מחקר זה נתמך על ידי מקס McGee הלאומית למחקר המרכז לנוער Diabetesat לרפואה של וויסקונסין ומחקר ילדים של המכון ויסקונסין. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, או הכנה של כתב היד.

1. לפני הקמת assay דיכוי, צריך חרוזים מעיל tosylactivated עם אנטי אנושי CD3 (שיבוט UCHT1, 1μg/ml הריכוז הסופי) לגירוי התא ולאחר מכן לבדוק אם חרוזים הם מצופים ביעילות על ידי הגדרת ב assay שגשוג במבחנה באמצעות אדם T לתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1ml של M-450 חרוזים tosylactivated מבקבוקון המקורי, מקום לעמוד מגנטי להחזיק עד שכל החרוזים יש דבק בצד של הצינור. הסר את חיץ תוך הצינור עדיין עומדים המגנטי. קחו את הצינור מתוך עמדה מגנטי להוסיף 1ml של buffer1, במקום את הצינורית לעמוד מגנטי שוב להסיר את buffer1 תוך צינור הוא עומד המגנטי; חרוזים resuspend ב 1ml של buffer1 ולהוסיף 40μl של CD3 אנטי אנושית, להתסיס בשעה 37 ° C במשך 15 דקות, להוסיף 0.1% w / v BSA ולהמשיך התססה במשך 16 השעות הבאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החרוזים buffer2 פעמיים במשך 5 דקות ב 2-8 מעלות צלזיוס ופעם buffer3 במשך 5 דקות ב 2-8 מעלות צלסיוס תוך שימוש לעמוד מגנטי כפי שהוסבר לעיל, להסיר את החיץ ואת resuspend את החרוזים 1ml של buffer2; חרוזים הם 8 / ml 4x10 ריכוז סופי ומוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 50,000 ו 25,000 PBMC / היטב triplicates בצלחת 96-היטב ולהוסיף מספר משתנה של CD3 מצופה חרוזים (4x10 8 חרוזים / ml, CD3 1μg/ml, למשל 1, 2, 3, 4, 5 חרוזים / תא ) על מנת לקבוע את המספר האופטימלי של חרוזים לכל תא. לאחר 72 שעות בתרבית, להוסיף 1μCi [3 ח] thymidine ולהמשיך דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 השעות הבאות. תאים בצלחת קציר קציר Multiscreen (Millipore), להוסיף נוזל הנצנץ ולקרוא לכל ספירות דקות (CPM) / גם באמצעות למעלה הרוזן NXT (פקארד, CT). השתמש חרוזים / יחס התא כאשר הם מעל לאלף הופעות 5000 אך פחות מ 15,000 כדי למנוע גירוי יתר של Tregs, אשר עלול לאבד את הפונקציה מדכאים. בדרך כלל, יחס של 3 חרוזים / תא מעורר שני המגיב ותאי Treg בכל קבוצות הנושא נבדק עד כה 1-4. </li></ol> 2. PBMC במנותק מן הדם כולו מתורמים בריאים או leukopacks אדם או מעיל באפי (BC) שנלקח בדרך כלל ממקורות מתנדבים בריאים וזמינים ללא תשלום מרכזי עירוי דם מקומי (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את לפנה&quot;ס (~ 50 מ&quot;ל) 01:06 עם PBS (להוסיף 250 מ&quot;ל). עכשיו יש הנפח הכולל 300 מ&quot;ל. לאט לאט שכבת 25ml של BC מדולל על גבי 15 מ&quot;ל Ficoll Paque-PLUS הוסיף 50 מ&quot;ל צינורות פלקון, מבלי להפריע את השכבות. צנטריפוגה ב 800xg (1400rpm בצנטריפוגה Sorvall עם דלי הרוטור מתנדנד SH-3000) במשך 30 דקות ב 4 ° C, עם הבלמים כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לאסוף את שכבת PBMC (שלב ביניים) ולהעביר אותו ל 50 מ&quot;ל צינורות טרי פלקון. לשטוף PBMC ידי מילוי צינורות עד 50 מ&quot;ל עם DPBS. איסוף 2 כדורי תא לתוך צינור אחד. צנטריפוגה ב 400xg במשך 10 דקות ב 4 ° C. חזור כביסה צעד פעמיים, בכל פעם שילוב 2 כדורי תא לתוך צינור אחד. מערבבים את כל כדורי תא לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן PBMC באמצעות Trypan מבחן כחול הדרה. ביצוע דילול 1:10 ב Trypan כחול על ידי הוספת 20μl של PBMC כדי 180μl של Trypan כתם כחול. מערבבים היטב ולקחת 20μl לספור hemacytometer מיד. ספירת המספרים של כל התאים מוכתמת בלא כתם כחול רק ממוקם שני רחובות כל ריבוע ובו 16 ריבועים קטנים יותר. קח את הממוצע של שני המספרים ולהתרבות על ידי 10. מחלקים את המספר הזה על ידי 100 כדי לקבל את מספר PBMC / ml. אחוז תאים לחשב כמו קיימא [1 - (מספר התאים כחול / מספר התאים הכולל) x100]. אם המשך הכדאיות היא ≥ 95%. </li></ol> 3. MACS מראש