זה מספק תוצאות באיכות גבוהה עבור מטבוליזם פוספט אינוזיטול בכל האורגניזמים שבדקנו עד כה. הוא גם יספק תובנה לגבי מסלול ביו-סינטטי תאי חדש שאנו מודעים לו כיום. ניתוח של מטבוליזם פוספט אינוזיטול על ידי CE-ESI-MS הוא מהיר יותר, רגיש מאוד, ומסוגל לספק מידע מבנה עבור מכלולים פוספט אינוזיטול.
כדי להתחיל, להקים ספקטרומטריית מסה יינון אלקטרופורזה נימית או מערכת CE-ESI-MS המורכבת ממערכת CE מסחרית, וספקטרומטר מסה טנדם משולש מרובע, מצויד במקור ESI של זרם סילון אג'ילנט. לאחר מכן, חבר את מפצל זרימת הנדן 1:100 ואת שקע משאבת הכרומטוגרפיה הנוזלית האיזוקרטית, וודא כי בקבוקון הכניסה של מערכת CE נמצא באותו גובה כמו קצה המרסס של מנתח המסה. לאחר מכן, השתמש בגרסת תחנת העבודה של MassHunter או בתוכנת MS דומה, כדי לשלוט במערכת כולה ובאיסוף וניתוח נתונים.
לאחר הכנת חיץ הריצה CE ונוזל נדן, התקן את נוזל הנדן על ידי טיהור בחמישה מיליליטר לדקה במשך חמש דקות. לאחר מכן הגדר את קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה ואת לחץ המשאבה ל -180 בר. ודא שהצינורות הממוחזרים מתחברים בחזרה לבקבוק נוזל הנדן כדי לעשות שימוש חוזר בממס.
לאחר מכן, באמצעות חותך עמוד נימי עם להב יהלום מסתובב, לחתוך כראוי את שני הקצוות של נימי CE-MS עם חלון גילוי UV. לאחר מכן להסיר שניים עד שלושה סנטימטרים של ציפוי polyimide על שני הקצוות עם מצית, ולנקות את המשטח נימי עם Isopropanol. כדי להתקין את הנימי, התאם את הנימים לקלטת CE-MS.
לאחר מכן לחץ על כפתור שינוי קלטת והתקן את הקלטת במכשיר CE. כדי להפעיל את הנימי, תחילה לשטוף את הנימי עם נתרן הידרוקסיד טוחן אחד, לאחר מכן מים במשך 10 דקות, ולאחר מכן CE פועל חיץ במשך 15 דקות. לאחר מכן, הכנס את הנימי לתוך מרסס CE-MS.
באמצעות זכוכית מגדלת ובורג הכוונון במרסס, כוונן במדויק את שקע הנימים, כדי להבטיח שהקצה הנימי יבלוט כ-0.1 מילימטרים מקצה המרסס. בדוק את היציבות של מרסס ESI במצב סריקה מלאה. התנודתיות של אלקטרופרוגרמות היון הכולל צריכה להיות בתוך 5% לאחר מכן, בצע הרצת בדיקה עם תקני פוספט אינוזיטול.
לאחר הכנת תערובת התקנים הפנימית, מערבבים 10 מיקרוליטרים של המדגם עם 0.5 מיקרוליטר של תערובת התקנים הפנימית ובקבוקון מדגם CE. בעת שימוש במערכת החידוש, לחץ על כפתור שינוי בקבוק. שים את 250 מיליליטר מוכן של CE פועל חיץ לתוך בקבוק אלקטרוליטים.
לאחר מכן לחץ על צינורות נקיים שמירה על מחט חידוש בבקבוקון מים. הגדר את הפרמטרים ESI ו- MS. לאחר מכן מטב את פרמטרי המקור באמצעות אופטימיזציה של מקור עם תערובת של תקני פוליפוספט אינוזיטול, והגדרות ניטור תגובה מרובות באמצעות MassHunter Optimizer עם כל התקנים.
לאחר מכן, בצע ריצה עבור תמציות פוספט אינוזיטול ולבדוק את התוצאות. קבעו רצף כשיש דוגמאות נוספות. לאחר המדידה, הנח שה-MS נמצא במצב המתנה ואל תכבה את משאבת הכרומטוגרפיה הנוזלית.
החלף את מרסס CE-ESI-MS במרסס LC-ESI-MS כאשר אין אספקת נוזל נדן. לניתוח נתונים, פתח את תוכנת הניתוח הכמותי וצור אצווה עבור כל הדוגמאות. לאחר מכן, צור שיטה חדשה מנתוני ניטור התגובה המרובים שנרכשו, והגדר את פחמן-13 אינוזיטול פוספטים כתקנים פנימיים.
לאחר מכן, בדוק את תרכובת ניטור התגובות המרובות, זמן השמירה, התקנים הפנימיים, הריכוז והגדרת המזהה. העבר את האימות והיציאה כדי להחיל את השיטה על האצווה הנוכחית. שמור את השיטה.
לאחר מכן בדוק אם כל שיא באצווה משולב כראוי. אחרת, שלב את השיא באופן ידני. ייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני, וכמת את הפירופוספטים של אינוזיטול, על ידי השוואת תגובת שיא האנוליטים לתגובת השיא המתאימה של האיזוטופ היציב שכותרתו תקנים פנימיים עם ריכוזים ידועים.
לבסוף, עם הריכוז הנמדד בפוספט אינוזיטול, תמיסת התמצית ונפחה, לחשב את הכמויות המוחלטות ולנרמל עוד יותר את הסכום על ידי ספירת תאים או תוכן חלבון. חשב את הריכוז התאי בהתבסס על ספירת תאים ונפח תא ממוצע של תאי HCT116. אלקטרופרוגרמות יונים מופקות של תקני אינוזיטול פירופוספט בריכוז של שני מיקרומולים מוצגים כאן.
מטבוליזם של אינוזיטול pyrophosphates ביונקים עם מבנים פשוטים שלהם מוכנס. מוצגת כאן ריצה של CE-ESI-MS של תאי HCT116 מיוניברסיטי קולג' לונדון או UCL. CE-MS שימש לכימות שונות ברמות IP8 בין תאי HCT116 מ-UCL לאלה של NIH.
תאי HCT116 מ-UCL מכילים רמות גבוהות פי שבעה של IP8 מאלו של NIH. הצטברות משמעותית של 1, 5-IP8 בתאי HCT116 UCL מקבילה לעלייה ניכרת ב- 1-IP7. ניתוח CE-ESI-MS של תאי HCT116 שטופלו בנתרן פלואוריד מ-NIH הדגים עלייה של 5-IP7, יחד עם ירידה ב-IP6 ומראה של 5-PPIP4.
למרות רמות של 1-IP7 ירד במידה מסוימת, זה לא נעדר לחלוטין בתאים מטופלים נתרן פלואוריד, אבל בעיקר תחת הגבול של זיהוי. חשוב ליצור כיתה יציבה CE-ESI-MS. אנו ממליצים לבדוק את יכולת החזרה והרגישות של המערכת לפני המדידות.
טכניקה זו מאפשרת לספק מטבוליזם של אינוזיטול פוספט, שתלים ורקמות, וגם לספק הזדמנות לחקור מקרוב את אינוזיטול pyrophosphate רלוונטי ביולוגית.
