות מיוחדות. במחקר זה אנו מתארים שיטה תובעני לבידוד, הדור וטיהור של המוצרים של kinase-6 IP ו-IP PP-5-קינאזות תגובות. שיטה זו התאפשרה על ידי היכולת של ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד) כדי לפתור polyphosphates אינוסיטול phosphorylated מאוד 20. לאחר 6 IP K1 ו PP-IP 5 תגובות אנזימטיות באמצעות 6 K-IP כמו המצע, PAGE שימש להפריד את pyrophosphates אינוסיטול שנוצר שהיו eluted לאחר מכן במים.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates at JoVE.com

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Pyrophosphates אינוסיטול לשחק תפקיד חשוב פתולוגיות אדם כגון סרטן, סוכרת, והשמנה, אך מנגנון הפעולה המדויק אינו עניין של מחלוקת. חוסר pyrophosphates אינוסיטול זמינים מסחרית הופכת מחקרים מפורטים בעייתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר ולבודד מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

preparation-of-quality-inositol-pyrophosphates

Research

JoVE Journal

Biology

13.0K Views.  University College London. Pyrophosphates אינוסיטול לשחק תפקיד חשוב פתולוגיות אדם כגון סרטן, סוכרת, והשמנה, אך מנגנון הפעולה המדויק אינו עניין של מחלוקת. חוסר pyrophosphates אינוסיטול זמינים מסחרית הופכת מחקרים מפורטים בעייתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר ולבודד מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול.

Video: Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological information. The pathways generated by this online application are machine-readable and fully compatible with essentially all web-browsers and computer operating systems. It uses a specially developed, web-enabled pathway drawing interface that permits the selection and placement of different combinations of pre-drawn biological or biochemical entities to depict reactions, interactions, transport processes and binding events. This palette of entities consists of chemical compounds, proteins, nucleic acids, cellular membranes, subcellular structures, tissues, and organs. All of the visual elements in it can be interactively adjusted and customized. Furthermore, because this tool is a web server, all pathways and pathway elements are publicly accessible. This kind of pathway &#34;crowd sourcing&#34; means that PathWhiz already contains a large and rapidly growing collection of previously drawn pathways and pathway elements. Here we describe a protocol for the quick and easy creation of new pathways and the alteration of existing pathways. To further facilitate pathway editing and creation, the tool contains replication and propagation functions. The replication function allows existing pathways to be used as templates to create or edit new pathways. The propagation function allows one to take an existing pathway and automatically propagate it across different species. Pathways created with this tool can be &#34;re-styled&#34; into different formats (KEGG-like or text-book like), colored with different backgrounds, exported to BioPAX, SBGN-ML, SBML, or PWML data exchange formats, and downloaded as PNG or SVG images. The pathways can easily be incorporated into online databases, integrated into presentations, posters or publications, or used exclusively for online visualization and exploration. This protocol has been successfully applied to generate over 2,000 pathway diagrams, which are now found in many online databases including HMDB, DrugBank, SMPDB, and ECMDB.

PathWhiz is a comprehensive, online pathway drawing tool for generating biochemical and biological pathways. It uses publicly accessible databases and easily expandable palettes consisting of pre-drawn pathway components. This protocol describes how to easily build new pathways, replicate and edit existing pathways, and propagate previously drawn pathways to different organisms.

כלי אינטרנט לאיכות יצירה גבוהה מסלולים ביולוגיים מכונית קריאות

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological assessment and chemical analytical methods. However, the lack of availability of botanists, especially in recent years, coupled with the need to enhance quality control to combat the stresses on the supply chain brought by increasing consumer demand and climate change, necessitates alternative approaches. The goal of this protocol is to facilitate botanical species identification using a portable qPCR system on the field or in any setting, where access to laboratory equipment and expertise is limited. Target DNA is amplified using dye-based qPCR, with DNA extracted from botanical reference materials serving as a positive control. The target DNA is identified by its specific amplification and matching its melting peak against the positive control. A detailed description of the steps and parameters, from hands-on field sample collection, to DNA extraction, PCR amplification, followed by data interpretation, has been included to ensure that readers can replicate this protocol. The results produced align with traditional laboratory botanical identification methods. The protocol is easy to perform and cost-effective, enabling quality testing on raw materials as close to the point of origin of the supply chain as possible.

Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System

Presented here is a protocol for field identification of Matricaria chamomilla using a portable qPCR system. This easy-to-perform protocol is ideal as a method to confirm the identity of a botanical species at locations where access to laboratory equipment and expertise is limited, such as farms and warehouses.

זיהוי שדה של קמומילה מטריקריה באמצעות מערכת qPCR ניידת

Quality control in botanical products begins with the raw material supply. Traditionally, botanical identification is performed through morphological ...