מסוג CD4 ותאי T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שנמשיך, העברת 1ml של PBMC לתוך צינור חדש, להוסיף 4ml התקשורת להכין תאים עם הקרנה 5000rad, אלה יהיו אנטיגן הצגת תאים (APC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שאר התאים בכל 250xg במאגר PBS/2mM BSA EDTA/0.5% עבור 10min ב 4 ° C. יוצקים את התאים supernatant ו resuspend ב 4ml של חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200μl של microbeads MACS אנטי CD4 ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ידי הוספת 40ml של חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5% ו צנטריפוגות ב 250xg עבור 10min ב 4 ° C. יוצקים את supernatant ו resuspend ב 8ml של הטמפרטורה degassed, חדר חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן להפריד את ההשעיה התא באמצעות טרום הפרדה מסננים אותם לפני העמסה על עמודה LS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול ההשעיה התא 4ml שכבה כל עמודה LS מכויל על (עם 3ml של deggassed חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%). טור קבוע ב LS מפריד MidiMACS. לפני ההשעיה תא שנגמר, או להפעיל מחדש flowthrough או להוסיף 3ml של בטמפרטורת החדר deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% חיץ BSA ולתת למאגר לרוץ דרך. הוסף חוצץ יותר עד שזה מגיע ברורה החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ פיפטה 5 מ&quot;ל deggassed על הטור LS, להסיר עמודה LS מ מפריד MidiMACS ומקום לתוך צינור איסוף סטרילית חדש 15 מ&quot;ל לתת ~ לרוץ 1.0ml דרך. מכניסים את הבוכנה לתוך עמוד ולאט לאט לדחוף את שארנפח החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות את אותו הדבר עם שתי עמודות LS לשלב את שני שברים מסוג CD4 +. הוספת עד 50 מ&quot;ל תאים PBS ולספור. התשואה הצפויה היא עד 5x10 8 תאים. צנטריפוגה ב 400xg במשך 10 דקות ותאי resuspend היטב 2ml חיץ PBS/2mM BSA EDTA/0.5%. </li></ol> 4. מיון פלורסנט Activated Cell (FACS) בידוד (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את קוקטייל של נוגדנים סמנים CD אל פני השטח סמנים הבאים לתא (לשמור מוגנים מפני אור): 20 μl של אנטי אנושי CD8-FITC (שיבוט RPA-T8), 20 μl של אנטי אנושי CD14-FITC (שיבוט M5E2; קולטן LPS), 20 μl של אנטי אנושי CD32-FITC (שיבוט FLI8.26; FcγR-type II) 6 μl של אנטי אנושי CD116-FITC (שיבוט M5D12: GM-CSFRα שרשרת) וכן, לחילופין, להוסיף אנטי 40μl אדם-CD4-APCCy7 (שיבוט RPA-T4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5μl מתוך ההשעיה תא 2ml ואת הכתם עם 2μl של קוקטייל כתם, זה צינור לקביעת סף (Fluorochrome מינוס אחד FMO) 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של אנטי אנושי CD25-PE (שיבוט M-A251, IL-2Rα) לקוקטייל כתם, ולהוסיף את קוקטייל ההשעיה התא דגירה על 4 מעלות צלזיוס 30 דקות. שטפו תאים PBS חיץ, צנטריפוגות ב 400xg במשך 10 דקות ותאי resuspend לריכוז תאים של 10 7 / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בלא כתם תאים תאים או חרוזים מוכתם fluorochrome יחיד שישמש לשלוט פיצוי מיון התא על FACS אריה (BD Biosciences, סן חוזה, ניו ג&#39;רזי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את התאים בצינור FMO אשר יאפשר למשתמש להגדיר את סף למיון של CD25 תאים + T (איור 2 א). קביעת השער סביב FITC שלילי תאים להוציא FITC חיובי התאים המרכיבים מונוציטים, מקרופאגים וכל CD4 + אחרים שאינם-T לתאים (איור 2b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלקה נפרדת, לצייר השערים-CD25, CD25low ו CD25high T-Tregs התאים (למעלה 1% של תאים המבטאים את המספר הגבוה ביותר של CD25) (איור 2 ג). תת Cell בדרך כלל להראות הטוהר גבוהה (איור 2, 2e ו 2f). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות אוסף עם תאים ב 400xg במשך 10 דקות ולשמור אותם על הקרח עד ציפוי. </li></ol> 5. הגדרת התרבות תאים בצלחת 96-היטב (ערכת המצורף טבלה 1) ב 200μl/well <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50μl Aliquot של CD3 מצופה חרוזים (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) מחושב להיות 3 חרוזים / תא המגיב היטב, resuspended בתקשורת להשלים עם 10% נקווה האדם א.ב. בסרום בתחתית U-96-גם הצלחות. (לדוגמה, כדי להפוך את התקשורת עם 2ml CD3 מצופה, לקחת 7.5μl ממלאי של CD3 חרוזים מצופים הגמר 4x10 ריכוז 8 / מ&quot;ל ו לדלל ב 2ml של התקשורת; 50μl כל יכיל 75,000 beads-3beads/cell). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל APC מוקרן ריכוז 5x10 תא 5 / ml ולהוסיף 50μl (יכיל 2.5 x 10 4 תאים) לתוך הבאר עם כל גירוי נוסף בעבר, כולל בארות שכותרתו &quot;Tregs בלבד&quot;, &quot;APC רק&quot; ו &quot;התקשורת רק&quot; בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 x 10 4 / טוב CD4CD25 או CD4CD25low בתאי T ב triplicates הבאים עיצוב בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Tregs לשתף תרבויות (שורה ב &#39;טבלה 1) ביחס 1:10 (2500 תאים Treg) ו לבארות שכותרתו &quot;Tregs רק&quot; ו דגירה את הצלחת ב 37 ° C ב-CO 2 באינקובטור עם 5% CO 2 , רווי בלחות למשך 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דופק בארות עם 1μCi [3 ח] thymidine ולהמשיך הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 השעות הקרובות. </li></ol> 6. קציר ועוד היד נטויה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על הצלחת הקציר multiscreen באמצעות Packard filtermate מקצרה או מערכת חלופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוזל הנצנץ (Microscint 20), מכסים קצירת צלחת עם מכסה פלסטיק שקוף כהכנה לשלב הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריאה לכל ספירות דקות (CPM) / גם באמצעות למעלה הרוזן NXT (פקארד, CT) או מערכת חלופית. </li></ol> 7. מחשוב אחוז דיכוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים בתרבית triplicates, הממוצע מחושב עבור כל תנאי. אם מקדם השונות הוא&gt; 30%, outlier מסולקת ו לדקה רק שתי בארות הם ממוצעים. אחוז דיכוי מתקבל על ידי מחשוב [(sc) / s] x 100%, כאשר s = לדקה בתרבות אחת c = לדקה בתרבות המשותפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי נאיבי (CD25-) ו - in vivo מופעל (CD25low) ותאי T מפעיל הם מצופה כמו תאים המגיב T, ההבדל ביכולת של Tregs לדכא כל תת אלו שנתפסו בשימוש כמדד מנבא פוטנציאל תפקודי מבוסס על ההנחה כי תאי מופעל קשה יותר לדכא. </li></ol> 8. נציג תוצאות: השונות הגדולה בשיטות המשמש והתוצאות הנגזרות ב assay דיכוי במבחנה האדם מתבקש לנו לבצע מחקר מקיף על התנאים המשפיעים על assay 1. פיתחנו assay כי בדיקות לא רק פונקציה Treg, אלא גם הטוהר שלהם, בהתחשב יחס נמוך בין Tregs: Teffs (01:10), אשר קבענו קודם 6. בנוסף, Tregs שונים הeir היכולת לדכא בהצלחה נאיבית in vivo המופעל בתאי T גם בנבדקים בריאים, כפי שמוצג באיור 3 ו במחקרים קודמים שלנו 2,4, אשר הופך בולט יותר, אם האיזון החיסונית נפגעת, כמו נושאים בסיכון לפתח T1D . Assay עבדו היטב במחקר שבו אנו מדכאים לעומת פונקציה של טבע (nTregs), ועין מתנהלת (iTregs) והן nTregs במבחנה מורחב, המאפשר לנו להשוות בין תפקידם לשלוט בריא, לאחרונה התפרצות (RO) T1D ו ארוכת שנים (LS ) נושאים T1D. הגענו למסקנה נושאים T1D RO לו יכולת טובה יותר לייצר תפקודית בשתי iTregs ו nTregs התרחב בהשוואה לנושאים LS לשלוט T1D ובריא 7. לפיכך, assay זה יכול לשמש ככלי מעולה הכרה של מדינה בשלבים מוקדמים ומאוחרים של חוסר איזון מערכת החיסון. 1 תוכנית סכמטי מצגת הצעדים מעורב ב assay דיכוי חוץ גופית <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. צעדים של דיכוי ב assay במבחנה הציג עם תמונות <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. אסטרטגיה gating בבידוד תא FACS. סף) CD25 + הותאם על פי Fluorochrome מינוס אחת (FMO), ב) תאים היו סגורות כמו FITC שלילית, ג) FITC שלילי התאים היו מגודרת נוספים שנאספו CD + CD25-, CD + CD25low ו CD + CD25high ( Tregs) מוצג עם האחוזים, ד) FACS מיון Tregs לאחר מיון, ה) FACS מיון CD + CD25low לאחר מיון, ו) FACS CD4 + CD25 מיון-T לתאים לאחר מיון <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. תוצאות נציג של נבדקים בריאים) תוצאות נציג ספירות לדקה (CPM) של נבדקים בריאים כפי שהוצגו תרבויות יחיד עבור כל תת תא מעורב (נאיבי-CD25-, in vivo הופעל-CD25low, אנטיגן הצגת תאים ו-APC T רגולטוריים תאים-Treg), כמו גם שיתוף ותרביות של תאים המגיב T (CD25 או CD25low) ו Tregs. ב) אחוז דיכוי כל CD25 ו CD25low המגיב בתאי T על ידי Tregs עצמיים מוצג עבור קבוצת הבקרה בריאים (n = 4). דיכוי היה כפי שחושב [(sc) / s] x 100%, כאשר s = לדקה בתרבות אחת c = לדקה בתרבות המשותפת. למרות הבדל קטן קיבולת של Tregs לדכא המגיב בתאי T היה שם לב, זה לא היה משמעותי (לזווג מבחן t p = 0.08). ג) הוצג הן של עותקים לדקה בכל הנושאים סיכון תרבות כל אחת, כולל CD25 ו CD25low כמו המגיב בתאי T, וכן APC ו Tregs, ושיתוף תרבויות שבו כל תת T המגיב תא זרע עם אחוז (CD25-/Tregs ו CD25low/Tregs). ד) Tregs של דיכוי של כל CD25 ו CD25low תאים המגיב T על ידי עצמיים Tregs מוצג בכל הנושאים סיכון (n = 4). ההבדל ביכולת של Tregs לדכא CD25-מול CD25low המגיב בתאי T היה משמעותי (לזווג מבחן t p = 0.04). טבלה 1. סכמטי להגדיר ב assay של דיכוי חוץ גופית <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 1-3 </td><td> 4-6 </td><td> 7-9 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> התקשורת רק </td><td> התקשורת רק </td></tr><tr><td> ב </td><td> CD4CD25-/ Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Tregs בלבד </td><td> APC בלבד </td></tr><tr><td> ג </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note.">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).</li><li>Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+arsenazo+III+in+the+preparation+and+characterization+of+an+albumin-linked,+gadolinium-based+macromolecular+magnetic+resonance+contrast+agent.">Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent.</a> J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).</li><li>Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+determination+of+the+number+of+water+molecules,+q,+coordinated+to+europium(III)+ions+in+solution+from+luminescence+decay+lifetimes.">On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes.</a> Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).</li><li>Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+drug+and+imaging+conjugates:+design+considerations+for+nanomedical+applications.">Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications.</a> Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).</li><li>Que, E. L., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+as+chemical+sensors+for+metals+in+biology+and+medicine.">Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).</li><li>Uppal, R., Caravan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+probes+for+cardiovascular+MR+imaging.">Targeted probes for cardiovascular MR imaging.</a> Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).</li><li>Major, J. L., Meade, T. J. B. i. o. r. e. s. p. o. n. s. i. v. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioresponsive,+cell-penetrating,+and+multimeric+MR+contrast+agents.">Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).</li><li>Datta, A., Raymond, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gd-hydroxypyridinone+(HOPO)-based+high-relaxivity+magnetic+resonance+imaging+(MRI)+contrast+agents.">Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents.</a> Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).</li><li>Le&#244;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+MRI+agents+for+sensing+metabolism+in+vivo.">Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo.</a> Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).</li><li>Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+containing+nanosized+systems+for+MR-molecular+imaging+applications.">Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications.</a> Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).</li><li>Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gadolinium(III)+chelates+as+MRI+contrast+agents:+structure,+dynamics,+and+applications.">Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications.</a> Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).</li><li>Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging:+theory+and+design.">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li><li>Yoo, B., Pagel, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging.">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).</li><li>Pandya, S., Yu, J., Parker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+emissive+europium+and+terbium+complexes+for+molecular+imaging+and+sensing.">Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing.</a> Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).</li><li>Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+in+the+preparation+of+dendrimer-based+bifunctional+diethylenetriaminepentaacetic+acid+MR+contrast+agent+derivatives.">A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives.</a> Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).</li><li>Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+MRI+properties+between+derivatized+DTPA+and+DOTA+gadolinium-dendrimer+conjugates.">Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates.</a> Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).</li><li>Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents.">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li><li>Le&#244;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates.">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li><li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כפי תכונה ייחודית רק Tregs, פונקציה מדכאים יש לבדוק באופן מהימן ואחיד בין הנושאים בשלבים שונים של התפתחות המחלה בתוך אותו בין מחקרים שונים. אנו מציעים פרטי assay דיכוי שפותחו במעבדה שלנו תרומתנו סטנדרטיזציה של assay זה. במחקר אופטימיזציה הנרחב שלנו, יש לנו קבעו כי גירוי תא T עם אנטי אנושי CD3 מצופה חרוזים (UCHT1 שיבוט, בריכוז של 1μg/ml (להבדיל 5μg/ml זמינים מסחרית) בשילוב עם PBMC כמו APC לספק גירוי טבעי מסוגל להפעיל גם הן תאים T ו המגיב Tregs בנושאים שנבדקו 1. הבחירה של נוגדן אנטי CD3 אדם היא בעלת חשיבות רבה, שכן בידינו רק נוגדן Ancell נתן את התוצאות הצפויות. גירוי סימולטני עם CD3 אנטי אנושי ואנטי CD28 אדם לא היה מספיק כדי לזהות הבדלים בין קבוצות נושא (תוצאות לא מוצגות), בעוד PBMC הציע לוח מלאה של שיתוף גירוי אותות, מגדילים את הסיכוי הולכת אותות וגירויים יעיל. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם leukopacks דם החולה. ההבדל היחיד הוא את כמות הדם שצריכה להיות טעון על גבי PLUS Ficoll-Paque בהליך בידוד PBMC. מדיה המשמשים assay זה מכיל 10% נקווה האדם א.ב. בסרום, שאנו נחושים להיות תוספת נהדרת assay. עם זאת, לפני בשימוש, סרום צריך להיבדק על היכולת להפעיל PBMC PBMC על עצמו (שלה זרע sixplicate ולהוסיף להשלים התקשורת RPMI עם סרום הישן, ללא בסרום עם סרום חדש. הדופק לאחר 72 שעות צלחת, דגירה 16 ​​שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, תאים הקציר ולקבל קריאות CPM). עותקים לדקה מוגברת של PBMC תרבותי עם הסרום החדש אינו תוצאה טובה ומציע צורך בסרום עם מספר הרבה חדש. יש לנו קבעו כי MACS המיון נעשה באופן ידני עם עמודה LS חדשה מדגם זה נותן תשואה טובה יותר ניכר של תאים מסוג CD4 + T לעומת Automax. בנוסף, טוהר Treg היה נחוש בדעתו להיות&gt; 95%, דהיינו על ידי ביטוי CD25 (איור 2), חוסר שגשוג במבחנה (איור 3 א), מדכאים פוטנציאל גבוה בנבדקים בריאים ב 1:10 יחס בין Treg: המגיבים ( איור 3ab) והביטוי Foxp3 הגבוה ביותר בקרב מבודדת תת T תא (מידע לא מוצג). התאים לזהם מסולקות כמו מזבלה FITC במהלך FACS הליך מיון בשלב הבא (איור 2b). FACS מכתים של הסמן CD4 אין צורך וזה האוכלוסייה התא ניתן לראות דרך FSC במזימה בשילוב עם אנטי אנושי CD25, אולם זה יכול להיעשות. Tregs ממוינות כמו 1% העליון של תאים המבטאים את המספר הגבוה ביותר של CD25 בכל קבוצות נושא. החלת הליך קפדני על כל הנושאים של מעמד עצמאי למחלות אפשרה לנו להשתמש רק אחת היחס בין Tregs ואת המגיב ותאי T (01:10) בכל קבוצות הנושא נבדק. בנוסף, באותם תנאים לעבוד כל כך טוב את ההבדל Treg פוטנציאל מדכאים נתפסה בין נאיבי in vivo לתאי T מופעל לשמש המגיבים, אשר, בהתבסס על ההבדלים ביניהם, ניתן היה לצפות 1. קבענו גם כי לאחר FACS בתאים המיון צריך להיות סובב מטה בטרם הקים בשנת assay דיכוי. הפצת נמדדה בעזרת thymidine tritiated. לחלופין, התפשטות תאים ניתן למדוד באמצעות 5-bromo-2&#39;-deoxyuridine, אנלוגי פירימידין, אשר שולבו לתוך ה-DNA מסונתז החדש במקום thymidine. גילוי BrdU מבוסס על ניתוק של אירופיום, יון חייב נוגדנים להכיר BrdU (אנטי BrdU-EU), כי בהליך של גילוי אותות הקרינה יקבל שחרור ניתק כי ניתן למדוד fluorometer 8. על פי היצרן (DELFIA) assay זה רגישות דומה [3 ח] thymidine. מעקב אחר התפשטות תאים יכול להיעשות גם באמצעות, לדוגמה, נגזרות של מלח tetrazolium ב MTT או מבחני XTT זמינים ATCC, שם היחס בין מספר התא האות המיוצר יש הוקם לראשונה, המאפשר כימות spectrophotometric של השינויים בשער של התא התפשטות הכדאיות. עם זאת, חלופה אחרת היא שימוש כדאיות התא DHL ו assay שגשוג, מבוסס על כימות fluorimetric מספרים תא חי הכדאיות. בחירה אפשריים אחרים היא כתם המגיב בתאי T רק עם CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl אסתר) ולעקוב אחר צמצום של הכתם עם חלוקה כל הבא בזמן culturing. עם זאת, בהתאם גירוי בשימוש assay, דגירה ארוכה של יותר מ -48 שעות יכול לגרום פסגות נבדל של תאים CFSE חיובי. לפיכך, כל מבחני יש כמה יתרונות וחסרונות וצריך להיות מותאם להשגת התוצאות הרצויות. לאלף הופעות עבור בדיקות אנטי אנושי CD3 מצופה מבוצעים תמיד עלPBMC בריאים הם צריכים להיות מעל 5000 אבל לא מעל 15,000 מנת חרוזים לשמש לסוג זה של assay. אנחנו בדרך כלל להגדיר חרוזים שונים / יחס התא כאשר בודקים כל אצווה של חרוזים שאנחנו עושים, וברוב המקרים יש לנו עותקים לדקה העקבי ביותר עם 3 חרוזים / תא עם 25,000 תאים / היטב. אנחנו בדרך כלל לחזור על הציפוי אם לאלף הופעות במהלך בדיקות האצווה נמצאים מתחת 3000, עד שנגיע 5,000-15,000 לדקה / היטב. לכן, תהליך הציפוי נבדקה בכמה רמות ואנחנו רואים את זה אמין. לכן, כאשר המחיר לאלף הופעות של קבוצה מסוימת של נבדקים (כמו Auto-נוגדנים חיובי נושאים בסיכון לפתח T1D) באופן עקבי נמוך יותר לעומת אנשים בריאים, יש לנו סיבה להגיע למסקנה כי תהליך התמרה האות עשוי להיות בסכנה. , למרות מחקרים רבים השתמשו בתאים נאיבי כמגישי מבחני דיכוי שפורסם עד כה 9-12, כמה, למשל, השתמשו גם CD4 כמגישי בתנאים assay שונה מאוד 13 או PBMC כמגישי, בנוכחות PBMC כמו APC ו להגדיר אותם חד ושיתוף תרבות עם Tregs הוסיף 14 או 15 מונוציטים כמו מדכאי. למרות המחיר לאלף הופעות ייווצר כל הווריאציות assay ומסקנות על התפשטות ייעשה, אנו סבורים כי לאחר משנה אחיד טהורים תא כמגישי נותנת תוצאות ספציפיות יותר, בעל פוטנציאל להסיק מסקנות נוסף על שני Tregs ואת המגיבים. כפי assay דיכוי שלנו המובאים כאן כולל שני תת תא נפרד טהור כמגישי (CD4 + CD25 ו CD4 + CD25low), ניתן לקבל מידע רב ערך על הומאוסטזיס החיסון כאשר תוצאות בריאים מושווים או מושפעים נושאים בסיכון לפתח מחלה הנובעת ההפרעות של הומאוסטזיס החיסון (כמו T1D). כפי שמוצג על ידי מספר גדל והולך של מחקרים in vivo תאים מופעל T (CD4 + CD25low) מראות לקויה רגישות אפקט מדכא של Tregs 16-19. ההסבר המדויק על התנהגות הדורש חקירה נוספים. בנוסף לכך, אנו ואחרים הראו כי Tregs בנבדקים עם T1D לעשות יש פגם תפקודי 2,9,10, וזה נכון גם לגבי Auto-נוגדנים חיובי נושאים בסיכון לפתח T1D, כפי שהראינו איור 6 בדו&quot;ח האחרון שלנו 1. אחת האפשרויות היא כי T מסוג CD4 כל התאים הנבדקים מושפעים בסיכון לפתח T1D להיות בעל מום שכיח הולכת אותות למנוע מהם להגיב על גירויים המשפיעים לתפקד כראוי ועל מפעיל שלהם. כתוצאה של הולכת אותות נפגעת, המגיב בתאי T יעורר לדקה נמוך יותר (שמוצג באיור 3c) ו Tregs לא לדכא ביעילות. האפשרויות זה או אחר להישאר כדי להיחקר נוספת. בשל לשחק תפקיד גדול Tregs בבריאות ומחלות, במעבדות רבות מדדו תפקוד Treg התאמת assay הצרכים והיכולות שלהם. לכן, גורמים רבים assay יכול להשתנות (המגיב / Treg, בידוד סוג ומספר של הטבע, המגיבים וכוח סוג גירוי, ומספר APC, היחס בין המגיב / Tregs, זמן תרבות, כמו גם שיטת מעקב אחר התפשטות ), המשפיעים על תפקוד Treg. עבודה זו, אם כן, יש מטרה כדי להתחיל בתהליך של סטנדרטיזציה של assay ומאפשר השוואה קלה וישירה של מחקרים שונים להערכת תפקוד Treg. אם תתקבל, פרוטוקול זה יאפשר השוואה של פונקציה Treg בין מעבדות שונות בנושאים מושפע עם מחלות אוטואימוניות T1D אחרים. פרוטוקול זה כולל יישום רחב והוא יכול לשמש לצורך הערכה של תפקוד Treg של כל נושא, לא משנה של המחלה, אם כי ערך פרוגנוסטי שלה נוגע מחלות רק כי הם תוצאה של ההפרעות של הומאוסטזיס החיסונית.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב או מכשיר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Ficoll Paque-PLUS </td><td> Amersham Pharmacia ביוטק </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי CD4 microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> טרום הפרדה מסננים </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LS עמודה </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD4-APCCy7 (שיבוט RPA-T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD25 אדם-PE (שיבוט M-A251, IL-2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD8-FITC (שיבוט RPA-T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD14-FITC אדם (שיבוט M5E2; קולטן LPS) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD32-FITC אדם (שיבוט FLI8.26; FcγR-type II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD116-FITC (שיבוט M5D12: GM-CSFRα שרשרת) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 אדם </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> תוצרת בית </td><td></td><td> 0.1M Na 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> תוצרת בית </td><td></td><td> PBS/2mM BSA EDTA / 0.1% pH7.4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> תוצרת בית </td><td></td><td> 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 </td></tr><tr><td> השלם RPMI התקשורת </td><td> תוצרת בית </td><td></td><td> RPMI 1640 התקשורת 2-L-גלוטמין mM 5 מ&quot;מ HEPES 100 U / מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​peni / strept 0.5 נתרן pyruvate mM </td></tr><tr><td> [3 ח] thymidine </td><td> פרקין אלמר </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> אדם ונקווה א.ב. בסרום </td><td> אטלנטה הביולוגיים </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> קציר Multiscreen צלחת </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> פרקין אלמר </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

human in vitro suppression as screening tool for the recognition of an early state of immune imbalance

תקינה בתאי T (Tregs) הם מתווכים קריטית של סובלנות החיסונית העצמית אנטיגנים. בנוסף, הם הרגולטורים חיוני של התגובה החיסונית בעקבות זיהום. למרות המאמצים כדי לזהות סמן משטח ייחודי על Tregs, התכונה הייחודית רק הוא יכולתם לדכא את שגשוג ותפקוד של תאים T מפעיל. בעוד שברור כי רק מבחני חוץ גופית ניתן להשתמש בהערכת תפקוד Treg אדם, זה הופך להיות בעייתי כאשר להערכת תוצאות חתך מחקרים שבהם תאים בריאים ותאים שבודדו נבדקים עם מחלות אוטואימוניות (כמו סוכרת מסוג 1-T1D) צורך כדי להשוות. קיימת שונות רבה בין מעבדות במספר וסוג של תאים המגיב T, טבע וכוח של גירוי, Treg: יחסי המגיב לבין מספר וסוג אנטיגן הצגת תאים (APC) בשימוש האדם מבחני חוץ גופית דיכוי. השתנות זו הופכת את ההשוואה בין המחקרים מדידת תפקוד Treg קשה. השדה Treg צריך assay דיכוי סטנדרטית זה יעבוד גם עם שני אנשים בריאים ואנשים עם מחלות אוטואימוניות. פיתחנו ב assay דיכוי במבחנה שמראה מעט מאוד התוך assay משונות גירוי של תאים T מבודד במתנדבים בריאים לעומת נבדקים עם הבסיס הרס אוטואימונית של הלבלב β-תאים. המטרה העיקרית של היצירה הזאת היא לתאר ב assay דיכוי במבחנה אנושי המאפשר השוואה בין קבוצות נושא שונות. בנוסף, assay הזה יש פוטנציאל להתוות הפסד קטן nTreg לתפקד צופים הפסד נוסף בעתיד, ובכך נושאים בזיהוי מי יכול להפיק תועלת מטיפול מניעתי המערכת החיסונית 1. להלן, אנו מספקים תיאור מעמיק של השלבים הכרוכים בהליך זה. אנו מקווים לתרום סטנדרטיזציה של ב assay דיכוי חוץ גופית המשמשת למדידת תפקוד Treg. בנוסף, אנו מציעים זה assay ככלי לזהות מצב של חוסר איזון מוקדם החיסונית סמן פונקציונלי פוטנציאל T1D.

Watch this Scientific Journal Video about Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance at JoVE.com

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs הם מדכאי עוצמה של מערכת החיסון. קיים מחסור של סמנים משטח ייחודי להגדיר אותם, ולכן, הגדרות של Tregs הם פונקציונליים בעיקר. כאן אנו מתארים אופטימיזציה<em&gt; במבחנה</em&gt; מסוגלים לזהות חוסר איזון החיסונית בנושאים בסיכון לפתח T1D assay.

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

human-vitro-suppression-as-screening-tool-for-recognition-an-early

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

14.4K Views.  Medical College of Wisconsin. Tregs הם מדכאי עוצמה של מערכת החיסון. קיים מחסור של סמנים משטח ייחודי להגדיר אותם, ולכן, הגדרות של Tregs הם פונקציונליים בעיקר. כאן אנו מתארים אופטימיזציה במבחנה מסוגלים לזהות חוסר איזון החיסונית בנושאים בסיכון לפתח T1D assay.

Video: Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

חוקר את ההשפעות של פרוביוטיקה על דלקת ריאות התיישבות שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay דבקות

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

דיכוי מערכת החיסון קביעת לעומת להגנת CNS להתערבויות פרמקולוגיים demyelination אוטואימוניות

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...